专利名称：包含泛素或泛素样蛋白、膜易位序列和生物活性分子的融合蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本公开涉及包含泛素或泛素样蛋白、与所述泛素或泛素样蛋白的C-末端连接的 膜易位序列、和与所述膜易位序列的C-末端连接的生物活性分子的跨膜融合蛋白，编码所 述跨膜融合蛋白的多核苷酸，包含所述多核苷酸序列的重组表达载体，由所述重组表达载 体转化的细胞，和使用所述跨膜融合蛋白将所述生物活性分子递送至细胞中的方法。
背景技术：
由于报道了多种疾病是由细胞中蛋白质的异常活性所导致的，所以已经尝试开发 通过调节蛋白质的异常活性来治疗疾病的药物。具体而言，已基于可特异性调节生物活性 的酶-蛋白质或蛋白质-蛋白质相互作用对肽、多肽和蛋白质药物进行了研究。即使肽、多 肽和蛋白质具有卓越的生物学选择性和效果，它们由于其大小和多种生化性质也难以穿透 细胞膜。由于肽、多肽和蛋白质无法直接递送至细胞中，因此它们作为有效药物的实际使用 具有局限性。已进行了多种尝试将肽、多肽或蛋白质递送至细胞中。最近，已使用跨膜肽将肽、 多肽或蛋白质递送至细胞中。自从在1988年报道了在与培养基一起使用时HIV-I的Tat 蛋白主动转运至细胞中以来，已对蛋白质的细胞穿透机制进行了研究。从那时起，已对穿透 细胞膜的多种肽，例如，果蝇的Antp蛋白中存在的信号序列(跨膜序列)或胞质穿透序列、 单纯疱疹病毒(HSV)的VP22蛋白、和成纤维细胞生长因子(FGF)进行了各种研究。根据最近的研究，膜易位序列(MTQ直接穿透细胞膜而不用受体/转运体，然而其 它细胞穿透肽(CPP)需要使用受体/转运体来递送。因此，MTS不依赖于受体/转运体的 表达。另外，由于MTS独立于胞吞作用地转移，MTS更有效地转移至细胞中。MTS可在细胞 间迁移，尽管其它CPP无法以相同的方式迁移。由于这些特征，膜易位序列正在吸引大量的 关注。然而，因为它的疏水性，难以在动物试验中应用MTS。例如，如果在重组细胞中表达 包含MTS的融合蛋白，那么所述包含MTS的融合蛋白作为具有差的稳定性的异源形式的包 含体获得。此外，难以从所述包含体得到活性融合蛋白。因此，仍然需要开发稳定转移至细胞中的包含MTS的融合蛋白。
发明内容
提供包含泛素或泛素样蛋白、与所述泛素或泛素样蛋白的C-末端连接的膜易位 序列、和与所述膜易位序列的C-末端连接的生物活性分子的跨膜融合蛋白，编码所述跨膜 融合蛋白的多核苷酸，包含所述多核苷酸序列的重组表达载体，由所述重组表达载体转化 的细胞，和使用所述跨膜融合蛋白将所述生物活性分子递送至细胞中的方法。在实施方案中，使用所述跨膜融合蛋白将所述生物活性分子递送至细胞中的方法 包括将所述跨膜融合蛋白与细胞接触。
还公开了产生所述跨膜融合蛋白的方法。在实施方案中，所述方法包括在容许所 述跨膜融合蛋白表达的条件下培养由编码所述跨膜融合蛋白的多核苷酸转化的宿主细胞； 和从宿主细胞培养物回收所述跨膜融合蛋白。另外的方面将在以下的说明书中部分地阐述，从所述说明书中部分地明晰，或者 可以通过所示实施方案的实践而知悉。
从结合附图考虑的实施方案的以下描述，这些方面和/或其它方面将变得明晰且 更易于理解，在附图中图1是说明根据本发明实施方案的融合蛋白转移至细胞中和/或细胞核中的示意 图；图2A至图2C显示的是显现在小鼠细胞中本发明实施方案的融合蛋白或对照的体 内分布的荧光显微图像，所述小鼠细胞是在将所述融合蛋白或对照腹膜内注射至小鼠中之 后分离的；和图3是显示肿瘤体积作为根据本发明实施方案的融合蛋白或对照融合蛋白中所 含p53-pl8的注射时间的函数的图。
