专利名称：重组生产多肽的改进方法
技术领域：
本发明涉及通过在升高的温度下后温育宿主细胞通过内含体的形式在原核生物中重组生产多肽的改进方法。
背景技术：
在原核生物中，蛋白合成，也指翻译，是在细胞质中的核糖体上进行的。在原核宿主生物如大肠杆菌中表达重组DNA的过程中，得到的重组基因产物/蛋白质在细胞质中以不溶性“内含体”的形式沉淀通常是理想的。在完成发酵和溶解细胞后，分离内含体，任选地纯化，并通过添加变性剂如尿素或盐酸胍溶解其中包含的重组蛋白质，通过还原变性条件完成所述蛋白质的复性(naturation)。这类方法是众所周知的，并且也已经长期成功用于重组蛋白质的工业化制备(参见，如Lee，S.Y.，Trends Biotechnol.14(1996)98-105；Panda，A.K.，等.，J.Biotechnol.75(1999)161-172；Mattes，R.，Semin.Thromb.Hemost.27(2001)325-336；Clark，E.D.，Curr.Opin.Biotechnol.12(2001)202-207；Misawa，S.，和Kumagai，I.，Biopolymers51(1999)297-307；和Lilie，H.，Current Opinion Biotechnol.9(1998)497-501)。
在细胞质中表达的蛋白质作为不溶性蛋白聚集体(内含体)或以可溶性活性或无活性形式而获得的程度基本上通过蛋白质的一级结构(氨基酸序列)确定。蛋白质的一级结构决定蛋白质固有生物物理/生物化学性质，所述性质因此决定蛋白质是否将在微生物的细胞质环境中折叠以形成可溶性生物活性或无活性蛋白质或是否将形成优选高分子量蛋白聚集体。通过选择发酵和表达条件可影响折叠平衡(相对于不溶性蛋白聚集体形成可溶性结构的蛋白)。例如，通过在降低的培养温度和/或非最佳诱导条件(有限的诱导物浓度)下培养原核细胞，可以降低重组质粒编码的蛋白质生物合成速率，从而防止或减少形成不溶性蛋白质聚集体的蛋白质积累(参见例如Kopetzki，E.，等.，Mol.Gen.Genet.216(1989)149-155；和EP 0 300425)。然而，在其它情况，通过内含体的途径制备重组蛋白质是理想的。因此，这类方法的目的是获得高产率的内含体形式的重组蛋白质。然而，关于这一点，应紧记其它参数在原核细胞中重组基因表达过程中同样高度重要，例如这类其它参数尽可能高的实现重组基因表达和防止不理想的翻译后修饰。
发明内容
本发明的目的是在重组表达后增加内含体形式的不溶性多肽的产率。
令人惊讶地，发现不溶性变性的所需重组多肽的产率可通过在发酵后非生理升高的温度下增加温育步骤而显著增加。
因此，本发明的目的是一种重组生产所需多肽的方法，所述重组生产所需多肽是通过在微生物宿主细胞，优选原核宿主细胞中表达编码所述多肽的核酸，在所述宿主细胞的细胞质中形成包含所述多肽的内含体，分离所述内含体，溶解和复性(naturing)多肽来进行，所述方法特征在于在发酵后，在40℃或更高，优选45℃或更高的温度下温育宿主细胞或宿主细胞内容物至少10分钟，优选10-180分钟，随后从宿主细胞中分离不溶性多肽。
依照本发明的方法在水性介质中实施，并且通常在40-60℃，优选在45℃的温度下实施。更高的温度对依照本发明的效果仅有非常小的帮助，并且可能导致多肽的不可逆的变性。
在微生物宿主细胞中重组表达多肽的过程中形成不溶性内含体。内含体是蛋白酶抗性的错折叠所需蛋白质的折射聚集体，其刚过表达编码基因时产生(Misawa，S.，和Kumagai，I.，Biopolymers 51(1999)297-307)。
令人惊讶地，通过在这类非生理升高的温度下温育含所需重组多肽的宿主细胞，所需的多肽以不溶性内含体的形式聚集。因此，可提高在发酵批次的不溶部分中所需多肽的产率。温育的持续时间和温育温度本质上不是关键的。随着温育时间增加和在较高的温育温度下，首先形成更大量的内含体。然而，非常长的温育时间和非常高的温育温度导致例如通过加热产生的不可逆变性而不可逆地改变多肽。目前本领域的普通技术人员通过进行简单的实验可容易地发现重组生产目的多肽的最佳条件。在这类实验中，已经发现例如通过在45℃后温育1小时可实现含重组多肽的内含体的产率的相当大的增加。
