长足大竹象的性信息素结合蛋白pbp的基因序列及其pcr方法
【专利摘要】本发明提供了一种利用PCR方法从长足大竹象得到性信息素结合蛋白PBP的基因的方法，并首次公开了长足大竹象的第一条性信息素结合蛋白PBP的基因序列。长足大竹象性信息素结合蛋白PBP及其基因的发现为此类生物的防控提供了有益方法。
【专利说明】
长足大竹象的性信息素结合蛋白PBP的基因序列及其PCR方法
[0001]
技术领域:本发明属于昆虫分子生物学领域，具体公开了长足大竹象的性信息素 结合蛋白PBP的核巧酸序列。
【背景技术】：
[0002] 繁衍生息是昆虫的重要任务，但昆虫成虫寿命往往很短，雌雄个体间为了完成交 配任务，必须具有远距离精确捜寻异性个体的能力。昆虫成虫精确识别同种异性个体是通 过释放和接收性信息素完成的，一般性信息素由雌性成虫个体发出，雄性个体通过触角毛 形感器接受运种化学信号，穿过极孔，进入亲水性的感受器淋己液中，此时，疏水性的性信 息素就需要与载体结合形成聚合物才能进入淋己液到达树突端，运转到位于嗅觉神经元末 梢膜上的性信息素受体(pheromone rec邱tors,PRs)上，当PRs被激活后，才能转化为电信 号被ALs整合，最后进入昆虫大脑被其感知。在运个过程中，起关键作用的运输载体就是广 泛分布于感受器淋己液中的性信息素结合蛋白（pheromone binding proteins，PBPs)， Krieger等人发现HvirORll被HvirPBPl包裹，证实了 PBP在性信息素受体外围表达，并包裹 着性信息素受体。PBPs在昆虫的寻偶、交配和繁殖等方面有重要作用。昆虫嗅觉感受机制对 雄性昆虫克服距离感知雌性昆虫所发出的性信息物质，对雌性昆虫进行捜索，并完成交配 具有重要意义。其机制一般包括性信息素的释放和性信息素的接收两部分。
[0003] 目前对于PBPs的研究多集中在鱗翅目和少数銷翅目金龟子科，而作为銷翅目第一 大科的象甲科几乎没有研究报道。长足大竹象（Cyrtotrachelusbuqueti Guerin- meneville)属于象甲科，其PBPs蛋白及基因缺乏相关研究。
【发明内容】
：
[0004]本发明利用现有基因克隆技术，克隆出长足大竹象（Cyrtotrachelusbuqueti Guerin-meneville)第一条性信息素结合蛋白PBP基因，对继续深入研究长足大竹象嗅觉机 制和阐明长足大竹象成虫性信息感受机制，W及长足大竹象的生物防控提供了新的有益思 路。
[0005] 本发明具体提供了长足大竹象（切rtohachelusb叫ueti Guerin-meneville)性 信息素结合蛋白PBP基因，其核巧酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示。
[0006] 本发明还提供了一种核巧酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示的长足大竹象 (切；rtotrachelusb叫ueti Guerin-menevi 1 le)性信息素结合蛋白PBP基因的PCR方法，包括 W下步骤：
[0007] (1)总RNA提取分离；
[000引（2)cDNA第一链的合成；
[0009] (3)w序列表SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5所示序列核巧酸为引物，对步骤(2)所述 cDNA进行PCR扩增;扩增条件为:94°C保持30秒;41.3°C保持30秒;72°C保持30s分钟，循环35 次。
[0010] 进一步的，上述PCR方法，包括在(3)所述扩增条件之前，先在94°C保持4分钟进行 预变性；同时在循环之后，于72 °C保持7分钟进行延伸。
[0011] 其次，本发明提供了长足大竹象性信息素结合蛋白PBP基因的重组质粒PMD19-T/ PBP，其核巧酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
[0012] 所述重组质粒PMD19-T/PBP可转化大肠杆菌DH5a，W蓝白斑筛选阳性克隆，菌落 PCR鉴定及测序鉴定。
[0013] 同时，本发明还提供了长足大竹象（切rtotrachelusb叫ueti Guerin-meneville) 性信息素结合蛋白PBP基因在制备生物防控产品中的用途。
[0014] 此外，本发明还提供了如序列表SEQ ID NO: 1所示核巧酸序列的长足大竹象性信 息素结合蛋白PBP基因所编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。W及长足大竹象性信息素结合蛋白PBP在制备生物防控产品中的用途。
[0015] 本发明发现长足大竹象（切rtohachelusbuqueti Guerin-meneville)具有性信 息素结合蛋白PBP，并首次公开了长足大竹象的性信息素结合蛋白PBP基因、获得该基因的 PCR方法，W及该基因编码的蛋白。根据本发明提供的PBP基因及蛋白，可设计相关的抑制或 阻断长足大竹象接受性信息素的生物防控药物和方法，为此类昆虫的生物防控提供了新的 选择和技术。
