一种用于dna靶标序列改造的引物和方法

一种用于dna靶标序列改造的引物和方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于DNA靶标序列的连接，或者对靶标序列进行一个或多个碱基的取代、插入或缺失的改造引物和方法。本发明的引物的5’端含有Ⅱs型限制性内切酶的识别位点。本发明的方法包括，采用5’端含有Ⅱs型限制性内切酶的识别位点的引物对靶标序列进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行酶切连接，利用设计的互补配对的切割位点被切割后产生的互补的粘性末端，将PCR扩增产物连接起来，即获得改造的靶标序列。本发明巧妙的将Ⅱs型限制性内切酶的特性应用于定点突变中，效率高、时间短、成本低，不仅可进行单点突变、连续多点突变、还能进行酶切位点添加、删除等改造。
【专利说明】-种用于DNA靶标序列改造的引物和方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因突变领域，特别是涉及一种对DNA靶标序列进行连接，或者对靶 标序列进行一个或多个碱基的取代、插入或缺失等改造的引物和方法。

【背景技术】
[0002] 体外定点突变技术是当前生物、医学各领域研究中的一种重要实验手段，能迅速、 1?效的提1? DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是改造、优化基因、探索启动子调节兀 件、进行载体改造等的有效手段，是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具。定 点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活 性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活 性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。
[0003] 目前定点突变的类型主要有以下几种：一是使用寡核苷酸介导的基因突变，指用 含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。该种 方法需要合成一段寡核脱氧核糖核苷酸作为引物，需要模板链为环状，扩增后转化大肠杆 菌后进行筛选。二是盒式突变，是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取 代野生型基因中的相应序列。该种方法需要合成一个DNA双链短片段，需转化大肠杆菌和 质粒提取等操作。三是PCR介导的突变。
[0004] 限制性内切酶分类按照亚基组成、酶切位置、识别位点和辅助因子等不同，传统上 将限制性内切酶分为四大类。其中一种比较常见的II型限制性内切酶是所谓的II S型酶， 如FokI和Alwl，它们的识别位点和切割位点不同，在识别位点之外切开DNA双链，切割的 DNA双链通常是粘性末端。


【发明内容】

[0005] 本发明提供一种用于DNA靶标序列改造的引物，以及基于本发明的引物的，对DNA 靶标序列进行连接，或者对DNA靶标序列进行取代、插入或缺失的方法。本发明是发明人巧 妙运用II s型限制性内切酶的特性而作出的，IIs型限制性内切酶识别位点和切割位点不 同，在识别位点之外切开DNA双链，切割的DNA双链为粘性末端。