适用于重组基因表达的原核宿主细胞是，例如，革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。合适的大肠杆菌菌株是，例如大肠杆菌K12菌株如UT5600，HB101，XL1，X1776和W3110。然而，其它肠细菌科(enterobacteriacea)以及微生物如克雷伯氏菌属(Klesiella)，沙门氏菌属(Salmonella)或枯草芽孢杆菌，假单胞菌属(Pseudomonas)或链霉菌属(Streptomyces)也是适于作为宿主细胞。同样适于作为宿主细胞的是酵母菌株，如酵母菌属(Saccharomyces)，毕赤酵母属(Pichia)，汉逊酵母属(Hansenula)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。
通常将编码多肽的核酸插入到表达载体中。合适的载体对于本领域的普通技术人员而言是熟知的，是例如质粒或噬菌体。
依照本领域的普通技术人员已知的方法同样完成宿主细胞的发酵。通常，首先在发酵温度或高达37℃下温育细胞。在已经获得预定量的细胞后(通过发酵肉汤/细胞悬液的光密度测定)，诱导重组多肽的表达，并进行培养直至到达稳定期(在分批培养的情况下)。完成细胞培养后，收获细胞，通过依照已知方法的溶解和复性分离和处理内含体。将依照本发明的附加的温育步骤适当地插入到该过程中。这意味着，例如，在完成发酵后，简单地增加发酵批次的温度，随后收获细胞。另外，当然，在溶解前或裂解后，也可依照本发明在悬浮液中收获和温育细胞。因此，如果收获细胞悬浮液并从发酵罐中去除，细胞生长受抑制，另外或者如果依照本发明将细胞悬浮液的温度升高至同样抑制宿主细胞进一步生长的40℃和更高，则完成发酵。
发酵温度可以在用于在微生物宿主细胞中重组生产多肽的通常范围内。优选发酵温度为30℃或更低，尤其是如果需要N-末端加工的情况(例如所需多肽的甲硫氨酸的N-末端切割)。在发酵过程中通过宿主细胞的内源性酶酶促进行这种N-末端加工。特别优选地，温度的范围是在18-28℃间，最优选在22-26℃间。
提供下述实施例，参考文献，序列表和附图
以助于理解本发明，本发明的真正范围在后附的权利要求书中阐明。可以理解在未脱离本发明的精神的条件下可对阐述的程序进行修改。
具体实施例方式
原材料依照本发明用于表达基因/多肽的大肠杆菌宿主/载体系统(大肠杆菌宿主菌株和基本载体)在美国专利号6,291,245中描述。
一般方法重组DNA技术如Sambrook，J.，等.，Molecular cloningA laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989中所述使用标准方法操纵DNA。依照制造商的说明书使用分子生物学试剂。
多肽测定通过测定在280nm的光密度(OD)，使用在氨基酸序列的基础上计算的摩尔消光系数评估多聚T-重复融合多肽和干扰素-α-2a的多肽浓度[T-重复ε＝148680cm2/mol；IFN-α-2aε＝18020cm2/mol]。
实施例1T-重复融合基因的合成1.1 T-重复融合基因的基因设计人工T-重复融合基因编码217个氨基酸的、分子量为27,242D的融合多肽。融合多肽由人干扰素-α-2a的N-末端13个氨基酸(MCDLPQTHSLGSR(SEQ ID NO1)；载体肽)和5个拷贝的抑制HIV肽T-1357(WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO2)，靶肽)组成，其通过胰蛋白酶可切割的肽接头(GR)连接。
为了将T-重复结构基因插入到大肠杆菌表达质粒pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel(生产和描述参见实施例2)，将合成的核糖体RBSII结合位点和单一EcoRI切割位点插入到5’末端的上游，将单一CelII限制性内切核酸酶切割位点插入到3’末端的上游。
1.2 T-重复融合基因的基因合成通过化学合成从寡核苷酸制备长约690bp，并且侧接单一EcoRI和CelII限制性内切核酸酶切割位点的RBSII T-重复基因。通过退火和连接寡核苷酸装配双链RBSII T-重复基因，随后作为长691bp的EcoRI/CelII片段克隆到大肠杆菌质粒中。将所需的质粒表示为pT-重复。通过DNA测序证实克隆的RBSII T-重复基因的预定的DNA序列。
