专利名称：高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，涉及微生物菌种的筛选，尤其是一种高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法。
背景技术：
大规模畜禽养殖产生的大量畜禽场废弃物，其中羽毛废弃物最多，其产量巨大，全球每年可达几百万吨。禽类羽毛主要由角蛋白组成，角蛋白是一种具有极强抗性、难降解的硬性蛋白，具有很高的结构稳定性，其强度与尼龙相当，角蛋白在一般条件下不溶解，且不能被胃蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白酶降解，具有能抵抗特异性蛋白酶活性的长聚合链。羽毛通过生物转化可获得羽毛粉，羽毛粉可以替代豆粕、鱼粉添加到饲料中去，是一种新型优质的蛋白源，各国都开展了利用羽毛作饲料的研究，对利用羽毛粉的研究和应用从20世纪70年代就已经开始，并取得一定进展，例如美国，已经进行了 50多年研究开发，并可应用于产业，目前羽毛粉年产量37万吨。我国羽毛资源非常丰富，是羽毛产量第一大国，目前羽毛年产60多万吨，数量十分庞大，家禽中羽毛成分占5% _7%，但其中大部分被用来生产羽绒制品，下脚料羽梗经过简单的加工后制成羽毛粉添加到饲料中，以提高饲料粗蛋白的含量，从中看出羽毛粉产量很低，绝大部分羽毛没有得到充分利用，这既浪费资源又污染环境，若能够将这些废弃羽毛合理利用，可变废为宝，提供大量蛋白饲料资源。传统的处理羽毛的方法主要是物理高温高压法和化学酸碱法，与常规物理和化学加工方法相比，微生物角蛋白酶降解法有两个突优点，一是水解以及干燥温度较低，节省能源并减少了蛋白质变性与氨基酸的损失；二是提高了羽毛粉中氨基酸的消化率，增加了可消化氨基酸，改善了必需氨基酸的平衡性，降低了氮排除量，减少了氮污染，保护环境，因此微生物角蛋白酶降解法使羽毛粉的营养价值显著提高，所获得的经济收益显然要比常规方法加工的羽毛粉高的多。角蛋白酶(keratinase)是具有降解角蛋白活性的一类酶的总称，角蛋白酶属于诱导型酶，需要外源诱导物诱导而生，具有专一降解天然角蛋白的功能，目前普遍认为微生物降解角蛋白的过程可分为变性作用、水解作用和转氨基作用3个步骤，不同微生物降解方式存在差异，而蛋白质的变性是关键步骤，伴随着二硫键的断裂、含硫化合物的逐步氧化，角蛋白在蛋白酶作用下逐渐水解为氨基酸，降解机理还需进一步探讨。角蛋白酶除了应用于降解羽毛生产饲料外，还具有广泛的用途，可用作毛发和胶原蛋白等物质的降解，具有高效的脱毛性；角蛋白酶可用于制备有机肥料，增进植物增长；角蛋白酶可以制成皮肤真菌病疫苗，去痤疮、粉刺、牛皮癣，也可以出去结痂；角蛋白酶能够破坏阮病毒，使其丧失传染能力，在肉骨粉中添加角蛋白酶，可以确保饲料安全性；角蛋白酶还应用于食品加工，清洁剂生产，皮革脱毛鞣制，浴皂、洗发膏、润肤露、防晒油和脱毛膏等美容产品等。通过生物途径来解决角蛋白降解的问题一直以来都倍受世界关注，早在十九世纪初期，就发现了一些生物能分解角蛋白，如衣蛾、苍蝇和兀鹰以及一些放线菌，后来又发现一些细菌、真菌也能在含有角蛋白的基质上生长繁殖，1963年Nickers0n等首次提出将具有降解角蛋白活性的酶称为角蛋白酶(Keratinase)，迄今已分离到30余种能降解角蛋白微生物，分别属于细菌、放线菌和真菌属，近十年来，随着分子生物学技术的发展，角蛋白酶再次成为研究的热点，并取得了显著的进展。目前国内对微生物降解角蛋白的研究主要集中在菌种分离和酶的提取纯化，虽然取得了一定的进展，但是均不能实现工业化生产，不能满足工业上对其降解的需要，大部分微生物降解羽毛尚需要一定的前处理，因此需要进一步分离优良的羽毛角蛋白降解菌株。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法，本发明筛选得到菌株降解羽毛角蛋白效果好且发酵得到的角蛋白酶活高，能满足工业需要。本发明是通过以下技术方案实现的一种高效降解羽毛角蛋白的菌株，经16SrDNA序列分析鉴定结果和Biolog系统鉴定结果，确定F4为地衣芽孢杆菌，命名为Bacillus licheniformis F4，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所保藏日期为2010年10月19日保藏编号为CGMCC NO. 42四。