[0006] 本发明的一方面公开了一种用于DNA靶标序列改造的引物，该引物的5'端含有 II s型限制性内切酶的识别位点。优选的，本发明的改造包括对靶标序列进行连接，或者对 靶标序列进行一个或多个碱基的取代、插入或缺失。本发明巧妙的将II s型限制性内切酶 的识别位点和切割位点不在同一位置的特点，将II s型限制性内切酶用于DNA靶标序列的 取代、插入、缺失和连接等改造中，由于识别位点位于切割位点的上游，酶切处理后，识别位 点会被切除，而酶切的关键又仅在于识别位点，无论切割位点是怎样的序列都可以进行酶 切，因此，切割位点可以根据需求任意设计；基于上述原理，设计5'端含有II s型限制性内 切酶的识别位点的引物，该引物的切割位点是能够与靶标序列互补结合的序列，在经过酶 切后，识别位点和切割位点上游的碱基被自动切除，仅仅留下切割位点的粘性末端。在本发 明的一种实现方式中，采用了至少两条5'端含有II s型限制性内切酶的识别位点的引物分 别对靶标序列进行PCR扩增，获得至少两段PCR扩增产物，经过酶切后，由互补的粘性末端 将PCR扩增产物连接起来，由于切割位点本身就是靶标上的序列，因此，除了设计需要改造 的一个或多个碱基以外，在经过酶切连接的产物中不会引入其它的碱基，不会影响靶标序 列的完整性。
[0007] 需要说明的是，在需要对靶标序列进行一个或多个碱基的取代、插入或缺失时，本 发明的基本构思是，在带有II S型限制性内切酶的识别位点的引物中引入该一个或多个碱 基的取代、插入或缺失的改造，即将该改造设计于引物中，采用该引物对靶标序列进行扩增 时，扩增产物中即带有该改造，然后通过连接即获得带有该改造的靶标序列。还需要说明的 是，通常情况下，切割位点的序列是与靶标序列配对的，但是如果取代、插入或缺失的一个 或多个碱基是设计在切割位点的序列中时，可以理解，此时的切割位点则不需要完全与靶 标序列配对，甚至切割位点为与靶标序列毫无关系的需要插入的碱基；但是，为了能够将分 别扩增后的靶标序列连接起来，切割位点产生的粘性末端始终是互补的。
[0008] 本发明的一个具体实施例中，靶标序列是指需要进行处理的双链DNA，该双链DNA 包括有义链和反义链；有义链即与转录产生的mRNA序列一致的DNA单链，用以表征靶标序 列；有义链的5'端定义为上游，有义链的3'端定义为下游。
[0009] 本发明的一个具体实施例中，正义引物、正义端点引物、正义改造引物和正义连接 引物是指，与有义链序列相同或者部分相同，能够用于扩增出有义链或者有义链部分序列 的引物；反义引物、反义端点引物、反义改造引物和反义连接引物是指，与有义链互补或部 分互补，能够用以扩增出反义链或者反义链部分序列的引物。
[0010] 本发明的的一个具体实施例中，5'端含有II s型限制性内切酶的识别位点的引物 具有通式序列：
[0011] 5' - (N) X-E「（N) y-E2-E3-3' ；
[0012] 其中，N表不A、G、C、T中的任意喊基，x表不具有x个任意喊基，y表不具有y个 任意碱基；E1区域为II s型限制性内切酶的识别位点序列；E2区域为II s型限制性内切酶 的切割位点序列，E2区域的序列能够与靶标序列互补结合；E3区域为与靶标序列互补结合 的序列。
[0013] 需要说明的是，通常情况下，E2区域即切割位点序列，是能与靶标序列互补配对的 序列，包括能够完全互补配对和部分互补配对的情形，在对靶标序列进行一个或多个碱基 的取代、插入或缺失的改造时，并且，该取代、插入或缺失一个或多个碱基正好设计在该切 割位点时，切割位点的序列也不一定完全与靶标序列配对，或者仅仅是插入的与靶标序列 无关的序列。此外，可以理解，在对靶标序列进行连接处理时，只需要在扩增需要连接的序 列的引物的5'端引入II s型限制性内切酶的识别位点即可，E2区域则是与靶标序列配对的 序列，PCR扩增产物酶切处理时，切割位点E 2区域之前的序列，即"(N) χ-Er (N) y"都会被 切除，然后通过互补的切割位点粘性末端即可将靶标序列连接起来。还需要说明的是，在对 靶标序列进行一个或多个碱基的取代、插入或缺失的改造时，该取代、插入或缺失的一个或 多个碱基是设计于E 2区域和/或E3区域的。