具体实施例方式现将详细提及实施方案，其实例在附图中说明，其中相同的附图标记始终表示相 同的要素。在这点上，当前的实施方案可具有不同的形式，并且不应理解为局限于本文所作 的描述。因此，以下仅通过参照附图描述实施方案以解释本说明书的各方面。根据本发明的实施方案，跨膜融合蛋白包含泛素或泛素样蛋白；与所述泛素或 泛素样蛋白的C-末端连接的膜易位序列；和与所述膜易位序列的C-末端连接的生物活性 分子。本文使用的术语“跨膜融合蛋白”指具有在体外和/或体内将生物活性分子递送 到细胞或细胞核中的能力的融合蛋白。此外，“膜易位序列(MTS) ”是具有可穿透细胞膜的磷 脂双层的氨基酸序列的多肽。MTS在N-末端具有单一疏水区，并且由相对少的氨基酸(7-17 个氨基酸)以柔性螺旋结构形成。由此，MTS具有疏水性。如本文所用的术语“连接”意指两个或更多个生物分子连接，使得至少保留与所述 生物分子有关的生物学功能、活性和/或结构的一些。对于多肽，该术语意指两个或更多个 多肽的连接产生融合多肽，该融合多肽至少保留每个多肽成分各自单独的活性的一些。所 述两个或更多个多肽可直接连接或藉由接头连接。泛素( )是存在于所有真核细胞中的高度保守的蛋白质，其包括76个氨基酸。泛 素在如昆虫、鳟鱼和人一样不同的物种之间显示出完美的同源性。另外，泛素相对于PH变 化是稳定的，在高温下不易变性，并且相对于蛋白酶是稳定的。因此，如果将泛素与MTS融 合，那么可以降低MTS的水不溶性。泛素样蛋白(WdL)是具有类似于泛素的性质的蛋白质。泛素样蛋白的实例包括 Ne dd8、SUMO-1、SUM0-2、NUB1、PIC1、UBL3、UBL5 禾Π ISG15。所述跨膜融合蛋白中的泛素或泛素样蛋白可选自野生型泛素、野生型泛素样蛋白、突变体泛素和突变体泛素样蛋白。突变体泛素通过将野生型泛素的氨基酸序列改变成 另一氨基酸序列来获得。例如，突变体泛素可通过用Arg替代野生型泛素的Lys或通过用 RGA残基替代野生型泛素的C-末端的RGG残基来制备。在通过用Arg替代野生型泛素的 Lys制备的突变体泛素中，存在于第6、第11、第27、第四、第33、第48和第63氨基酸位置 的Lys可以独立地或以任意组合用Arg替代。所述跨膜融合蛋白中的泛素或泛素样蛋白在C-末端具有可或不可由蛋白酶切割 的氨基酸序列。由蛋白酶切割的氨基酸序列可通过检索本领域已知的数据库来鉴定。例 如,在互联网上可从Swiss Institute of Bioinformatics的ExPASy (专业蛋白质分析系 统)蛋白质组学服务器获得的工具P印tideCutter可以用于鉴定蛋白酶和由该蛋白酶切割 的氨基酸序列。在一些实施方案中，如果由蛋白酶识别的氨基酸序列包含在泛素或泛素样蛋白 中，那么跨膜融合蛋白中的泛素或泛素样蛋白在所述融合蛋白转移至细胞中之后可由所述 细胞中存在的蛋白酶切割，使得证或^^从该融合蛋白中释放且生物活性分子可执行合乎 需要的功能。即使跨膜融合蛋白中的生物活性分子在通过蛋白水解切割去除泛素或泛素样 蛋白之后仍然包括MTS，MTS也不影响生物活性分子的功能，因为MTS的多肽序列短。在一 些实施方案中，即使在不通过细胞蛋白酶从跨膜融合蛋白切下泛素或泛素样蛋白时，生物 活性分子也可执行合乎需要的功能。跨膜融合蛋白中的MTS可为任何具有可穿过细胞膜的磷脂双层的氨基酸序列的 多肽，没有限制。例如，MTS可为具有选自SEQ ID NOS 1至15的序列的多肽。跨膜融合蛋白中的“生物活性分子”是以进入细胞内为目标的具有所需生物活性 的多肽或蛋白质，其可与MTS连接并转移至细胞中。跨膜融合蛋白中的生物活性分子是长度为至少两个氨基酸的肽或蛋白质。所述多 肽可以是与细胞永生有关的蛋白质如SV40大T抗原和端粒酶；抗凋亡蛋白如突变体p53和 BclxL ；抗体；癌基因产物如ras、myc、人乳头瘤病毒E6/E7和腺病毒Ela ；细胞周期调节蛋 白如细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶；绿色荧光蛋白；或酶如β-半乳糖苷酶和 氯霉素乙酰转移酶，但不限于此。