[0016] 说明书【附图说明】
[0017] 图1长足大竹象PBP1的RNA和PCR产物
[0018] 图2 D册a感受态细胞菌落PCR鉴定结果
[0019] 图3长足大竹象Cbuq-PBPl核巧酸序列示意图及推导的氨基酸序列示意图
[0020] 图4跨膜区预测
[0021] 图5氨基酸组成
[0022] 图郎荒水性分析
[0023] 图中负值代表亲水性区域，正值代表疏水性区域。
[0024] 图7二级结构图
[00巧]Helix为a-螺旋，sheet为0-折叠，turn为0-转角，coil为无规则卷曲（图中线段长 度依次递减）。
[0026] 图8S维结构模型
[0027] 图9曰、抓、9。、9(161曰31比对图
[00%] *为保守区：为较多序列一致.较少序列一致;黑色方框内为目的基因化uq-PBP序 列。http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/
[0029] 图10轮状系统进化树
[0030]
[0031] DponOBPS:[Dendroctonusponderosae],GenBank accession number AGI05175.1
[0032] Cmon0BP2:[Cryptolaemusmontrouzieri],GenBank accession number ALW95359.1
[0033] Tcas0BP13:[Triboli皿castane皿],GenBank accession number EFA02858.1
[0034] Tcas0BP16:[Triboli皿castane皿],GenBank accession number EFA02853.2 [00；35] I'molOBPS: [I'enebriomolitor] ,GenBa址 accession number AJM71479.1
[0036] I'molOBPG: [I'enebriomolitor] ,GenBa址 accession number AJM71480.1
[0037] I'molOBPS: [Tenebriomolitor]，GenBank accession number AJM71482.1
[0038] Rdom0BP2:[加 yzoperthadominica]，GenBank accession number AIX97125.1
[0039] Rdom0BP12:[加 yzoperthadominica]，GenBank accession number AIX97135.1
[0040] Rdom0BP5:[加 yzoperthadominica]，GenBank accession number AIX97128.1
[0041] Hpic0BP2:[Heptophyllapicea]，GenBank accession number BAC07271?1
[0042] Hpar0BP2:[Holotrichiaparallela]，GenBank accession number BAC07273.1
[0043] HparOBP:[Holotrichiaparallela]，GenBank accession number AEA76516.1
[0044] 化bl0BP2:[Holotrichiaoblita]，GenBank accession number ACX32049.2 [004日]AschPBP2:[Anomalaschonfeldti]，GenBank accession number BAF79600.1
[0046] ArufPBPS:[Anomalarufocuprea],GenBank accession number BAF91330.1
[0047] ArufPBP2:[Anomalarufocuprea]，GenBank accession number BAF91329.1
[0048] AschPBP:[Anomalaschonfeldti]，GenBank accession number BAF79603.1
[0049] MaltOBPl:[Monochamusalterna化s]，GenBank accession number ABR53888.1
[0050] DplaOBPl:[Delia pla化ra]，GenBank accession number BAS69441?1
[0051] DantOBPl:[Delia antiqua]，GenBank accession number BAI82441?1
[00日2] CstyOBP:Kalliphorastygia]，GenBank accession number AID61308.1
[00日3] CstyOBP:Kalliphorastygia]，GenBank accession number AID61313.1
[00日4] LsatPBP4:[Liriomyzasativae]，GenBank accession number ALZ41690.1