[0014] 本发明的一个具体实施例中，E3区域由18-30个碱基组成，X表示保护碱基的个 数，并且6 > X > 2 ;y表示II s型限制性内切酶的识别位点与切割位点之间的间隔碱基个 数，通常4 > y > 1。需要说明的是，酶切位点前的保护碱基是为了保证酶切的效果，保护 碱基的个数一般为1-10,优选地，保护碱基的个数为2-6。此外，对于多数II s型限制性内 切酶来说，识别位点和切割位点是不在同一处的，因此，识别位点与其下游的切割位点之间 可能存在若干碱基，即本发明一个具体实施例中所说的间隔序列，该间隔序列的碱基类型 不受限制；对于某些II s型限制性内切酶来说识别位点和切割位点也可以是没有间隔碱基 的，因此间隔序列或间隔碱基的具体个数在本发明中不做限定。本发明的一种实施方式中， II s型限制性内切酶为Bsal，在Bsal的识别位点之前具有3bp的保护碱基，在Bsal的识 别位点和切割位点之间具有lbp的间隔碱基；或者II s型限制性内切酶为Bbsl，在Bbsl的 识别位点之前具有3bp的保护碱基，在Bbsl的识别位点和切割位点之间具有2bp的间隔碱 基。
[0015] 进一步的，本发明的一个具体实施例中，IIs型限制性内切酶选自Acul、Alwl、 Acelll、BbvII、Bvel、BslFI、BsoMAI、Bst71I、Bsal、BspMI、BtgZI、Bbsl、BccI、BceAI、 BspCNI、BtsCI、BciVI、BmrI、BpmI、BpuEI、BseRI、BsgI、BsrDI、BtsI、BmuI、BsbI、BbvI、BbvI、 BsmAI、BsmFI、BsmAI、BsmFI、BfuAI、BspQI、Bce83I、Bcefl、HphI、HpyAV、MboII、Plel、Earl、 Ecil、Mmel、NmeAIII、SapI、Hin4II、Lgul、Hgal、SfaNI、FokI、Hgal、SfaNI、Mnll、Sgel 和 FaqI中的至少一种。可以理解，只要是识别位点与切割位点不在同一处，并且切割后能够产 生粘性末端的酶都可以用于实施本发明的一个具体方案，因此，所能够使用的酶并不限于 这些列举。
[0016] 本发明的另一面公开了一种对DNA靶标序列进行改造的方法，该方法包括，依据 靶标序列需要改造所在区域的序列设计本发明的引物，即改造引物；改造所在区域的序列 包括所述改造的上游50bp至下游50bp的序列；改造引物包括一条反义改造引物和一条正 义改造引物，反义改造引物能结合至改造发生处的上游区域，即改造发生处的上游50bp序 列内，正义改造引物能结合至所述改造发生处的下游区域，即改造发生处的下游50bp序列 内；分别利用改造引物的反义引物和正义引物对靶标序列进行扩增，获得扩增产物；对扩 增产物进行酶切连接，获得改造靶标序列。优选的，酶切连接在同一反应体系中进行。优选 的，本发明的改造包括对靶标序列进行碱基的取代、插入和缺失的至少一种。根据本发明的 实施例，DNA靶标序列改造方法一方面是基于引物的设计，可以理解，采用5'端含有II s型 限制性内切酶的识别位点的引物对靶标序列进行扩增后，可以扩增出末端带有II s型限制 性内切酶的识别位点的产物，通过酶切、连接即可将末端具有互补粘性末端的产物连接起 来，从而实现靶标序列的连接改造。由此，利用所述改造方法，只需要进行一次酶切连接反 应，在8h内就可以获得一个或多个碱基的取代、插入或缺失的DNA序列，效率可达100%。由 于II s型限制性内切酶的识别位点和切割位点在不同位置，因此，可以有效的切除设计的 改造以外的引入的碱基，从而保证了改造的靶标序列的完整性。还可以理解，在需要对靶标 序列进行一个或多个碱基的取代、插入或缺失的改造时，在5'端含有II s型限制性内切酶 的识别位点的引物中引入该一个或多个碱基的取代、插入或缺失即可实现改造。所述改造 方法不受碱基序列的限制、不受靶标序列酶切位点的限制，不仅可以精确的进行单点突变、 连续的多点突变、不同部位的多点突变，还能进行载体上的酶切位点的改造，如酶切位点添 力口、删除等，而且该方法时间短、效率高、成本低。需要说明的是，根据本发明的一个具体实 施例，依据靶标序列需要改造所在区域的序列设计的反义改造引物和正义改造引物中，反 义改造引物能结合到靶标序列的位置是位于正义改造引物能结合的位置的上游的，PCR - 般是由正义引物和反义引物组成的一对引物完成双链DNA的指数扩增的，依据靶标序列需 要改造所在区域的序列设计的反义改造引物和正义改造引物，两者一般不能组合用于扩增 出指数增长的双链靶标序列。本发明的一种实现方式中，依据引物结合到靶标的位置的上 下游，前面所说的"一条反义引物"与其上游的正义引物组合用于扩增，"一条正义引物"与 其下游的反义引物组合进行扩增，从而完成对靶标序列不同部分的分别扩增。