实施例2构建大肠杆菌表达质粒2.1构建起始质粒pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel质粒pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel是用于在大肠杆菌中表达干扰素-α-2a(IFN-α-2a)的载体。它是基于IFN-α-2b表达质粒OripBR-URA3-EK-IFN(美国专利号6,291,245)。由于另外存在lacI阻抑物基因和IFN-α-2a基因代替IFN-α-2b基因，pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel不同于OripBR-URA3-EK-IFN。IFN-α-2a和IFN-α-2b仅在第21位的一个氨基酸存在差异(Lys21Arg交换)。lacI阻抑物基因来自质粒pUHA1(Stüber，D.，等.，System for high-level production in Escherichia coli and rapidapplication to epitope mapping，preparation of antibodies，andstructure-function analysis；InImmunological Methods IV(1990)121-152)。依照Mullis，K.B.，和Faloona，F.A.，InMethods Enzymol.155(1987)335-350所述方法，使用引物N1(SEQ ID NO3)和N2(SEQ ID NO4)，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增lacI阻抑物基因，随后作为长约1210bp的NotI片段连接到OripBR-URA3-EK-IFN的单一NotI切割位点。
NotIN15′-AAAAAAGCGGCCGCGACAATTCGCGCGCGAAGGCG-3′NotIN25′-AAAAAAGCGGCCGCTCACTGcCCGCTTTCCAGTCGG-3′2.2构建表达载体pBRori-URA3-LacI-T-重复从质粒pT-重复分离作为长约690bp的EcoRI/CelII片段的T-重复基因(参见实施例1.2)，随后连接到用EcoRI和CelII消化的长约3.1kbp的pBRori-URA3-LacI-RFN载体片段中。通过限制酶图谱鉴定所需的质粒pBRori-URA3-LacI-T-重复，并通过DNA测序再次证实亚克隆的T-重复基因。
实施例33.1在大肠杆菌中表达T-重复基因为了表达依照本发明的融合基因，使用大肠杆菌宿主/载体系统，其通过大肠杆菌营养缺陷体(PyrF)的互补进行无抗生素的质粒选择(美国专利号6,291,245)。
3.2通过在选择性培养基中pyrF营养缺陷体的互补进行转化和细胞生产为了生产用于表达T-重复基因的细胞，用实施例2.2描述的表达质粒pBRori-URA3-LacI-T-重复转化大肠杆菌K12菌株[表示为UT5600(ΔpyrF)。首先在琼脂平板上培养转化的UT5600(ΔpyrF)/pBRori-URA3-LacI-T-重复细胞，随后在含0.5％酪蛋白氨基酸(Difco)的M9基本培养基中振荡培养直至在550nm的光密度(OD550)为0.6-0.9，随后用IPTG(1-5mmol/l终浓度)诱导。在22-37℃进行4-16小时的诱导期后，通过离心收获细胞，用50mmol/l磷酸钾缓冲液，pH6.5洗涤，并保存在-20℃直至进一步处理。
实施例4用于表达IFN-α-2a的转化和细胞生产为了表达IFN-α-2a基因，使用大肠杆菌宿主/载体系统，其通过大肠杆菌营养缺陷体(PyrF)的互补进行无抗生素的质粒选择(美国专利号6,291,245)。
