专利名称：用于鉴定短小乳杆菌的引物序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及用于鉴定短小乳杆菌的引物序列及其应用。
背景技术：
短小乳杆菌(Lactobacillus brevis)是乳杆菌属的重要菌种之一，其来源广泛， 在泡菜、鲜奶、动物肠道中均有发现。短小乳杆菌具有产Y氨基丁酸、共轭亚油酸、苹果酸、 干扰素等多种功能产物的特性，在食品和医药生产中具有广阔的应用前景。目前国内分离 鉴定短小乳杆菌多采用的平皿培养法、生化试验、气体生长试验等传统检验方法，上述方法 存在检出周期长、自动化程度低、准确性差等缺点。
发明内容
本发明提供了用于鉴定短小乳杆菌的引物序列，该引物能够特异性扩增短小乳杆 菌16S rDNA的部分序列，扩增特异性高，能够准确、快速鉴定短小乳杆菌。该引物用于鉴定 短小乳杆菌过程简单，鉴定方法稳定、高效，不仅缩短了检测时间，而且检测成本低。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供了用于鉴定短小乳杆菌的引物序列，其特征在于正向引物具有序列 表中SEQ ID NO :1所述的碱基序列，反向引物具有序列表中SEQ IDNO :2所述的碱基序列。本发明的引物序列可用于鉴定短小乳杆菌，其鉴定过程如下(1)制备待测菌株 的模板DNA ；(2)使用权1所述的引物对步骤(1)制备的模板DNA进行PCR扩增；(3)利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在200bp处产生特异性扩增条带的菌株， 则鉴定为短小乳杆菌。其中，制备待测菌株的模板DNA过程如下挑取短小乳杆菌的单菌落至50-100微 升的超纯水中，置于沸水中水浴5-15分钟，于-80°C冻存15-40分钟，至沸水中水浴5_15分 钟，4000-8000转/分钟离心5-10分钟，取上清即得模板DNA。其中，PCR扩增程序如下95°C预变性5min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸 20s，进行30次循环，最后72°C延伸IOmin。本发明电泳检测PCR产物采用的为2%的琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭染色，最 后在凝胶成像仪中拍照。其中，本发明模板DNA提取中涉及的短小乳杆菌仅为实验材料，本发明不限定特 定短小乳杆菌菌株，可为现在国内外公开或可购买的任何一株短小乳杆菌，也可为任意的 自行分离材料，本发明所用短小乳杆菌购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编 号为CICC6239，无论任何一株短小乳杆菌均不影响本发明的实施；实施例4电泳中用的干 酪乳杆菌，约氏乳杆菌，德氏乳杆菌，罗氏乳杆菌，植物乳杆菌，唾液乳杆菌，弯曲乳杆菌，瑞 士乳杆菌等菌株均为对照菌株实验材料，不须限定为某株菌株，可根据需要或可得到的实验材料选定，对本发明的实施无影响。与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点本发明的用于鉴定短小乳杆 菌的引物序列能够特异性扩增短小乳杆菌16S rDNA的部分序列，扩增特异性高，能够准确、 快速鉴定短小乳杆菌。该引物用于鉴定短小乳杆菌过程快速简单，鉴定方法稳定、高效，不 仅缩短了检测时间，而且检测成本低(见表1)。本发明为短小乳杆菌种质资源鉴定提供了 检测方法，进而为筛选短小乳杆菌的优良菌株奠定了基础。表1现有技术与本发明鉴定过程比较
鉴定时间鉴定成本现有技术方法一周左右约25元本发明方法约2小时约3元
图1为本发明引物序列在16S rDNA基因上的位置图谱；图2为PCR特异性扩增中各菌株扩增产物的凝胶电泳图谱。图2中，M为核酸分子量标准；1短小乳杆菌，2干酪乳杆菌，3约氏乳杆菌，4德氏 乳杆菌，5罗氏乳杆菌，6植物乳杆菌，7唾液乳杆菌，8弯曲乳杆菌，9瑞士乳杆菌，CK水对照通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本 发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
具体实施例方式实施例1步骤1引物的设计与合成在Genebank数据库中获取短小乳杆菌及与其具有同源性的乳酸杆菌16SrDNA序 列，查找短小乳杆菌种内保守而其余乳杆菌不保守的特异性区域，设计引物并对特异性序 列进行筛选和优化，最终得到了一对参数较优的引物LABBF和LABBR，并合成上述二引物。上述引物的具体序列与序列表中对应关系如下表2所示表权利要求
1.用于鉴定短小乳杆菌的引物序列，其特征在于正向引物具有序列表中SEQIDNO 1 所述的碱基序列，反向引物具有序列表中SEQ ID NO :2所述的碱基序列。
2.如权1所述的引物序列在鉴定短小乳杆菌中的应用，其特征在于鉴定过程如下(1) 制备待测菌株的模板DNA;(2)使用权1所述的引物对步骤(1)制备的模板DNA进行PCR扩增；(3)利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在200bp处产生特异性扩增条带的菌株，则鉴 定为短小乳杆菌。
3.如权2所述的引物序列在鉴定短小乳杆菌中的应用，其特征在于制备待测菌株的 模板DNA过程如下挑取短小乳杆菌的单菌落至50-100微升的超纯水中，置于沸水中水浴 5-15分钟，于-80°C冻存15-40分钟，至沸水中水浴5-15分钟，4000-8000转/分钟离心 5-10分钟，取上清即得模板DNA。
4.如权2所述的引物序列在鉴定短小乳杆菌中的应用，其特征在于PCR扩增程序如下 95°C预变性5min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸20s，进行30次循环，最后72°C延 伸 IOmin0
5.如权2所述的引物序列在鉴定短小乳杆菌中的应用，其特征在于电泳检测PCR产物 采用的为2%的琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭染色。
全文摘要
本发明公开了一种用于鉴定短小乳杆菌的引物序列及其应用，属于分子生物学领域。本发明引物的碱基序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示。本发明的引物序列可用于鉴定短小乳杆菌，该引物能够特异性扩增短小乳杆菌16SrDNA的部分序列，扩增特异性高，能够准确、快速鉴定短小乳杆菌。该引物用于鉴定短小乳杆菌过程简单，鉴定方法稳定、高效，不仅缩短了检测时间，而且检测成本低。本发明为短小乳杆菌种质资源鉴定提供了检测方法，为筛选短小乳杆菌的优良菌株奠定了良好的基础。
文档编号C12Q1/68GK102094089SQ201010574429
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月6日 优先权日2010年12月6日
发明者张军, 张广民, 王安如, 田子罡, 闫秩洁 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司