跨膜融合蛋白中包含的生物活性分子可为亲水蛋白，但不限于此。另外，生物活性 分子可为激素、激素样蛋白、酶、酶抑制剂、信号转导蛋白或其部分、抗体或其部分、单链抗 体、结合蛋白或其结合域、抗原、粘着蛋白、结构蛋白、调节蛋白、毒蛋白、细胞因子、转录因 子、凝血因子、疫苗等，但不限于此。例如，跨膜融合蛋白中包含的生物活性分子可为ρ53、ρ18、ρ53_ρ18、ρ21、ρ25、 ρ57、ρ16、ρ15、ΝΙΡ71、神经调节素1、PTEN肿瘤抑制剂、ARF肿瘤抑制剂、APC、CD95、雌酮、 MENU BRCAU Von Hippel-Lindau肿瘤抑制剂、RKIP、nm23、内皮抑制素、胰岛素、胰岛素样 生长因子1 (IGF-I)、生长因子、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/ 巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-Y、白介素-Ia和β、 白介素_3、白介素_4、白介素-6、白介素-2、表皮生长因子(EGF)、降钙素、促肾上腺皮质 激素(ACTH)、肿瘤坏死因子(TNF)、阿托西班、布舍瑞林、西曲瑞克、地洛瑞林、去氨加压素、 强啡肽A(l-13)、依降钙素、依来多辛、依替巴肽、生长激素释放激素-II (GHRH-II)、戈那瑞 林、戈舍瑞林、组氨瑞林、亮丙瑞林、赖氨加压素、奥曲肽、催产素、加压素、胰泌素、辛卡利特、特利加压素、胸腺喷丁、胸腺素α 1、曲普瑞林、比伐卢定、卡贝缩宫素、环孢素、艾可西定 (exedine)、兰瑞肽、黄体生成素释放激素(LHRH)、那法瑞林、甲状旁腺激素、普兰林肽、恩夫 韦地(T-20)、胸腺法新或齐考诺肽，但不限于此。当生物活性分子需要递送至细胞核中时，跨膜融合蛋白可进一步包含核定位信号 域。“核定位信号域(NLS) ”是能够穿过细胞的核膜的氨基酸序列，其包含在从胞质向 细胞核转运的蛋白质中。在此，氨基酸序列不受限制，只要该序列具有NLS功能。可用作 NLS 的多肽可为 KKKRK(SEQ ID NO 26)、PKKKRKV(SEQ ID NO 27)、KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:28)等，但不限于此。NLS可位于跨膜融合蛋白的选自如下的至少一个区域中泛素或泛素样蛋白的 C-末端、MTS的C-末端、和生物活性分子的C-末端。“分离的”当用于描述本文公开的各种多肽或多核苷酸时意指已经自其天然环境 的成分鉴定并分离和/或回收的多肽或多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和多肽以及 化学合成的多核苷酸和多肽。根据本发明的实施方案，提供用于将生物活性分子递送至细胞的组合物。所述组 合物包含本文公开的跨膜融合蛋白；和可药用载体。所述跨膜融合蛋白可以使得生物活性 分子以治疗有效量递送的量存在于所述组合物中。根据本发明的实施方案，提供编码跨膜融合蛋白的多核苷酸，所述跨膜融合蛋白 包含泛素或泛素样蛋白；与所述泛素或泛素样蛋白的C-末端连接的MTS ；和与所述MTS的 C-末端连接的生物活性分子。如本文所用的“多核苷酸”是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物。多核苷酸 可为单链或双链核酸。多核苷酸包括RNA基因组序列、cDNA序列、从cDNA转录的RNA序列、 和天然多核苷酸的类似物，除非在本文另外指明。多核苷酸不仅包括编码跨膜融合蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列，还包括其互补 序列。