[0017] 还需要说明的是，由于扩增后需要酶切、连接获得具有改造的完整的靶标序列，设 计的反义改造引物和正义改造引物在靶标上的结合位点除了设计的改造部分以外的序列 是紧紧相邻的，即中间没有碱基间隔，并且，在插入碱基的改造不是切割位点本身时，反义 改造引物和正义改造引物的切割位点结合靶标的同一区域；可以理解，在该改造为缺失一 个或多个碱基的改造时，设计的反义改造引物和正义改造引物使得靶标序列上与之互补配 对两块区域中间会间隔一个或多个碱基，该间隔的一个或多个碱基即预定要缺失的部分； 无论什么情况，利用靶标序列需要改造所在区域的序列设计的反义改造引物和正义改造引 物扩增靶标后，会使得扩增产物经特定酶酶切后产生互补的粘性末端。
[0018] 根据本发明的一个具体实施例，在对线性的靶标序列进行改造的具体方法包括， 依据线性靶标序列的两端序列设计两条引物，即正义端点引物和反义端点引物；从线性的 DNA序列的5'端到3'端，将正义端点引物、反义改造引物、正义改造引物和反义端点引物依 据能结合至线性的DNA序列上的位置的排序，从正义端点引物开始，依次两两组合分别对 线性的DNA序列进行扩增，获得扩增产物；对扩增产物进行所述酶切连接，获得改造的线性 的DNA序列。其中依次两两组合是指，从正义端点引物开始，按照一条正义引物与位于其下 游的最近的反义引物两两组合，用以对线性的DNA序列进行扩增。
[0019] 需要说明的是，根据本发明一个具体实施例，反义改造引物和正义改造引物的5' 端的II S型限制性内切酶识别位点可以相同，也可以不相同，II S型限制性内切酶识别位点 相同的时候，采用该识别位点对应的II S型限制性内切酶进行酶切；II S型限制性内切酶识 别位点不相同的时候，采用该两个识别位点对应的II S型限制性内切酶进行双酶切。在酶 切后的连接过程中，能够将扩增产物连接起来的关键在于切割位点的粘性末端，而切割位 点与识别位点是分离的，因此，无论识别位点是否相同，只要切割位点是互补的即可。
[0020] 还需要说明的是，根据本发明的一个具体实施例中，通常的正义端点引物和反义 端点引物均为按照常规引物设计方法设计的引物，可以理解，在一些特性的需要中，正义端 点引物和反义端点引物也可以进行一些特殊的设计；比如，在正义端点引物和反义端点引 物中也设计酶切位点等。
[0021] 本发明的一种实现方式中，对线性的DNA序列的扩增包含第一扩增反应和第二扩 增反应，以正义端点引物和反义改造引物为第一引物对进行第一扩增反应，获得第一扩增 产物；以正义改造引物和反义端点引物为第二引物对进行第二扩增反应，获得第二扩增产 物；对第一扩增产物和第二扩增产物进行酶切连接，获得改造的线性DNA序列。
[0022] 需要说明的是，本发明的一个具体实施例中，正义端点引物和反义端点引物是指， 与靶标序列的两个端点匹配的引物，该两条引物组合可以扩增出完整的靶标序列，如果是 经过改造的靶标序列，用该两条引物即可扩增出完整的经过改造的靶标序列。
[0023] 本发明的另外一个实施例中，对环状靶标序列进行改造的具体方法包括，分别采 用正义改造引物和反义改造引物对环状DNA序列进行扩增，获得扩增产物；对扩增产物进 行酶切连接，获得改造的环状的DNA序列。同样的，两条引物的5'端的II s型限制性内切 酶识别位点可以相同也可以不相同，但是，无论怎样，其切割位点始终是互补的。