[00日日] Dwil0BP19d:[Drosophila wi11istoni]，GenBank accession number XP_ 002064402.2
[00日6] SfurOBPS:[Sogatellafurcifera]，GenBank accession number AHB59654.1
[00日7] Sfur0BP5:[Sogatellafurcifera]，GenBank accession number AGZ04905.1
[00日8] Lstr0BP6:[Laodelphaxstriatella],GenBank accession number AGZ04925.1
[00日9] LstrOBPS:[Laodelphaxstriatella],GenBank accession number AEQ19909.1
[0060] Nlug0BP2:[Nilaparvatalugens],GenBank accession number ACI30680.1
[0061] LeryOBPS:[Lipaphiserysimi],GenBank accession number AJ061166.1
[0062] MperOBPS:[Myzuspersicae],GenBank accession number CAR85644.1
[0063] Apis0BP3:[Acyrthosipho叩isum]，GenBank accession number CAR85630.1
[0064] PmegPBP:[Panstrongylusmegistus],GenBank accession number JAC85421.1
[006日] CnipOBP4:[Chrysoperlanipponensis]，GenBank accession number AKW47225.1
[0066] Cpal0BP7:[Qiiysopapallens]，GenBank accession number AKM52550.1
[0067] CpunOBPS:[Conogethespunctiferalis],GenBank accession number A版37225.1
[006引 CmedOBPlS:[Cnaphalocrocismedinalis],GenBank accession number ALT31643.1
[0069] Cpun0BP2:[Conogethespunctiferalis],GenBank accession number A版37224.1
[0070] Slit0BP28:[Spodopteralitura],GenBank accession number ALD65902.1
[0071] SinfPBPl:[Sesamiainferens],GenBank accession number AEQ30019.1
[0072] SnonPBPl:[Sesamianonagrioides],GenBank accession number AAS49922.1
[0073] P巧IPBPl:[Plutellaxylostella],GenBa址 accession number ACI28451.1
[0074] AconPBP3:[Argyresthiacon化gella],GenBa址 accession number AFD34179.1 [0(J75] MsexPBP: [Manducasex1:a] ,GenBa址 accession number AAA29325.1
[0076] ApolPBP:[Antheraeapolyphemus],GenBa址 accession number P20797
[0077] BmorPBP:[Bombyxmori],GenBa址 accession number P34174
[0078] AperPBPl:[Antheraeapernyi],GenBank accession number Q17077 [0(J79] AperPBP2:[Antheraeapernyi],GenBa址 accession number Q17078
[0080] HvirPBP:[Heliothisvirescens],GenBank accession number Q27388
[0081] EposPBPl:[Epiphyaspostvittana],GenBank accession number Q95VE9
[0082] E：posPBP2: Epiphyaspostvittana] ,GenBa址 accession number Q95VF0
[0083] SexiPBP:[Synanthedonexitiosa],GenBank accession number AAF06142.1
[0084] RmadPBP:Whyparobiamaderae],GenBa址 accession number AAM77027.1
[0085] LoryOBP:[Lissorhoptrusoryzophilus],GenBank accession number A肥13799.1