互补序列可为与所述核苷酸序列完美互补的序列或基本上互补的序列。即，互补序 列可为在本领域已知的严紧条件下与例如编码跨膜融合蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列 杂交的序列。具体而言，严紧条件意指，例如，在6XSSC中在约45°C与DNA杂交，随后在 0. 2XSSC/0. 1% SDS中在约50°C -65°C洗涤一次或多次。编码在跨膜融合蛋白中包含的泛素或泛素样蛋白的核苷酸序列可源自哺乳动物， 例如人。另外，编码泛素或泛素样蛋白的核苷酸序列可通过检索已知的核苷酸序列数据库， 例如，National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)Entrez数据库或European Molecular BiologyLaboratory-European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI)数据库 来获得。根据本发明的另一实施方案，重组载体包含编码跨膜融合蛋白的多核苷酸和与所 述多核苷酸序列可操作地连接的启动子，所述跨膜融合蛋白包含泛素或泛素样蛋白；与 所述泛素或泛素样蛋白的C-末端连接的MTS ；和与所述MTS的C-末端连接的生物活性分 子。本文使用的术语“可操作地连接”指核苷酸表达调控序列(例如，启动子序列)与 另一核苷酸序列的功能性结合，并且所述核苷酸表达调控序列由此可调控所述另一核苷酸序列的转录和/或翻译。重组载体可为在宿主细胞中稳定地表达跨膜融合蛋白的表达载体。所述表达载体 可为用于在植物、动物或微生物中表达外源蛋白的本领域已知的载体。重组载体可以使用 本领域已知的各种方法形成。可构建重组载体供在原核或真核宿主细胞中使用。例如，如果载体是供在原核宿 主细胞中使用的表达载体，那么该载体可包含能够使转录起始的启动子，如p/启动子、trp 启动子、Iac启动子、tac启动子和T7启动子；使翻译起始的核糖体结合位点；和转录/翻 译终止序列。当使用真核细胞作为宿主细胞时，载体可含有操作真核细胞的复制起点，例 如，fl复制起点、SV40复制起点、pMBl复制起点、腺复制起点、AAV复制起点和BBV复制起 点，但不限于此。在用于真核宿主细胞的表达载体中使用的启动子可为源自哺乳动物细胞 基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒 分裂后期启动子、痘苗病毒7. 5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子或HSV的tk启动 子)。用于真核宿主细胞的表达载体通常也可包含聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。根据本发明的实施方案，提供包含编码本文公开的跨膜融合蛋白的多核苷酸序列 的宿主细胞。所述宿主细胞可为由重组载体转化的细胞，所述重组载体包含编码所述跨膜 融合蛋白的多核苷酸。宿主细胞可在基因组中包含编码跨膜融合蛋白的多核苷酸，或者可包含含有所述 多核苷酸序列的重组载体，所述跨膜融合蛋白包含泛素或泛素样蛋白；与所述泛素或泛 素样蛋白的C-末端连接的MTS ；和与所述MTS的C-末端连接的生物活性分子。可稳定地且连续地克隆或表达重组载体的宿主细胞可为任何本领域已知的宿 主细胞。