一种高效降解羽毛角蛋白的菌株的筛选方法，其特征在于，步骤如下(1)初步筛选将鸡粪样品溶解于的蒸馏水中，稀释后涂布于初筛培养基，分别在30_60°C条件下培养20-30h，筛选长有菌落的平板，30-60°C培养条件下，取菌体生长较快，菌落较大的菌落；⑵富集培养在无菌条件下，用无菌水冲洗步骤(1)温度下的初筛培养基上的菌落，接入富集培养基，在步骤(1)温度下，100-150rpm/min条件下富集培养40_60h ；(3)分离培养将40_60h富集培养后的菌液稀释后，涂布于LA平板在步骤(1)温度下培养 20-30h，挑取了不同形态单菌落LA平板划线保存；(4)复筛经分离纯化后的单菌落接种到含有筛选培养基的摇瓶发酵，观察培养液中完整羽毛的降解程度，将振荡培养的发酵液过滤，测定角蛋白酶活和甲醛滴定法测定滤液内氨基氮含量，发酵培养阳_7证后，完全脱去了羽毛中的小羽枝，且羽梗和羽枝被完全被降解；所述初筛培养基(g/ml)的成分为2%羽毛粉、2%琼脂粉，其余为水；富集培养基(g/ml) 羽毛粉、蛋白胨、0. 5%酵母浸出粉、NaCl，其余为水；筛选培养基(g/ml)羽毛粉，0. 1% K2HP04, KH2P04 0. 04%, NaCl 0. 04%，灭菌后的完整羽毛，其余为水；LA平板(g/ml) 蛋白胨、0. 5%酵母浸出粉、NaCl、2%琼脂，其余为水。本发明的优点和积极效果是1、本发明在筛选Bacillus licheniformis F4菌株以碳源和氮源作为初步筛选条件，以降解完整羽毛和角蛋白酶活测定作为复筛条件，经这两步骤条件的严格限制筛选获得高效降解羽毛角蛋白菌株，将菌株接入含有完整羽毛的发酵培养中。2、本发明中的Bacillus licheniformis F4菌株在50°C，pH7. 8条件下测定发酵液的角蛋白酶活为23U/mL，氨基氮增加量为0. 7090mg/mL，本优良羽毛角蛋白降解菌为角蛋白酶的生产及应用于工业生产奠定了基础。3、本发明筛选的F4菌株是一种快速、直接利用天然羽毛的微生物菌株，不仅能以羽毛角蛋白作为唯一碳源和氮源，还能够降解完整的天然羽毛，仅发酵Mh即可见完整羽毛的羽枝有明显脱落，发酵60h后羽枝完全脱落，羽枝和羽梗大部分被降解，菌株脱毛及降解羽毛角蛋白效果明显。
图1为本发明菌株Bacilluslicheniformis F4的菌落形态图；图2为本发明菌株Bacilluslicheniformis F4的革兰氏染色电子显微镜图；图3为本发明菌株Bacilluslicheniformis F4的Biolog鉴定结果图。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本筛选方法的主要步骤为菌株是以鸡粪作为筛选来源，经过以羽毛角蛋白作为唯一碳源和氮源的初步筛选条件，以降解完整羽毛和角蛋白酶活测定作为复筛条件筛选获得，该菌株具有发酵培养60h能够将完整羽毛降解掉的特征，该菌株经过16srDNA序列分析方法和Biolog系统鉴定是地衣芽孢杆菌，命名为Bacillus licheniformis F4。一种高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法，步骤如下1、实验说明(1)筛选样品来源于天津养鸡场，实验用羽毛来源于天津大成屠宰场。(2)羽毛预处理培养基用羽毛粉用洗涤剂将羽毛清洗干净，蒸煮一个小时后，清水冲洗。在60°C 烘箱中放置烘干，用万能粉碎机连续粉碎三次，每次持续时间为五分钟。测定角蛋白酶活的羽毛粉用洗涤剂将羽毛清洗干净，去离子水冲洗，在含有 0. 2% NaOH的去离子水中煮30分钟，去离子水冲洗羽毛至中性，在60°C烘箱中放置烘干，用万能粉碎机连续粉碎三次，每次持续时间为五分钟，过20目筛子，取筛下部分作为酶活测定的底物。完整羽毛洗涤剂将羽毛清洗干净，清水冲洗。在60°C烘箱中烘干，121°C灭菌20 分钟。(3)培养基组成初筛培养基(g/ml) 羽毛粉、2%琼脂粉。富集培养基(g/ml) 羽毛粉、蛋白胨、0. 5%酵母浸出粉、NaCl。筛选培养基(g/ml)羽毛粉，0. 1% K2HP04, KH2P04 0. 04%, NaCl 0. 04%，灭菌后的完整羽毛。