[0024] 本发明的再一面公开了一种对多个线性DNA序列进行连接的方法，该方法包括， 需要连接的η个线性DNA序列中，共有2*(n-l)个需要连接的末端，依据需要连接的末端的 序列设计引物，获得2* (n-1)条连接引物；分别利用连接引物对所述线性DNA序列进行扩 增，获得η个扩增产物；对η个扩增产物进行酶切连接，获得η个线性序列的连接产物；任选 地，酶切连接在一个反应体系中进行。连接引物的5'端都是带有II s型限制性内切酶识别 位点的，这些识别位点可以相同，也可以不同，如前面所述由于识别位点和切割位点是分离 的，只要用于连接的靶标序列的扩增产物酶切后，其两端产生的粘性末端是不同的，就可以 实现其定向连接，就算采用相同的识别位点，采用相同的酶进行酶切也可以。本发明的一个 实施例中，酶切和连接在一个反应体系中进行。由此，在多个靶标序列中，引入完全相同的 酶切识别位点，仅采用一次酶切连接反应可以有条不紊的实现多个靶标的定向连接。由此， 利用所述连接方法，只需要进行一次酶切连接反应，在8h内就可以获得多个序列的连接产 物，效率可达100%。
[0025] 本发明的一个具体实施例中，对多个靶标序列进行连接的方法还包括，在需要连 接的η个线性DNA序列中，有两个位于连接好的连接产物的末端，依据连接产物的两个末 端的序列设计常规的正义引物和反义引物；对线性DNA序列进行扩增包括，采用常规的正 义引物和反义引物，以及连接引物组合成的η个引物对，分别对η个线性DNA序列进行扩 增，获得所述η个扩增产物；连接引物中，用于扩增第i个线性DNA序列的正义连接引物， 与用于扩增第i-Ι个线性DNA序列的反义连接引物具有互补的切割位点；用于扩增i个 线性DNA序列的反义连接引物，与用于扩增第i+Ι个线性DNA序列的正义连接引物具有互 补的切割位点；利用互补的切割位点实现η个扩增产物的连接，获得所述连接产物，其中， η-I彡i彡2。
[0026] 本发明的具体实施例中，改造位点是设置于引物当中的，因此，可以根据需要自行 设计，不受酶切位点的限制；为使酶切作用于预定改造区域，II s型限制性内切酶选择时不 能直接选含有该II s型限制性内切酶识别位点的靶标序列，若要选择使用某一 IIs限制性 内切酶且靶标带有该酶识别位点，可先选择另一 IIs型限制性内切酶对该靶标进行改造。 需要说明的是，酶切所使用的酶即引物中所带II s型限制性内切酶酶切位点的内切酶，并 且，酶切、连接的方法和条件采用常规的方法和条件即可。本发明的一个具体实施例中，酶 切和连接在同一反应体系中进行。由此，可以减少反应步骤减少操作时间。
[0027] 本发明的一方面提出的DNA靶标序列改造方法中虽然包括有对不同类型的靶标 序列进行不同性质的具体改造，但是，其所使用的改造引物的5'端都含有II s型限制性内 切酶的识别位点，并且都具有通式序列，5' - (N^-Er (N)y-E2-E3-3';其中，N表示A、G、C、 T中的任意碱基，X表示具有X个任意碱基，y表示具有y个任意碱基也区域为II s型限制 性内切酶的识别位点序列；E2区域为II s型限制性内切酶的切割位点序列；E3区域为能与 靶标序列互补结合的序列。
[0028] 并且，本发明的具体实施例中，靶标序列改造方法中所使用的引物中，E3区域由 18-30个碱基组成，X表示保护碱基的个数，并且6 > X > 2 ;y表示II s型限制性内切酶的 识别位点与切割位点之间的间隔碱基个数；IIs型限制性内切酶选自Acul、Alwl、Acelll、 BbvII、BveI、BslFI、BsoMAI、Bst71I、BsaI、BspMI、BtgZI、BbsI、BccI、BceAI、BspCNI、BtsCI、 BciVI、Bmrl、Bpml、BpuEI、BseRI、Bsgl、BsrDI、BtsI、Bmul、Bsbl、Bbvl、Bbvl、BsmAI、BsmFI、 BsmAI、BsmFI、BfuAI、BspQI、Bce83I、Bcefl、HphI、HpyAV、MboII、Plel、Earl、Ecil、Mmel、 NmeAIII、SapI、Hin4II、LguI、HgaI、SfaNI、FokI、HgaI、SfaNI、MnlI、Sgel 和 FaqI 中的至 少一种。