原核宿主细胞的实例是大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21、大肠杆菌RR1、大肠杆 菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌X1776、大肠杆菌W3110、芽孢杆菌属菌种如枯草芽孢杆 菌(Bacillus subtillis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的菌株、肠道细 菌禾口如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens) 或多种假单胞菌属O^eudomonas)菌种等菌株。真核宿主细胞的实例是酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞如中华仓鼠卵巢(CHO)、 W138、BHK、C0S-7、293、H印G2、3T3、RIN 和 MDCK 细胞系。所述多核苷酸或包含所述多核苷酸的重组载体可使用本领域已知的递送方法递 送至宿主细胞。递送方法可根据宿主细胞变化。如果宿主细胞是原核细胞，可使用CaCl2S 法或电穿孔方法。如果宿主细胞是真核细胞，可使用显微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体 介导的转染或基因轰击。然而，递送方法不限于此。经转化的宿主细胞可使用由可选择的标记表达的表型和本领域已知的方法来选 择。例如，如果可选择的标记是特定的抗生素抗性基因，那么经转化的宿主细胞可通过将所 述经转化的细胞在含有该抗生素的培养基中培养来辨别。根据本发明的另一实施方案，公开制备跨膜融合蛋白的方法。所述方法包括将包 含编码跨膜融合蛋白的多核苷酸序列的细胞在表达该跨膜融合蛋白的条件下培养，所述跨 膜融合蛋白包含泛素或泛素样蛋白、与所述泛素或泛素样蛋白的C-末端连接的MTS、和与 所述MTS的C-末端连接的生物活性分子；和回收在培养基中表达的跨膜融合蛋白。经转化的细胞的培养可以使用本领域已知的方法进行。例如，可将经转化的细胞接种到YT液体培养基中并培养。当细胞密度达到预定水平时，可向培养基中加入异丙 基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以诱导通过IacZ启动子进行的蛋白质表达。然后，可收 集在细胞内表达的或分泌到培养基中的蛋白质。在细胞内表达的或分泌到培养基中的蛋白质可使用本领域已知的纯化方法分离。 例如，可以使用利用硫酸铵的溶解度分级分离、大小分级和过滤、以及各种层析分离方法 (根据大小、电荷、疏水性或亲水性的分离)以获得分离的蛋白质。例如，如果跨膜融合蛋白 包含谷胱甘肽S转移酶(GST)，可使用谷胱甘肽树脂柱有效地分离所述蛋白质。如果跨膜融 合蛋白包含6x His序列，可使用Ni2+-NTA His-结合树脂柱来获得所需蛋白质。根据本发明的另一实施方案，提供将跨膜融合蛋白递送至细胞中的方法。
所述方法可以包括将跨膜融合蛋白与细胞接触。将跨膜融合蛋白与细胞接触可在体外或体内进行。所接触的细胞可为单独的细 胞、组织中的细胞、器官中的细胞或个体中的细胞。将跨膜融合蛋白与细胞接触可通过使细 胞暴露于溶解在缓冲液中的跨膜融合蛋白在体外直接进行。将跨膜融合蛋白与细胞在体内 接触可包括向受试者施用跨膜融合蛋白。受试者可为哺乳动物，例如人。跨膜融合蛋白的施用可为跨膜融合蛋白的胃肠外 施用至个体。跨膜融合蛋白可为单独的或与可药用赋形剂组合。胃肠外施用可使用静脉内 注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、内胚层注射、局部施用、鼻内施用、肺部施用、直肠 施用等。由于施用的跨膜融合蛋白包含MTS，可将生物活性分子递送至与已使用上述方法施 用的跨膜融合蛋白接触的细胞中。将参考以下实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于说明性目的，而非意 在限制本发明的范围。