【具体实施方式】
[0086] 虫源
[0087] 长足大竹象在中国境内多有分布，例如可在7-9月于四川雅安境内采集。为实施例 于2015年7月中旬至9月中旬采集于四川省雅安市芦山县思延乡铜头村（103° (TN;30°3/E) 慈竹林。长足大竹象采集后，液氮速冻后，放-80°C保存。
[0088] 试验试剂和仪器
[0089] (1)试剂及仪器
[0090] ?〔3系统（含1日991113〇論聚合酶、(1^?3，13^'6'，111旨。12等）^日1(日1?日]\111118651 Universal RNA Extraction Kit (宝生物公司产品），P;rimeSc;riptTM RT reagent Kit (Perfect Real Time)(宝生物公司产品），l'aKaRaMiniBESTAga;rose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(宝生物公司产品），pMD? 19-T Vector Cloning Kit(宝生物公司产品）；琼脂 糖（分析纯），50 X TAE缓冲液，蛋白腺，酵母粉，氯化钢，核酸染料G0LDVIEW，DNAmark DL2000，氨节青霉素，大肠杆菌D册a感受态细胞。
[0091] PCR仪（DNA Engine Dyad Peltiter Thermal 切cle,Bio-Rad,USA)，凝胶成像系 统（GelDocXR, Bio-Rad, USA)，电泳仪（Bio-Rad, USA)，紫外可见分光光度计（DU 800 Spectro地ometer, BeckmanCoulter ,USA)，电子分析天平，高速冷冻离屯、机，水浴锅高压灭 菌锅，超低溫冰箱，超净工作台等。
[0092] (2)培养基与试剂配方
[0093] 1)含抗生素固体LB培养基：lg化Cl，0.5g酵母粉，lg蛋白腺，1.5g琼脂粉用蒸馈水 定容至lOOmL，高压蒸汽灭菌30min，取出后55°C水浴至手可触摸的溫度，在超净工作台内加 入抗生素(Amp)使抗生素终浓度为lOOug/mL，每lOmL倒一个平板，超净工作台内保存。
[0094] 2)LB液体培养基：Ig化C1，0.5g酵母粉，Ig蛋白腺，蒸馈水溶解，定容至lOOmL，高 压蒸汽灭菌30min，超净工作台内保存。
[OOM] 3)焦炭酸二乙醋(DEPC)处理水：向蒸馈水中加入DEPC至终浓度为0.1%，揽拌至少 12h，然后 121°C 灭活DEPC 30min。
[0096] 玻璃与塑料制品的处理:与RNA相关实验的制品均用0.1 % (vA)DEPC溶液浸泡12- 24h，15psi高压蒸汽灭菌30min;其它实验中的制品均用15psi高压蒸汽灭菌30min。
[0097] 金属制品、研鉢的处理:均在烘箱(200。中烘烤化。
[0098] 实施例一长足大竹象性信息素结合蛋白PBP1基因的克隆
[0099] (一)长足大竹象总RNA提取
[0100] 选用宝生物To化1 RNA快速提取试剂盒，操作步骤如下：
[0101] 1)组织的裂解。
[0102] 将超低溫冻存雄虫于冰上取触角后，转移至液氮预冷的研鉢中，用研巧研磨组织， 其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA 的收率和质量）。将研磨成粉末状的样品加入到含有裂解60化1 Buffer化和DTT的 1.5ml灭菌化be中，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀。
[0103] 2)将裂解液在12000巧m，4 °C离屯、5min。
[0104] 3)将曲NA Eraser Spin Column安放到2ml的Collection Tube(试剂盒提供)上。 [010日]4)小屯、吸取上清液，移入到曲NA Eraser Spin Column中。
[0106] 5)12000巧111，离屯、1111；[]1。
[0107] 6)弃曲NA Eraser Spin Colu皿（进行基因组DNA提取时请保留），向含有滤液的 2ml Co 11 ection化be中加入等体积的70 %乙醇(此时可能会出现沉淀），使用移液枪将溶 液混合均匀。
[0108] 7)立即将混合液（含沉淀）全部转入到RNA Spin Column(含2ml Collection Tube)中。（如果混合液的体积大于60化1，则分批加入，每次加入的体积不要大于60化1。）
[0109] 8) 12000;rpm，离屯、Imin，弃滤液。将RNA Spin Column放回到2ml Collection l\ibe 中。
[0110] 9)将50化1 的Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，12000巧m离屯、30s，弃滤液。
[0111] 10)将60化1 的Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，12000巧m离屯、30s，弃滤液。