[0029] 本发明再一方面还提出了一种含有引物的试剂盒。试剂盒包含带有II s型限制性 内切酶的识别位点的引物，可以用于DNA靶标序列的改造。不同引物可以以液体或者固体 的方式放置于不同容器中，试剂盒可进一步包括反应溶液体系。
[0030] 本发明的附加方面和优点还将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中 变得明显，或通过本发明的实践了解到。

【专利附图】

【附图说明】
[0031] 图1 :是本发明实施例中改造引物设计示意图；
[0032] 图2 :是本发明实施例中DNA片段定向无缝连接的引物设计示意图。

【具体实施方式】
[0033] 本发明的DNA突变等改造方法和引物，巧妙的利用了 II s型限制性内切酶的识别 位点和酶切位点不在同一位置的特点，选择适用于靶序列的IIs型限制性内切酶，靶序列 中不含该酶识别序列；在需要定点突变的位置左右，设计带有该II s型限制性内切酶的识 别位点，并且切割位点互补的两条引物，并将突变等改造的碱基设计在引物中，通过引物分 别对靶标序列的进行扩增，然后利用II s型限制性内切酶能够将添加的识别位点切除的特 点，经过酶切连接处理后，将靶标序列连接起来，获得带有改造的完整的靶标序列。
[0034] 本发明的一个实施例中，在线性靶标序列的一个比较集中的位置进行单点或多点 的定点突变，因此，在该需要定点突变的位置处设计了一条与线性靶标序列5'端引物匹配 的反义改造引物，以及一条和靶标序列3'端引物匹配的正义改造引物，并且，反义改造引物 和正义改造引物中的切割位点是靶标序列中的互补序列，即在靶标序列上显示的结合位点 中反义引物和正义引物的切割位点是相重叠的，这样对PCR产物进行酶切后即可以产生互 补的粘性末端，从而将片段连接起来，并且这个粘性末端本身就是靶标序列中的互补序列， 因此，不会产生多余添加的碱基。可以理解，如果需要对靶标序列中的多个分散开的不同的 位点进行定点突变，同样，只需要对这些分散开的位点分别设计一对反义改造引物和正义 改造引物，利用DNA片段连接的原理，在带II s型限制性内切酶识别位点的引物中设计预定 的突变碱基，然后引物配对，对靶标序列进行扩增，对扩增产物进行酶切、连接，将各段扩增 产物连接起来即可。
[0035] 需要说明的是，将II s型限制性内切酶的特性应用于DNA的定点突变，以及DNA片 段连接等改造中，是本发明的发明点之一；本发明的DNA定点突变等DNA靶标序列改造方 法，不仅为DNA的定点突变提供了一种新的思路和技巧，并且，在突变时间、效率和成本上 也都有所改进。
[0036] 此外，利用II s型限制性内切酶的识别位点和切割位点不在同一处的特点，本发 明的引物能够用于DNA定点突变、DNA片段删除、DNA小片段插入、DNA片段连接等。可以理 解，在引入了 II s型限制性内切酶的识别位点的引物中，对其中与靶标序列匹配的序列部 分设计突变碱基，然后通过扩增、酶切连接，即可得到定点突变的序列；对于片段删除，在扩 增时选择性的对靶标序列中的片段进行分段扩增，然后将各段连接起来，即可实现DNA片 段的删除；DNA小片段的插入，可以在带II s型限制性内切酶的识别位点的引物中，在其识 别位点之后，在切割位点或者切割位点之后的引物序列中设计插入的序列，然后经过扩增， 酶切连接后即可得到含有插入片段的靶标序列。可以理解，对于DNA大片段的插入，采用与 DNA片段连接的相同原理即可实现，以在一个靶标序列中仅插入一段DNA大片段序列为例， 在需要插入DNA大片段的地方将靶标序列分前后两段分别进行扩增，同时单独扩增需要插 入的DNA大片段，并且，在需要插入的DNA大片段的两端的扩增引物中设计不同的II s型限 制性内切酶切割位点，而在对靶标序列分段扩增的引物中对应的引入II s型限制性内切酶 切割位点，即插入片段的5'端的引物的II s型限制性内切酶切割位点与扩增靶标基因前段 序列的反义引物的II s型限制性内切酶切割位点互补，插入片段的3'端的引物的II s型限 制性内切酶切割位点与扩增靶标基因后段序列的正义引物的II s型限制性内切酶切割位 点互补；最后将扩增产物进行酶切连接即将三段序列连接起来，从而得到插入有DNA大片 段的靶标序列。其中，各引物的内切酶识别位点可以相同，也可以不同。
