专利名称：套式pcr法检测栉孔扇贝病原类立克次氏体的制作方法
技术领域：
本发明属水产学科生物技术领域，即应用现代分子生物学技术——PCR技术来解决海水养殖栉孔扇贝(拉丁学名为Chlamys farreri)发生的类立克次氏体病的病原检测问题，本发明就是创造了检测引起栉孔扇贝发病死亡的类立克次氏体(英文名称为rickettsia-likeprokaryote，简称RLP或者又称为rickettsia-like organism，简称RLO)的套式PCR(英文名称为nested PCR)检测方法。
背景技术：
扇贝养殖是主导我国贝类养殖甚或整个海水养殖的重要支柱产业，栉孔扇贝又是我国重要的海水养殖扇贝品种，但自1995年以来，栉孔扇贝连续出现大规模死亡，尤其是1997-1999年期间，扇贝的死亡率达90％以上，有的海区100％死亡，1997年北方养殖栉孔扇贝死亡面积达33万亩，造成经济损失15亿元。经查明类立克次氏体是引起它发病的病原。迄今，仅有少量文献报道利用PCR方法检测水产养殖动物类立克次氏体感染。这些报道是包括1993年Kellner-Cousin等对大扇贝(拉丁学名为Pecten maximus)的类立克次氏体和2000年Andree等对鲍类立克次氏体的PCR检测。文献出处为1.Kellner-Cousin K，Le Gall G，Despres B，et al.1993.Genomic DNA cloning ofrickettsia-like organisms(RLO)of Saint-Jacques scallop Pecten maximusEvaluation of prokaryotediagnosis by hybridization with a non-isotopically labeled probe and by polymerase chain reaction.Diseases of Aquatic Organisms，(15)145～152.
2.Andree KB，Friedman CS，Moore JD，Hedrick RP.2000.A polymerase chain reactionassay for the detection of genomic DNA of a rickettsiales-like prokaryote associated with witheringsyndrome in California abalone.Journal of Shellfish Research，19213-218.
现有技术中未曾提供检测引起栉孔扇贝发病死亡的类立克次氏体的有效方法发明内容本发明为防治大批养殖栉孔扇贝疾病的暴发，提供早期、快速、灵敏和特异性强的病原检测方法。
本发明区别于上述文献报道的有一、是对另一种扇贝——栉孔扇贝的类立克次氏体进行PCR检测，因为不同扇贝种类中寄生的类立克次氏体的种类可能是不同的，因此是对一种新的贝类中寄生的新的类立克次氏体的检测；二、是建立新的“套式PCR”检测方法。而上述文献中是用的“普通PCR”检测方法，“套式PCR”法比“普通PCR”法灵敏度更高和特异性更强；三、所述文献中用“普通PCR”检测类立克次氏体，在设计PCR引物时，是基于类立克次氏体基因组DNA的一段随意的未知功能的核酸序列，而本发明的“套式PCR”，在设计PCR引物时，是根据栉孔扇贝类立克次氏体在细菌分类学上具有保守功能的16S rDNA序列中的三段特有的DNA序列设计合成的内引物和外引物作为套式PCR引物的，因此，该方法更具有特异性；而且，用双引物来进行两轮PCR反应，特异性地扩增栉孔扇贝类立克次氏体16SrRNA基因，其灵敏度也大大提高。这是本发明创造最重要的技术特征。