[0112] 11)重复操作步骤10。
[0113] 12)将RNA Spin Column重新安置于2ml Collection l\ibe上，12000巧m离屯、2min。
[0114] 13)将RNA Spin Column安置于 1.5ml的RNase Free Collection I'ube上（试剂盒 提供），在RNA Spin Colu皿膜中央处加入50-200iU的脚ase Free地20或0.1%DEPC处理 水，室溫静置5min。
[0115] 14) 12000巧 m 离屯、2min 洗脱 RNA。
[0116] 15)为了提高RNA的浓度，将第一次的洗脱液重新加回至RNA Spin Column中，室溫 静置5min，12000巧m离屯、2min洗脱RNA，于-80 °C保存。
[0117] 用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，用紫外/可见分光光度计检测总RNA的 浓度和纯度。
[0118] 琼脂糖凝胶电泳步骤如下：
[0119] 1)将配制好的琼脂糖凝胶微波炉加热直至溶解；
[0120] 2)将梳子放置在制胶槽上，冷却至6(TC左右，将琼脂糖凝胶液倒到制槽上，直到在 整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层，不要产生气泡(厚度约为3-4mm);
[0121] 3)室溫下静置30min左右，待凝固完全后轻拔出梳子；
[0122] 4)制好胶后将凝连同内槽放在含有1XTAE缓冲液的电泳槽中使用（注意：电泳槽 中的缓冲液应与配胶用成分、浓度一致）；
[0123] 5)用微量加样器将10化PCR产物分别加入胶板的样品孔内，加完样后的凝胶板即 可通电进行电泳(80-100V的电压下电泳，一般情况下，电压/电极间距离应小于5V/cm)，电 泳时间一般为30min;
[0124] 6)GoldViewlM染色，紫外灯下观察结果并采用凝胶成像系统照相。
[01巧]将上述得到的RNA样品用200uL DEPC水溶解沉淀，用微量加样器轻轻吸打30-40 下，然后在55-60°C水浴5-lOmin，让RNA充分溶解。从总RNA样品中吸取lOul稀释300倍，用分 光光度计测0D260,0D280,根据公式RNA浓度(ug/ul)=0D260X40X稀释倍数/计算样品浓 度;0D260/0D280检测样品纯度。经检测，0D260/0D280为1.9。
[01%](二)cDNA第一链的合成
[0127] 选用大连宝生物的cDNA第一链合成试剂盒，其操作流程如下：
[0128] 在冰浴上，按表1配制反转录第一步反应液，轻轻混匀、短暂离屯、，使溶液汇集在反 应管底部。
[0129] 表1反转录反应体系
[0130] Table 1 The system of reverse transcription reaction
[0131]
[0132] 反应条件:37°C 15min(反转录反应）
[0133] 85°C 5s(反转录酶的失活反应）
[0134] 4°C 保持。
[0135] 反转录产物于-20°C或更低溫度保存备用。
[0136] (S)目的片段的RT-PCR扩增及扩增产物回收
[0137] 根据高通量测序结果，利用Primer premie巧和01igo6.0设计长足大竹象触角性 信息素结合蛋白PBP特异性引物(见表2)，送出由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。
[0138] 在冰浴上，按表3配制性信息素结合蛋白目的片段的PCR反应液，短暂离屯、使溶液 汇集在反应管底部，然后再进行PCR反应。反应产物-20°C保存，1 %琼脂糖凝胶电泳检测[步 骤见实施例例一(一）]，外送由成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。经测序得到长足大竹 象预期特异性片段，其序列如序列SEQ ID NO: 1所示
[0139] 检测结果如图1，基因长度与预测长度相符合，得到53化P左右的特异性条带。
[0140] 表2长足大竹象性信息素结合蛋白PBPs引物序列
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145] PCR产物回收
[0146] PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，按照TaKaRaMiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0说明书的操作步骤进行胶回收，步骤如下：
[0147] 1)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体；
[0148] 2)称量胶块重量，计算胶块体积(计算胶块体积时，Wlmg =化1进行计算）；
[0149] 3)均匀混合后室溫15-25°C溶解胶块，间断振荡混合，使胶块充分溶解（约5- lOmin)；