图1示意性地说明根据本发明实施方案的融合蛋白转移至细胞和/或细胞核中。在示意图中，如果由蛋白酶识别的氨基酸序列包含在泛素或泛素样蛋白100中， 那么在将融合蛋白转移至细胞140中之后，可通过细胞140中存在的蛋白酶切割跨膜融合 蛋白中的泛素或泛素样蛋白酶100，使得泛素或泛素样蛋白100从融合蛋白中释放并且生 物活性分子130可在胞质溶胶中执行合乎需要的功能。或者，如果融合蛋白具有NLS 110， 生物活性分子130可在细胞核150中执行合乎需要的功能。即使跨膜融合蛋白中的生物活 性分子130在通过蛋白水解切割去除泛素或泛素样蛋白100之后仍包括MTS 120,MTS 120 也不影响生物活性分子130的功能，因为MTS 120的多肽序列短。实施例实施例1 制备用于包含泛素、NLS、MTS和p53_pl8的跨膜融合蛋白的表达载体制备用于产生跨膜融合蛋白的表达载体，所述跨膜融合蛋白包含顺序连接的亲水 多肽泛素、NLS、MTS和生物活性多肽p53-pl8。为了产生跨膜融合蛋白，制备pET-NLS-kFGF4-p53表达载体，其包含编码NLS多肽 序列KKKRK(SEQ ID NO 26)的多核苷酸序列、编码已知的MTS序列即kFGF4生长因子的前 导序列(AAVALLPAVLLALLAP ；SEQ IDNO 1)的多核苷酸序列、和编码p53多肽N-末端片段 (mdm2结合域)的多核苷酸序列。所述表达载体如下制备将编码NLS-kFGF4-p53多肽的 寡核苷酸的有义链禾口反义链退火(有义链5' ttgaattcaaaaagaagagaaaggccgcggtagcgct gctcccggcggtcctgctggccttgctggcgcccgaaacattttcagacctatggaaactacttcctgaaaacaagcttaa3 ‘ ；SEQ ID NO :16,反义链5' ttaagcttgttttcaggaagtagtttccataggtctgaaaatgtttc gggcgccagcaaggccagcaggaccgccgggagcagcgctaccgcggcctttctcttctttttgaattcaa3‘ ；SEQ ID N0:17)，然后用限制酶EcoRI和HindIII切割退火产物。将切下的片段插入使用相同限 制酶切割的载体pET22b中。然后，使用聚合酶链式反应(PCR)合成已知的人泛素cDNA序列的多核苷酸和已知 的人pl8(CDKN2C)cDNA序列的多核苷酸。在人泛素多核苷酸片段的PCR合成中，使用5 ‘ t tggatccggtagtggaagcatgcagattttcgtgaaa3 ‘ (SEQ IDNO ； 18)禾口 ttgaattcaccacgaagt ctcaacacaa3' (SEQ ID NO :19)分别作为正向和反向引物。该正向和反向引物各自包含供 BamHI和EcoRI用的限制位点。在人ρ 18多核苷酸片段的PCR合成中，使用5 ‘ ttaagcttatg gccgagccttgggggaacgagttgg3‘ (SEQ ID NO :20)作为正向引物，并使用 5' ttctcgagttatt gaagattttgtggctcc3' (SEQ ID NO :21)作为反向引物。该正向和反向各自包含供HindIII 和BioI用的限制位点。然后，为了改善pl8的亲水性，使用5' cttagaggtgctaatcccgatttg 3' (SEQ ID NO :22)作为正向引物和 5' gtctttcaaatcgggattagcacc3‘ (SEQ ID NO 23) 作为反向引物来进行核酸序列的定点诱变，从而将第71位氨基酸苯丙氨酸(F)的密码子用 天冬酰胺(N)的密码子替代。将突变体命名为"pl8(F71N)"。