一种蛋白质类泛素化修饰的检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蛋白质类泛素化修饰的检测方法、检测 质粒W及制备方法、检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 类泛素化修饰是由类泛素化修饰蛋白所介导的一种蛋白质翻译后修饰行为，研究 表明类泛素化修饰在染色体分离、DNA损伤应答、减数分裂、蛋白质泛素化降解W及染色质 结构和功能调节等多个生物学过程中发挥重要作用，异常的类泛素化修饰还被认为与肿 瘤、也血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病等多种疾病的发生相关。但是在细胞里仅有一小 部分底物蛋白能发生类泛素化修饰，比例较低，该种低丰度的现状极大限制了对类泛素化 修饰的量化分析及其生物学功能研究。
[0003] 目前，主要采用蛋白质印迹方法W及质谱学手段来对类泛素化修饰进行分析鉴 定。蛋白质印迹方法通常利用免疫沉降方法来富集被类泛素化修饰蛋白所修饰的目标蛋 白，然后再利用聚丙帰醜氨凝胶电泳进行分离，再进行转膜、封闭、抗体赔育、显影等步骤进 行类泛素化修饰的鉴定；质谱学手段需要对纯化的目标蛋白进行蛋白酶酶切，通过获取目 标肤段质荷比并与相应的蛋白序列数据库进行比对分析，从而判定目标蛋白发生修饰与 否。
[0004] 然而，蛋白质印迹法需要进行一系列实验操作，操作步骤多，实验周期长；质谱学 检测虽然可W对类泛素化修饰发生与否进行分析，但是需要对蛋白质序列数据库进行特定 改造，且无法对类泛素化修饰蛋白多聚链的聚合程度进行量化分析。
[0005] 因此，有必要提供一种简单易行、灵敏度高、能对蛋白质类泛素化修饰进行检测， W及对蛋白质的多聚类泛素化修饰的修饰程度进行量化分析的方法。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种蛋白质类泛素化修饰的检测方法，该方法将 表达待测蛋白质的重组质粒W及表达带四半脫氨酸多肤标签的类泛素化修饰蛋白的重组 质粒共转染宿主细胞进行蛋白质的类泛素化修饰，然后进行蛋白质纯化、双神染料标记、并 对待测蛋白质的类泛素化修饰进行检测和待测蛋白质的多聚类泛素化修饰的修饰程度进 行量化分析；该方法灵敏度高，简单易行。此外，本发明还提供了一种蛋白质类泛素化修饰 的检测质粒及其制备方法和应用；另外，本发明还提供了一种蛋白质类泛素化修饰的检测 试剂盒。
[0007] 第一方面，本发明提供了一种蛋白质类泛素化修饰的检测方法，包括W下步骤：
[0008] (1)提供重组质粒，包括待测蛋白质表达质粒和检测质粒，
[0009] 其中，所述待测蛋白质表达质粒具有待测蛋白质的编码基因，所述检测质粒含有 相连的类泛素化修饰蛋白的编码基因和四半脫氨酸多肤标签的编码基因，所述四半脫氨酸 多肤标签的编码基因位于所述类泛素化修饰蛋白的编码基因的5'端，所述四半脫氨酸多肤 标签的编码基因为18bp~36bp,
[0010] 所述四半脫氨酸多肤标签的氨基酸序列包括CCXXCC，其中，所述C为半脫氨酸，所 述X为除半脫氨酸W外的任一氨基酸，
[0011] 所述待测蛋白质为类泛素化修饰蛋白作用的底物蛋白；
[0012] (2)将所述待测蛋白质表达质粒和检测质粒在细胞内共表达，得到经类泛素化修 饰蛋白修饰的待测蛋白质；
[0013] (3)纯化经类泛素化修饰蛋白修饰的待测蛋白质；
[0014] (4)采用双神英光染料对纯化后的经类泛素化修饰的待测蛋白质进行英光标记；
[0015] (5)对英光标记的经类泛素化修饰的待测蛋白质进行检测和/或量化分析。
[0016] 优选地，所述待测蛋白质表达质粒为将待测蛋白质的编码基因插入真核载体的多 克隆位点后所得的重组质粒。
[0017] 进一步优选地，所述真核载体为真核表达载体。
[0018] 更进一步优选地，所述真核表达载体为pcDNA载体。