LA平板(g/ml) 蛋白胨、0. 5%酵母浸出粉、NaCl、2%琼脂。(4)羽毛角蛋白酶活力测定取发酵液过滤离心后的上清液lmL，加入2mL 50mM Tris-HCI (pH7. 8)，然后加入 IOmg羽毛粉底物，混勻；置于50°C水浴保温反应Ih (不断振摇)，而后加入2mL TCA(三氯乙酸)终止反应，沉降30min后离心取上清，于280nm处比色测定OD值，以先加入TCA终止液作为对照。酶活力单位定义50°C水浴保温反应Ih反应条件下，OD值每增加0. 01为lu，重复 3次，取平均值。(5)甲醛滴定法测定氨基氮含量发酵液过滤离心，取上清液稀释十倍，取2mL的稀释上清液于25mL三角瓶中，加入 5mL去离子水，滴入五滴酚酞试剂，加入2mL甲醛溶液，用0. 02mol/L的NaOH滴定至微红。 以去离子水代替上清液作为空白对照。
权利要求
1.一种高效降解羽毛角蛋白的菌株，其特征在于经IesrDNA序列分析鉴定结果和 Biolog系统鉴定结果，确定F4为地衣芽孢杆菌，命名为Bacillus licheniformis F4，保藏于中国微生物菌种保藏中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所保藏日期为2010年10月22日保藏编号为CGMCC NO. 42四。
2.一种高效降解羽毛角蛋白的菌株的筛选方法，其特征在于，步骤如下(1)初步筛选将鸡粪样品溶解于的蒸馏水中，稀释后涂布于初筛培养基，分别在30-60°C条件下培养 20-30h,筛选长有菌落的平板，30-60°C培养条件下，取菌体生长较快，菌落较大的菌落；(2)富集培养在无菌条件下，用无菌水冲洗步骤(1)温度下的初筛培养基上的菌落，接入富集培养基，在步骤(1)温度下，100-150rpm/min条件下富集培养40_60h ；(3)分离培养将40-60h富集培养后的菌液稀释后，涂布于LA平板在步骤(1)温度下培养20-30h，挑取了不同形态单菌落LA平板划线保存；(4)复筛经分离纯化后的单菌落接种到含有筛选培养基的摇瓶发酵，观察培养液中完整羽毛的降解程度，将振荡培养的发酵液过滤，测定角蛋白酶活和甲醛滴定法测定滤液内氨基氮含量，发酵培养阳_7证后，完全脱去了羽毛中的小羽枝，且羽梗和羽枝被完全被降解；所述初筛培养基(g/ml)的成分为2%羽毛粉、2%琼脂粉，其余为水；富集培养基(g/ml) 羽毛粉、蛋白胨、0. 5%酵母浸出粉、NaCl，其余为水；筛选培养基(g/ml) 羽毛粉，0. 1% K2HP04, KH2P04 0. 04%, NaCl 0.04%，灭菌后的完整羽毛，其余为水；LA平板(g/ml) 蛋白胨、0. 5%酵母浸出粉、NaCl、2%琼脂，其余为水。
全文摘要
本发明涉及高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法，经16SrDNA序列分析鉴定结果和Biolog系统鉴定结果，确定F4为地衣芽孢杆菌，命名为Bacillus licheniformis F4，保藏于中国微生物菌种保藏中心保藏日期为2010年10月22日保藏编号为CGMCC NO.4229，其筛选方法为经过初筛、分离、富集、复筛后的到高效降解羽毛角蛋白菌株。本发明在筛选Bacillus licheniformis F4菌株以碳源和氮源作为初步筛选条件，以降解完整羽毛和角蛋白酶活测定作为复筛条件，经这两步骤条件的严格限制筛选获得高效降解羽毛角蛋白菌株。将菌株接入含有完整羽毛的发酵培养中，发酵培养60h，羽毛的小羽枝全部脱去，剩余的羽梗和脱去的羽枝大部分被降解，菌株脱毛及降解羽毛角蛋白效果明显。
文档编号C12R1/10GK102154144SQ20101057464
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月6日 优先权日2010年12月6日
发明者宋馨宇, 李玉, 李金婷, 王春霞, 秦磊, 路福平 申请人:天津科技大学