为了生产表达IFN-α-2a的细胞，用实施例2.1描述的表达质粒pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel转化大肠杆菌K12菌株UT5600(ΔpyrF)。首先在琼脂平板上培养转化的UT5600(ΔpyrF)/pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel细胞，随后在22-37℃，在含0.5％酪蛋白氨基酸(Difco)的M9基本培养基中振荡培养直至在550nm的光密度(OD550)为0.6-0.9，随后用IPTG(1-5mmol/l终浓度)诱导。在22-37℃进行4-16小时的诱导期后，通过离心收获细胞，用10mmol/l磷酸钾缓冲液，pH6.8洗涤。
实施例5表达分析通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，用考马斯亮蓝R染料染色和光密度分析，分析在细胞裂解物中在完成细胞培养、发酵和后发酵以后存在的可溶性和不溶性IFN-α-2a和T-重复融合多肽的部分。通过离心实现将细胞裂解物分离成可溶性(上清)和不溶性级分(IB’s和不溶性细胞组分)。
为了这个目的，将来自每个离心的培养基的3个OD550单位(1个OD550＝OD550为1的1ml细胞悬浮液)的细胞沉淀重悬浮在0.25ml10mmol/l磷酸钾缓冲液，pH6.8中，并通过超声处理(在50％强度下2个脉冲30秒)裂解细胞。沉淀(14,000rpm，5分钟)不溶性细胞组分，将上清与1/5体积(vol)5×SDS样品缓冲液(1×SDS样品缓冲液50mmol/lTris-HCl，pH6.8，1％SDS，50mmol/l DTT，10％甘油，0.001％溴酚蓝)混合。将不溶性细胞碎片级分(沉淀)重悬浮在0.3ml 1×SDS样品缓冲液中，并将样品在95℃温育5分钟，并再次离心。随后，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(Laemmli，U.K.，Nature 227(1970)680-685)分离多肽，用考马斯亮蓝R染料染色，随后通过光密度分析相关凝胶条带。
实施例6
6.1重组生产T-重复的大肠杆菌的101细胞高密度发酵预培养为了制备预培养物，在1000ml锥形瓶中，用1ml大肠杆菌UT5600ΔpyrF/pBRori-URA3-lacI-T-重复的甘油原液接种300ml M9+培养基(补充以0.5％酪蛋白氨基酸和每个0.9g/l Trp，Pro和Leu的M9培养基)。将培养物在37℃下，在150rpm的偏心振荡器上温育约6小时，直至达到OD578nm为3.0。
101补料分批主发酵在发酵起始阶段，将预培养物转移到10升发酵罐中。在25℃，在含1.4％代替葡萄糖的甘油，2％酪蛋白氨基酸和每个0.1％的氨基酸Trp，Leu和Pro的已知成分M9盐培养基中培养主培养物，直至OD578nm为20。随后，开始进料甘油酵母剂量(原液30％酵母提取物和33％甘油)培养物，取决于培养物pH值变化，其流速在0.8和3.5ml/分钟间变化，从而避免任何另外添加校正酸(H3PO4，KOH)。将pH维持在pH7.0，通过控制rpm，pO2值保持在50％。
在OD578nm为70时，加入1.5mmol/l IPTG，并诱导基因/多肽表达。在OD578nm为160-180时终止发酵。
6.2重组生产干扰素-α-2a的大肠杆菌的101细胞高密度发酵预培养为了制备预培养物，在2 l锥形瓶中，用约1.5ml大肠杆菌UT5600ΔpyrF/pBRori-URA3-lacI-RFN的甘油原液接种500ml补充以0.5％酪蛋白氨基酸和每个0.9g/l的Trp，Pro和Leu的M9培养基。在37℃和130rpm(振荡器)将培养物温育约10小时，直至达到OD546nm＞2。
发酵为了发酵，使用在酵母-甘油基础上的复合培养基。在25℃和pH为7.0的条件下进行培养。当OD456nm达到10时，起始甘油酵母剂量，其另外包含氨基酸L-甲硫氨酸。在OD546nm为50时用0.5mM IPTG进行诱导。然后，将发酵温度从25℃升至45℃2小时。作为高温的结果，目前为止已经几乎完全以可溶性形式存在的表达产物转换成内含体。随后，收获生物量，并分离多肽。
实施例7发酵后温育细胞完成发酵后，在通过离心收获前，在发酵罐中于45℃温育细胞1小时，同时搅拌。