PCR 通过本领域已知方法使用 GeneAmp PCR System 9700 (AppliedBiosystem)进 行。PCR 产物使用 QIAquick Multiwell PCR Purification 试剂盒(Qiagen)纯化，并将各 产物克隆至pGEM-T fesy载体(!Iomega)中。然后，对于产生的各重组pGEM-T fesy载体， 用所述载体转化感受态细胞(大肠杆菌DH5 α )，其后使用QIApr印Spin Miniprep试剂盒 (Qiagen)从经转化的细胞的培养物分离质粒。使用BamHI和EcoRI切割包含人泛素cDNA的pGEM_T Easy载体，并使 用HindIII和XhoI切割包含人pl8(F71N)的cDNA的pGEM-T Easy载体。然后，将 两种片段插入pET-NLS-kFGF4-p53表达载体中。将这种最终制备的能够表达人泛 素-NLS-MTS-p53-pl8 (F71N)融合蛋白的载体命名为 pET_Ub-NLS_kFGF4-p53-pl8 (F71N)。 插入pET载体中的人泛素-NLS-MTS-p53-pl8融合蛋白的多肽序列和编码该多肽序列的多 核苷酸序列分别如SEQ ID NOS 25和24所示。在SEQ ID NO :24的多核苷酸序列中，第1至第2 个核苷酸编码人泛素，第235 至第249个核苷酸编码NLS，第250至第297个核苷酸编码KFG4前导序列，第298至第336 个核苷酸编码P53，和第343至第849个核苷酸编码pl8。在如SEQ ID NO :25中所示的氨 基酸序列中各多肽的位置可从在SEQ ID NO 24的核苷酸序列中的相应位置推断。如上所述还制备对照跨膜融合蛋白表达载体，其类似于 pET-Ub-NLS-kFGF4-p53-pl8 (F71N)载体，但在融合蛋白的NH2-末端缺乏泛素。将该对照 融合蛋白载体表示为pET-NLS-kFGF4-p53-pl8(F71N)载体，并将该对照融合蛋白表示为 NLS-kFGF4-p53-pl8(F71N)。实施例2 跨膜融合蛋白的表达和纯化在用根据实施例1制备的pET-Ub-NLS-kFGF4-p53-pl8 (F71N)载体转化的大肠杆 菌BL21(DE!3)中过表达所述跨膜融合蛋白。将经转化的细菌在YT培养基中培养。当在600nm 吸光度的光密度为0. 5时，向培养基加入0. 5mMIPTG,并将经转化的大肠杆菌BL21 (DE3)在 18°C进一步培养16小时。将培养的细胞在包含5%甘油、5πιΜβ-巯基乙醇、0.2% Triton
9X-100和0. 2MNaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中进行超声处理，然后离心以获得上 清液(10，000Xg)。将所述上清液施加至以缓冲液平衡的Ni2+-NTA超流柱(Qiagen)，用5 倍柱体积的洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8. 0，5%甘油，5mM β -巯基乙醇，0. 2% Triton X-100和IM NaCl)洗涤，并用洗脱缓冲液(50mMTris-HCl，pH 8.0，5%甘油，5福β-巯基乙 醇，0. 2% Triton X-100和0. 2M NaCl)洗脱。收集包含所述融合蛋白的级分，并使用Amicon Ultra-15 CentrifugalFiIter (Mi 1 ipore)去除级分中所含的盐，然后将所述级分浓缩。使 用牛血清清蛋白(BSA)作为标准品对纯化的蛋白的浓度定量。测定包含泛素的融合蛋白和不含泛素的融合蛋白(对照)的表达和纯化特性。结 果示于下文表1。根据当前实施方案的包含泛素的融合蛋白显示出高表达量、以及卓越的亲 水性、产率、浓度和纯度。表 权利要求