[001 引 更进一步优选地，所述 pcDNA 载体为 pcDNA?3. 1/His-A、pcDNA?3. 1/His-B、 pcDM?3. 1/His-C、pcDM?4/His-A、pcDM?4/His-B、pcDM?4/His-C、pcDM?3. 1 (-) / myc-His-A、pcDNA?3. 1 (-)/myc-His-B、pcDNA?3. 1 (-)/myc-His-C、pcDM3. l(+)/myc-His A、pcDNA3. l(+)/myc-His B 或 pcDNA3. l(+)/myc-His C。
[0020] 优选地，检测质粒为将所述相连的类泛素化修饰蛋白的编码基因和四半脫氨酸多 肤标签的编码基因插入原核载体或真核载体的多克隆位点后所得的重组质粒。
[0021] 进一步优选地，所述原核载体或真核载体为原核表达载体或真核表达载体。
[0022] 更进一步优选地，所述原核表达载体为pET载体或pGEX表达载体。
[0023] 更进一步优选地，所述真核表达载体为pcDNA载体。
[0024]更进一步优选地，所述 pcDNA 载体为 pcDNA ?3. 1 (+)、pcDNA ?3. 1 (-)、pcDNA?3. 1/ His-A、pcDNA?3. 1/His-B 或 pcDNA?3. 1/His-C 载体。
[002引更进一步优选地，所述多克隆位点为pcDNA?3. 1/His-A的化nd III和化o I酶切 位点。
[0026] 在此优选条件下，所述步骤（3)纯化表达所得的经类泛素化修饰的待测蛋白质的 方法为：
[0027] a)收集细胞，用细胞裂解缓冲液重息，超声破碎；
[0028] b)离也取上清液，所得上清液与媒结合树脂赔育后用清洗缓冲液清洗树脂2~3 次；
[0029] C)再用与树脂等体积的洗脱缓冲液将经类泛素化修饰的待测蛋白质从树脂上洗 脱下来，得到纯化的经类泛素化修饰的待测蛋白质。
[0030] 优选地，所述步骤a)中，所述细胞裂解缓冲液的抑为8.0,包括；lOOmM NaH^POA, lOmM Tris_Cl，8M urea, ImM TCEP。
[0031] 优选地，所述步骤b)中，所述清洗缓冲液的地为6. 3,包括：100ml NaH2P〇4, lOmM Tris-C1，4M urea，ImM TCEP。
[003引优选地，所述步骤c)中，所述洗脱缓冲液的地为4. 5,包括：100ml麻畔04, lOmM Tris-Cl, 2M urea, ImM TCEP, pH=4. 5。
[003引优选地，所述类泛素化修饰蛋白为SUMOl、SUM02、SUM03、SUM04、肥孤8、FATIO、 FUBUUBL5、ISG15、UFM1、化ml 或 Apgl2。
[0034] 优选地，所述SUM02为人源SUM02 (h SUM02)，所述人源SUM02的编码基因如SEQ ID NO: 1 所示。
[00巧]在此优选条件下，所述类泛素化修饰蛋白的Genebank登录号如下：
[0036]所述 SUM01、SUM03、SUM04、肥孤8、FAT10、FUB1、UBL5、ISG15、UFM1、化ml 或 Apgl2 的 Genebank 登录号分别为 BC006462. 1、NM_001286416. 1、AB205057. 1、BC104201. 1、 AF123050. 1、NM_001997. 4、AF313915. 1、NM_005101. 3、BC005193. 1、BC003581. 1、 AB017507. 1 ；
[0037]优选地，所述待测蛋白质为 Sp100 、p53、p73、RanGAPl、PML、HIPK2、c-^n、An^ogen receptor、]Vklm2、TopoI、TopoII、WRN、glut4、TDG、Qil-l、Qil-2、Qil-3、Qil-4A、PLCyl、 JAKl、STAT-1、E服 1、Bcl-G、Mad2、Sp3、PCNA、化K4 或 Snu66.