[0037] 需要说明的是，鉴于线性靶标序列和环状靶标序列的扩增时的特点，本发明分别 提出了线性靶标序列和环状靶标序列的改造方法。
[0038] 另外，本发明还提供了基于II s型限制性内切酶的多个线性DNA序列连接的方法。 对不同的DNA片段，分别设计引物进行PCR扩增，并且在其引物的5'端设计II s型限制性 内切酶的识别位点，并设计互补的切割位点，酶切后，将酶切位点删除，而其互补的切割位 点则将各DNA片段连接起来；而互补的切割位点可以是需要连接的DNA片段的5'端或者3' 端的序列，因此，酶切后，各连接的DNA片段中不会引入其它的序列，从而实现无缝连接。
[0039] 下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅对 本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。
[0040] 实施例一技术方案
[0041] 利用IIs限制性内切酶进行DNA片段的碱基突变，本例中的DNA片段即和引物设 计如图1所示，将原序列中的A突变为T碱基的方法如下：
[0042] 1、选择合适的二型限制性内切酶
[0043] 将靶标序列进行酶切位点分析，选取靶标序列中不包含的二型限制酶，本例以 Bsal为例。Bsal的识别位点和切割位点如下：
[0044]
[0045]

【权利要求】
1. 一种用于DNA靶标序列改造的引物，其特征在于：所述引物的5'端含有II S型限制 性内切酶的识别位点。
2. 根据权利要求1所述的引物，其特征在于：所述引物具有通式序列 y-E2-E3-3,； 其中，N表示A、G、C、T中的任意碱基，x、y为自然数，x、y表示碱基个数； Ei包含所述II s型限制性内切酶的识别位点的碱基； E2包含所述II s型限制性内切酶的切割位点的碱基； E3包含能与所述靶标序列互补配对的碱基。
3. 根据权利要求2所述的引物，其特征在于：所述引物通式序列的E3部分由18-30个 碱基组成， 优选的，所述引物通式序列的（N)x部分表示保护碱基，6 > X > 2 ; 优选的，所述引物通式序列的（N)y部分表示所述II s型限制性内切酶的识别位点与切 割位点之间的间隔碱基。
4. 根据权利要求2所述的引物，其特征在于：所述IIs型限制性内切酶选自Acul、 AlwI、AceIII、BbvII、BveI、BslFI、BsoMAI、Bst71I、BsaI、BspMI、BtgZI、BbsI、BccI、BceAI、 BspCNI、BtsCI、BciVI、BmrI、BpmI、BpuEI、BseRI、BsgI、BsrDI、BtsI、BmuI、BsbI、BbvI、BbvI、 BsmAI、BsmFI、BsmAI、BsmFI、BfuAI、BspQI、Bce83I、Bcefl、HphI、HpyAV、MboII、Plel、Earl、 Ecil、Mmel、NmeAIII、SapI、Hin4II、Lgul、Hgal、SfaNI、FokI、Hgal、SfaNI、Mnll、Sgel 和 FaqI中的至少一种。
5. -种对DNA靶标序列进行改造的方法，其特征在于，包括以下步骤： 依据所述靶标序列需要改造所在区域的序列设计权利要求1-4任一所述的引物，获得 改造引物；所述改造所在区域的序列包括改造发生处的上游50bp至下游50bp的序列； 所述改造引物包括一条反义改造引物和一条正义改造引物，所述反义改造引物能结合 至所述改造发生处的上游区域，所述正义改造引物能结合至所述改造发生处的下游区域； 分别利用所述改造引物的反义改造引物和正义改造引物对所述靶标序列进行扩增，获 得扩增产物； 对所述扩增产物进行酶切连接，获得改造靶标序列； 优选的，所述改造包括对所述靶标序列进行碱基的取代、插入和缺失的至少一种； 其中， 优选的，所述酶切连接在一个反应体系中进行； 