1.分离的跨膜融合蛋白，包含泛素或泛素样蛋白；与所述泛素或泛素样蛋白的C-末端连接的膜易位序列；和与所述膜易位序列的C-末端连接的生物活性分子。
2.权利要求1的跨膜融合蛋白，其中所述泛素或泛素样蛋白是突变体。
3.权利要求2的跨膜融合蛋白，其中所述突变体泛素用Arg替代在野生型泛素的氨基 酸序列中的Lys。
4.权利要求1的跨膜融合蛋白，其中所述泛素或泛素样蛋白具有由蛋白酶切割的蛋白 酶识别氨基酸序列。
5.权利要求1的跨膜融合蛋白，其中所述泛素或泛素样蛋白是选自如下的泛素样蛋 白Nedd8、SUM0-1、SUM0-2、NUBl、PICl、UBL3、UBL5和 ISG15。
6.权利要求1的跨膜融合蛋白，其中所述膜易位序列包含具有选自SEQIDNOS :1至15 的序列的多肽。
7.权利要求1的跨膜融合蛋白，其中所述生物活性分子选自p53、pl8(raKN2C)、 神经调节素1、PTEN肿瘤抑制剂、ARF肿瘤抑制剂、APC、CD95、雌酮、MENl、BRCAl、 Von Hippel-Lindau肿瘤抑制剂、RKIP、nm23、内皮抑制素、胰岛素、胰岛素样生长因子 I(IGF-I)、生长因子、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞 集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-Y、白介素-Ia和β、白介 素_3、白介素_4、白介素-6、白介素-2、表皮生长因子(EGF)、降钙素、促肾上腺皮质激素 (ACTH)、肿瘤坏死因子(TNF)、阿托西班、布舍瑞林、西曲瑞克、地洛瑞林、去氨加压素、强啡 肽A(l-13)、依降钙素、依来多辛、依替巴肽、生长激素释放激素-II (GHRH-II)、戈那瑞林、 戈舍瑞林、组氨瑞林、亮丙瑞林、赖氨加压素、奥曲肽、催产素、加压素、胰泌素、辛卡利特、特 利加压素、胸腺喷丁、胸腺素α 1、曲普瑞林、比伐卢定、卡贝缩宫素、环孢素、艾可西定、兰瑞 肽、黄体生成素释放激素(LHRH)、那法瑞林、甲状旁腺激素、普兰林肽、恩夫韦地(Τ-20)、胸 腺法新和齐考诺肽。
8.权利要求1的跨膜融合蛋白，进一步包含核定位信号域。
9.权利要求8的跨膜融合蛋白，其中所述核定位信号域包含具有SEQIDNO J6的多肽。
10.编码权利要求1-9任一项的跨膜融合蛋白的分离的多核苷酸。
11.重组载体，包含权利要求10的多核苷酸；和与所述多核苷酸可操作地连接的启动子。
12.由权利要求10的多核苷酸转化的宿主细胞。
13.将跨膜融合蛋白递送至细胞的方法，所述方法包括在体外将权利要求1-9任一项 的跨膜融合蛋白与细胞接触。
14.产生跨膜融合蛋白的方法，包括在容许所述跨膜融合蛋白表达的条件下培养权利要求12的宿主细胞；和从宿主细胞培养物回收所述跨膜融合蛋白。
15.权利要求14的方法，其中所述宿主细胞是细菌宿主细胞。
16.用于将生物活性分子递送至细胞的组合物，包含权利要求1-9任一项的跨膜融合 蛋白；和可药用载体。
全文摘要
本发明涉及包含泛素或泛素样蛋白、膜易位序列和生物活性分子的融合蛋白及其用途。具体地，本发明涉及包含泛素或泛素样蛋白、与该泛素或泛素样蛋白的C-末端连接的膜易位序列、和与该膜易位序列的C-末端连接的生物活性分子的跨膜融合蛋白，编码所述跨膜融合蛋白的多核苷酸，包含所述多核苷酸序列的重组表达载体，由所述重组表达载体转化的细胞，和使用所述跨膜融合蛋白将所述生物活性分子递送至细胞中的方法。
文档编号C12P21/02GK102086231SQ201010574418
公开日2011年6月8日 申请日期2010年12月6日 优先权日2009年12月4日
发明者李兑洙, 李在日, 李英善 申请人:三星电子株式会社