[0150] 4)当凝胶完全溶解后，若溶胶液颜色由黄色变为澄色或粉色，便向上述胶块溶解 液中加入3M醋酸钢溶液(P册.2) 1化1，均匀混合至溶液恢复黄色。当分离小于40化P的DNA片 段时，在此溶液中再加入终浓度为20 %的异丙醇；
[0151 ] 5)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection l\ibe上；
[0152] 6)将上述操作步骤5的溶液转移至Spin Column中，12,00化pm离屯、Imin，弃滤液；
[0153] 7)将70化1 的Buffer WB加入Spin Column中，室溫 12,000巧m离屯、30s，弃滤液；
[0154] 8)重复操作步骤7;
[01 巧]9)将Spin Column安置于Collection l\ibe上，室溫 12,000巧m离屯、Imin;
[0156] 10)将Spin Column安置于新的1.5ml的离屯、管上，在Spin Column膜的中央处加入 30]il灭菌蒸馈水或Elution Buffer(预先加热至60°C)，室溫静置Imin;
[0157] 11)室溫 12,000巧111离屯、1111111洗脱0臟；
[0158] 12)琼脂糖凝胶电泳检查，将DNA胆存于-20°C备用。
[0159] (四)连接反应
[0160] 连接反应体系如下（参照pMD?19-T Vector说明书）：
[0161] 表4连接反应体系
[01 创 Table 4 The system of coupled reaction
[0163]
[0164] 反应条件：16°C反应30min。
[01化]经测序重组载体9]\阳19-1'作8?的基因序列，如序列沈9 10備:3所示
[0166] 注:pMD?19-T中的字符TM指商标（trade mark)。
[0167] (五)重组质粒转化感受态细胞E.coli D册a
[0168] 连接产物采用热击法转化大肠杆菌感受态E.coli D册a,方法如下：
[0169] 1)将连接产物10化加入10化L感受态细胞中，充分混匀，冰上放置30min。
[0170] 2)42°(：热击6〇3，再在冰上放置2111^。
[0171 ] 3)加入890化液体LB培养基，37 °C 200r/min震荡培养45min。
[0172] 4)培养结束后，将1(K)化均匀涂于含X-Gal、Amp的100血固体LB培养基平板上，37°C 倒置培养过夜，形成蓝色、白色单菌落。
[0173] 5)在平板上随机挑取6个白色单菌落，分别接入3ml液体LB培养基（含Amp), 37°C 2(K)r/min震荡培养4h;取化1做菌落PCR，检查是否阳性克隆、插入成功。如下表5配制菌落 PCR反应体系，PCR反应条件参见实施例一(S)。
[0174] 表5菌落PCR反应体系
[01 巧]Table 4 The system of colony PCR
[0176]
[0177] 插入成功的菌种取20iU送往成都擎科梓熙生物技术有限公司完成测序工作，其余 菌液用甘油保存。
[017引阳性克隆的鉴定
[0179] 对扩增出的长足大竹象PBP基因片段进行割胶回收后，与PMD19-T vector克隆载 体进行连接，并转化入D册a感受态细胞中，通过蓝白斑筛选得到阳性克隆，并随机挑取白斑 在含Amp的液体培养基中培养，然后进行常规菌落PCR鉴定，如说明书附图2;实验结果显示 随机挑取的8个PBP1克隆均为阳性克隆。
[0180] (六)长足大竹象PBP基因的序列分析
[0181] 将所得的长足大竹象的性信息素结合蛋白的基因序列利用NCBI网址的ORFfind程 序化ttp: //www. ncbi . nlm. n;Lh. gov/gorf/go;rf. html)进行开放阅读框寻找和蛋白氨基酸 序列的预测；利用NCBI网址的BLAST程序化ttp: //blast.ncbi .nlm.n;Lh. gov/Blast. cgi)进 行序列比对；用Si即alP程序化ttp: //www. cbs.化u. dk/services/SignalP/)进行信号肤预 得到长足大竹象性信息素结合蛋白PBP的氨基酸序列，其氨基酸序列如序列表SEQ NO ID. 2所示。用DNAMAN和Microsoft Word 2010做核巧酸与氨基酸序列比对图；用TMHMM程序 化ttp : //www. cbs . dtu. dk/services/TMHMM/)进行跨膜区预测；用compute pI/Mw程序 化t1:p: //web. expasy. org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)预测蛋白质的等电点及质量；用 BioEdit 7.0.1软件进行氨基酸组成分析和亲脂性分析；用化ou&Fasman Seconda巧 St;ruc1:ure Prediction Server预测蛋白的二级结构；用SWISS-M0DE；L构建蛋白质的S维结 构；用ht1:p: //ww. ebi . ac.址/Tools/msa/clustalo/进行多序列比对；用Clustalx及MEGA 4.1程序建立系统进化树。