本发明的技术方案，采取以下操作步骤第一、先从扇贝组织中纯化出类立克次氏体类立克次氏体纯化方法第一步差速离心粗提感染类立克次氏体的栉孔扇贝幼贝取回实验室后用无菌的缓冲液(简称PBST，即PBS中加Tween 80成0.1％终浓度。PBS，pH7.4)冲洗，解剖取鳃和外套膜于70％酒精中快速过一下后置于PBS中；用PBS洗三次后于少量PBS中用玻璃匀浆器匀浆，匀浆液用PBS稀释后作高速离心11,000g，40min，4℃(Sorval rotor 05)，弃上清，沉淀用PBS悬浮；悬液作低速离心700g，20min，4℃，保留上清A；沉淀匀浆后作低速离心500g，20min，4℃，保留上清B；合并两次低速离心上清A与B，再次作高速离心，11,000g，40min，4℃，弃上清，沉淀用PBS悬浮；悬液作低速离心500g，20min，4℃，弃沉淀；上清作高速离心，11,000g，40min，4℃后，用少量PBS悬浮沉淀，悬液作低速离心500g，20min，4℃上清即粗提的类立克次氏体。
第二步蔗糖垫离心将粗提的类立克次氏体悬液铺于含23％蔗糖-16％泛影葡胺的溶液(用PBS配制)上4℃下离心15,000g，1h，用少量PBS悬浮沉淀后缓慢地用PBS稀释后作高速离心11000g，40min，4℃；沉淀用少量PBS悬浮即初纯的类立克次氏体，取少量作光镜和透射电镜检查。
第三步泛影葡胺密度梯度离心用PBS分别配制15％，20％，25％，30％，35％的泛影葡胺溶液，于12.5ml的离心管中由下向上，由重向轻小心地铺密度梯度，每一梯度铺1.9ml；将1.5ml初纯的RLO悬液铺于泛影葡胺密度梯度上，作超速离心95,000g，1h，4℃(BeckmanSW41 Ti)，收集20％-25％乳白色类立克次氏体区带，用PBS缓慢稀释后作高速离心25,000g，40min，4℃以去除泛影葡胺、浓缩样品，沉淀用少量PBS悬浮，即纯化的类立克次氏体。
第二、根据我们已完成的栉孔扇贝类立克次氏体在细菌分类学上具有保守功能的16SrDNA序列中的三段特有的DNA序列设计合成内引物和外引物引物序列为外引物Out1.5’-CTTCTTCGGAGGTGTATTCT-3’Out2.5’-TTGCGACCGTACTCCC-3’内引物In1.5’-AATCCGAAGACCCGACGTTTA-3’In2.5’-GCCAAACTTGAGATCGGAAGA-3’第三、制备栉孔扇贝类立克次氏体DNA模板1.类立克次氏体粗提取约1g扇贝消化腺或鳃匀浆，悬浮于1.5ml PBS中，13000rpm离心30分钟，沉淀再次匀浆于350μl的去离子水中，3000rpm离心5min，取上清(约300μl)。
2.模板提取粗提的类立克次氏体中加入300-400μl溶液I，混匀，置室温20min后冰上置10min→4000rpm离心2min→弃上清，加600μl溶液II，混匀，4000rpm离心2min→弃上清，加600μl溶液II再洗一次→4000rpm离心2min，弃上清→37℃烘干(约20-40分钟)后加20μl去离子水，56℃10min→4000rpm离心2min，上清即DNA模板，其中溶液I和溶液II取自军事医学科学院微生物流行病学研究所玻璃酚核酸提取试剂盒。
第四、进行套式PCR套式PCR样品反应体系均为25μl，含2.5μl 10×buffer(Sangon promega，上海)，200mMdNTP，3mM Mg2+，1U Tag酶(Sangon promega，上海)，第一轮反应体系含外引物Out1和Out2各1mM，所提模板3μl；第二轮反应体系含内引物In1和In2各1mM，第一轮PCR产物50倍稀释液1μl；第一轮扩增条件为94℃变性35sec，57℃煺火30sec，72℃延伸30sec，重复30个循环后72℃，7min，循环前95℃预变性3min；第二轮扩增的条件为94℃变性35sec，59℃煺火30sec，72℃延伸20sec，重复30个循环后置72℃，7min，循环前95℃预变性3min；每次检测都平行设一阴性对照，即以水代替模板。