优选地，所述酶切连接的反应体系包含IIs型限制性内切酶，所述IIs型限制性内切酶 选自 Acul、Alwl、Acelll、BbvII、Bvel、BslFI、BsoMAI、Bst71I、Bsal、BspMI、BtgZI、Bbsl、 BccI、BceAI、BspCNI、BtsCI、BciVI、Bmrl、Bpml、BpuEI、BseRI、Bsgl、BsrDI、BtsI、Bmul、 Bsbl、Bbvl、Bbvl、BsmAI、BsmFI、BsmAI、BsmFI、BfuAI、BspQI、Bce83I、Bcefl、HphI、HpyAV、 MboII、Plel、Earl、Ecil、Mmel、NmeAIII、SapI、Hin4II、Lgul、Hgal、SfaNI、FokI、Hgal、 SfaNI、Mnll、Sgel 和 FaqI 中的至少一种。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述靶标序列为线性的DNA序列，所述方 法具体包括，依据所述线性的DNA序列的两端序列设计两条引物，获得正义端点引物和反 乂端点引物； 从所述线性的DNA序列的5'端到3'端，将所述正义端点引物、所述反义改造引物、所 述正义改造引物和所述反义端点引物依据能结合至所述线性的DNA序列上的位置的排序， 从所述正义端点引物开始，依次两两组合分别对所述线性的DNA序列进行扩增，获得扩增 产物； 对所述扩增产物进行所述酶切连接，获得改造的线性的DNA序列。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述扩增包含第一扩增反应和第二扩增 反应， 以所述正义端点引物和所述反义改造引物为第一引物对进行所述第一扩增反应，获得 第一扩增产物； 以所述正义改造引物和所述反义端点引物为第二引物对进行所述第二扩增反应，获得 第二扩增产物； 对所述第一扩增产物和所述第二扩增产物进行所述酶切连接，获得所述改造的线性 DNA序列。
8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述靶标序列为环状的DNA序列，所述方 法具体包括， 分别采用所述正义改造引物和所述反义改造引物对所述环状DNA序列进行扩增，获得 扩增产物； 对所述扩增产物进行所述酶切连接，获得改造的环状的DNA序列。
9. 一种对多个线性DNA序列进行连接的方法，所述方法包括： 需要连接的η个线性DNA序列中，共有2* (n-1)个需要连接的末端，依据所述需要连 接的末端的序列设计权利要求1-4任一项所述的引物，获得2* (n-1)条连接引物； 分别利用所述连接引物对所述线性DNA序列进行扩增，获得η个扩增产物； 对所述η个扩增产物进行酶切连接，获得所述η个线性序列的连接产物； 任选地，所述酶切连接在一个反应体系中进行。
10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法还包括，需要连接的η个线性 DNA序列中，有两个位于连接好的所述连接产物的两个末端，依据所述连接产物的两个末端 的序列设计常规的正义引物和反义引物； 所述对所述线性DNA序列进行扩增包括，采用所述常规的正义引物和反义引物，以及 所述连接引物，分别对所述η个线性DNA序列进行扩增，获得所述η个扩增产物； 所述连接引物中，用于扩增第i个线性DNA序列的正义连接引物，与用于扩增第i-Ι个 线性DNA序列的反义连接引物具有互补的切割位点；用于扩增i个线性DNA序列的反义连 接引物，与用于扩增第i+Ι个线性DNA序列的正义连接引物具有互补的切割位点；利用所述 互补的切割位点实现η个扩增产物的连接，获得所述连接产物，其中，n-1 > i > 2。
【文档编号】C12N15/10GK104232628SQ201310233803
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月13日 优先权日:2013年6月13日
【发明者】王磊, 许奇武, 原辉, 张志崇 申请人:深圳华大基因研究院