[0182] 将长足大竹象性信息素结合蛋白PBP1命名为化叫-PBP1。化叫-PBP1基因核巧酸序 列示意图和推导的氨基酸序列示意图如说明书附图3所示，推定的氨基酸序列位于核巧酸 序列之下，*表示终止密码子，下划线为信号肤，圆圈内为保守的半脫氨酸位点，数量为6 个。
[0183] PBP蛋白或PBPs蛋白，包括PBP1或Cb叫-PBP1等。
[0184] 序列测定结果表明，饥叫-PBP1基因包含1个长为43化P的开放阅读框，编码143个 氨基酸残基，其中前17个氨基酸残基为预测的信号肤，预测蛋白分子量为15.841化化，等电 点为4.60;氨基酸组成分析见说明书附图5。将推定的化uq-PBPl氨基酸序列在TMHMM在线预 测网站上预测发现该蛋白没有跨膜区，推定该蛋白为分泌蛋白，如说明书附图4"BioEdit 7.0.1软件预测化uq-PBPl氨基酸组成及亲脂性，结果显示在一端有一个较强的疏水性区域 (A，该区域包括了信号肤），中部有一个较弱的疏水性区域B，其余位置有3个较强的亲水性 区域(CDF)和一个较弱的亲水性区域E，说明该蛋白与疏水性物质和亲水性物质结合均有可 能，但与亲水性物质结合能力更强，推测该蛋白可能是一种多功能运载体，可W与不同类型 物质分子集合;疏水性分析结果见说明书附图6。
[01 化]运用化ou&Fasman SecondaiT Sl:;ruc1:ure Prediction Server对长足大竹象PBP 氨基酸序列的二级结构进行预测，结果表明，Cbuq-PBPl基因中含有a-螺旋122个，(6-折叠48 个，转角18个。总的来说，该蛋白中主要含有a-螺旋，其次是0-折叠，转角的含量最低。二级 结构分析结果见说明书附图7。
[01化]通过SWISS-M0呢L对化叫-PBP1基因 S维结构建模得到长足大竹象PBP的S维结构 模型，如说明书附图8。且从预测结果来看，可W推测该蛋白为气味结合蛋白家族中的性信 息素结合蛋白。
[0187](屯)长足大竹象PBPl氨基酸序列同源性分析
[018引 利用//www. ebi .ac.址/1'0013/1113日/。11131日10/在线比对工具对化叫?8口1和 其他昆虫同源序列进行多序列联配(分析结果见说明书附图9)，其中化ugPBPl与銷翅目、鱗 翅目、脉翅目、双翅目的同源性分别为36.45%、57.73%、65.33%、19.12%，在銷翅目中与 金龟类昆虫具有较高相似性为49.26 %，与稻根象L. oryzopMlusPBP相似性为30.88 %，与 鱗翅目昆虫PBP相似性较低，如与水稻大惧S.inferensPBPl和茎惧S.nonagrioidesPBPl相 似性分别为18.33%、17.78% ;与其他昆虫0BP的相似性为32.47%，较PBP46.83%低。
[0189] 用Mega通过化iglibor-Joining法构建长足大竹象PBP1与6个目昆虫OBPs和PBPs进 化树(如说明书附图10) ,1000次重复结果，数字代表系统发育的距离。
【主权项】
1 ·长足大竹象（0}^1：〇1：抑(3116111813叫1161：丨61161'；[11-1116116￥；[116)性信息素结合蛋白？1^基 因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示。2·权利要求1所述的长足大竹象（Cyrtotrachelusbuqueti Guerin-meneville)性信息 素结合蛋白PBP基因的PCR方法，包括以下步骤： (1) 总RNA提取分离； (2) cDNA第一链的合成； (3) 以序列表SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5所示核苷酸序列为引物，对步骤（2)所述cDNA 进行PCR扩增;扩增条件为:94 °C变性30秒;41.3 °C退火30秒;72 °C延伸30秒，循环35次。3. 根据权利要求2所述的PCR方法，其特征在于，步骤(3)所述扩增条件，在变性之前，先 在94°C保持4分钟进行预变性;在循环之后，于72°C保持7分钟。4. 一种重组质粒pMD19-T/PBP，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:3所示。5. 权利要求1所述的长足大竹象性信息素结合蛋白PBP基因在制备生物防控产品中的 用途。6. 如序列表SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的长足大竹象性信息素结合蛋白PBP基因所 编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。7. 权利要求7所述的长足大竹象性信息素结合蛋白PBP在制备生物防控产品中的用途。
【文档编号】A01P7/04GK106047884SQ201610410149
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】杨桦, 苏婷, 杨伟, 杨春平, 陈章铭, 卢林, 蔡艳
【申请人】四川农业大学