[0038]在此优选条件下，所述 SplOO、p53、p73、RanGAPl、PML、HIPK2、c-Jun、An化ogen receptor、]Vklm2、TopoI、Top〇n、WRN、glut4、TDG、Qil-l、Qil-2、Qil-3、Qil-4A、PLCyl、 JAKl、STAT-1、E服 1、Bcl-G、Mad2、Sp3、PCNA、化K4 或 Snu66 的 Genebank 登录号分别为 BC011562. 1、BC003596. 1、Y11416. 1、BC041396. 2、S50913. 1、AF326592. 1、BC068522. 1、 M：M233. 1、NM_001145339. 2、BC136297. UJ04088. UAF091214. UM91463. 1、NM_003211.4、 匪_003592. 2、AF126404. 1、BC092409. 1、AF077188. 1、BC144136. 1、NM_002227. 2、 GU211347. 1、X60188. 1、AF281255. 1、U65410. 1、AY441957. 1、J04718. 1、NM_020666. 2、 NM_005146. 4。
[0039] 优选地，本发明所采用的四半脫氨酸多肤标签包括的CCXXCC为序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列。
[0040]具体地，所述 SEQ ID N0:2 为 CCPGCC。
[0041] 优选地，所述四半脫氨酸标签多肤的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4 所示。
[0042]具体地，所述 SEQ ID N0:3 的序列为 FLNCCPGCCMEP。
[0043]具体地，所述 SEQ ID N0:4 的序列为 HRWCCPGCCKTF。
[0044] 优选地，所述待测蛋白质表达质粒和检测质粒共表达的细胞为人胚肾细胞、人宫 颈癌细胞、人乳腺癌细胞、非洲绿猴SV40转化的肾细胞、人成骨肉瘤细胞。
[004引优选地，所述双神英光染料标记试剂包括FlAsH-EDTs、巧FlAsH-EDTs、 F4F1AsH-EDT2 或 ReAsH-EDT]。
[0046] 优选地，所述步骤（4)采用双神英光染料对纯化后的经类泛素化修饰的待测蛋白 质进行英光标记的方法为：
[0047] 先用步骤（3)所得纯化的经类泛素化修饰的待测蛋白质的十倍体积的磯酸盐缓冲 液进行稀释和中和，再加入双神英光染料在室温下避光赔育60分钟，得到双神英光染料标 记的经类泛素化修饰的待测蛋白质；其中，所述磯酸盐缓冲液的抑为7. 4,所述双神英光染 料加入后的终浓度为500nM。
[0048] 在此优选条件下，所述十倍体积的磯酸盐缓冲液为步骤（3)所得的纯化后的洗脱 液的体积的十倍。
[0049] 优选地，所述步骤（5)对英光标记后的经类泛素化修饰的待测蛋白质进行检测的 方法为：利用全内反射英光显微镜对经类泛素化修饰的待测蛋白质进行单分子成像，观察 待测蛋白质是否发生类泛素化修饰。
[0050] 优选地，所述步骤（5)对英光标记后的经类泛素化修饰的待测蛋白质进行量化分 析的方法为：
[0051] 将带单四半脫氨酸多肤标签的类泛素化修饰蛋白的英光强度的平均值定义为单 类泛素化修饰，再将经类泛素化修饰的待测蛋白质获得的英光强度值除W单修饰的英光 值，从而计算出经类泛素化修饰的