如实施例5所述，关于表达的多肽(可溶性部分对不溶性部分)分析细胞。
在42℃/1.5小时，50℃/1小时或50℃/45分钟的后温育条件下获得类似的结果。
参考文献目录Clark，E.D.，Curr.Opin.Bioteehnol.12(2001)202-207EP 0 300 425EP-A 0 368 342Kopetzki，E.，et al.，Mol.Gen.Genet.216(1989)149-155Laemmli，U.K.，Nature 227(1970)680-685Lee，S.Y.，Trends Bioteehnol.14(1996)98-105Lilie，H.，Current Opinion Biotechnol.9(1998)497-501Mattes，R.，Semin.Thromb.Hemost.27(2001)325-336Misawa，S.，and Kumagai，I.，Biopolymers 51(1999)297-307Mullis，K.B.，and Faloona，F.A.，Methods Enzymol.155(1987)335-350Panda，A.K.，et al.，J.Biotechnol.75(1999)161-172Sambrook，J.，et al.，Molecular cloningA laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989Stüber，D.，et al.，System for high-level production in Escherichia coli andrapid application to epitope mapping，preparation of antibodies，andstructure-function analysis；InImmunological Methods IV(1990)121-152US Patent No.6,291,245
IN041517-序列表序列表<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司<120>重组生产蛋白质的改进方法<130>21736 EP<140>
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<223>人工序列的描述引物N1<400>3aaaaaagcgg ccgcgacaat tcgcgcgcga aggcg 35<210>4<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物N2<400>4aaaaaagcgg ccgctcactg cccgctttcc agtcgg 3权利要求
1.一种重组生产所需多肽的方法，所述重组生产所需多肽是通过在微生物宿主细胞中表达编码所述多肽的核酸，在所述宿主细胞的细胞质中形成包含所述多肽的内含体，和分离，溶解和复性所述多肽来实现的，所述方法特征在于在发酵后，在40℃或更高温度下温育所述宿主细胞或所述宿主细胞内容物至少10分钟，随后从所述宿主细胞中分离不溶性多肽。
2.依照权利要求1的方法，其特征在于所述发酵在30℃或更低的温度下进行。
3.依照权利要求1或2的方法，其特征在于实施所述温育10-180分钟。
4.依照权利要求1-3的方法，其特征在于在40℃-60℃的温度下实施所述温育。
全文摘要
一种重组生产所需多肽的方法，所述重组生产所需多肽是通过在微生物宿主细胞中表达核酸编码的所述多肽，在所述宿主细胞的细胞质中形成包含所述多肽的内含体，和分离，溶解和复性所述多肽来实现的，其特征在于在发酵后，在40℃或更高温度下温育所述宿主细胞或所述宿主细胞内容物至少10分钟，随后从所述宿主细胞中分离不溶性多肽，该方法提供包含所需多肽的内含体的增加的产率。
文档编号C12P21/02GK1572872SQ20041004937
公开日2005年2月2日 申请日期2004年6月10日 优先权日2003年6月12日
发明者赖纳·格林贝克, 埃哈德·科佩茨基, 弗里德里希·波普 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司