第五、结果观察
第二轮扩增产物用2.5％的琼脂糖胶(含0.5％溴化乙淀)电泳，紫外照射下观察，Marker用TaKaRa的DL2000。
本发明的优点本发明的优点是方法操作简单，灵敏度很高，可检测10个拷贝的栉孔扇贝类立克次氏体16S rDNA分子，成本低，特异性强，因此，运用此方法定期抽样检测养殖扇贝可于早期发现类立克次氏体感染，便于对疾病进行早期的诊断，及时采取措施以预防疾病的暴发。
图1为套式PCR检测栉孔扇贝类立克次氏体的敏感性分析；其中A图为首轮PCR结果，目的产物为779bp；B图为套式PCR结果，目的产物为203bp；M代表分子量标准，每条带的大小(bp)标于右侧；泳道18，以连有栉孔扇贝类立克次氏体16S rDNA的质粒为模板，拷贝数分别为0，0，10，102，103，104，105和106；图2.套式PCR检测栉孔扇贝样品，目的产物为203bp；M代表分子量标准，每条带的大小(bp)标于右侧；泳道1是对照组，水；泳道2是对照组，取自非疫区的健康扇贝；泳道3-9，取自青岛和长岛疫区的扇贝；泳道3，4，5，6，8，9是病贝；泳道7是无典型症状扇贝，且镜检不见类立克次氏体感染的扇贝。
具体实施例方式
按上述技术方案检测操作步骤进行的实施例的结果套式PCR检测了35个扇贝样品，其中套式PCR检测阳性结果只出现于取自青岛和长岛发生大量死亡的养殖场样品，鳃、外套膜、消化腺都呈阳性结果，消化腺阳性结果最强；对这些样品进行镜检大部分可见类立克次氏体感染，但也有个别扇贝外表正常无明显症状，镜检不见类立克次氏体感染，而PCR检测则出现阳性带，虽然目的带较弱，但清晰可见(见图2)。
权利要求
1.套式PCR法检测栉孔扇贝病原类立克次氏体，其特征在于检测步骤如下一、先从扇贝组织中纯化出类立克次氏体类立克次氏体纯化方法1、差速离心粗提感染类立克次氏体的栉孔扇贝幼贝用无菌的缓冲液PBST，PBS中加Tween 80成0.1％终浓度，PBS，pH7.4冲洗，解剖取鳃和外套膜于70％酒精中快速过一下后置于PBS中，用PBS洗三次后于少量PBS中用玻璃匀浆器匀浆，匀浆液用PBS稀释后作高速离心11,000g、40min、4℃，Sorval rotor 05，弃上清，沉淀用PBS悬浮，悬液作低速离心700g，20min，4℃，保留上清A，沉淀匀浆后作低速离心500g，20min，4℃，保留上清B，合并两次低速离心上清A与B，再次作高速离心，11,000g，40min，4℃，弃上清，沉淀用PBS悬浮，悬液作低速离心500g，20min，4℃，弃沉淀，上清作高速离心，11,000g，40min，4℃后，用少量PBS悬浮沉淀，悬液作低速离心500g，20min，4℃上清即粗提的类立克次氏体；2、蔗糖垫离心将粗提的类立克次氏体悬液铺于含23％蔗糖-16％泛影葡胺的溶液上4℃下离心15,000g，1h，23％蔗糖-16％泛影葡胺的溶液用PBS配制，再用少量PBS悬浮沉淀后缓慢地用PBS稀释后作高速离心11000g，40min，4℃，沉淀用少量PBS悬浮即初纯的类立克次氏体，取少量作光镜和透射电镜检查；3、泛影葡胺密度梯度离心用PBS分别配制15％，20％，25％，30％，35％的泛影葡胺溶液，于12.5ml的离心管中由下向上，由重向轻小心地铺密度梯度，每一梯度铺1.9ml，将1.5ml初纯的RLO悬液铺于泛影葡胺密度梯度上，作超速离心95,000g，1h，4℃Beckman SW41 Ti，收集20％-25％乳白色类立克次氏体区带，用PBS缓慢稀释后作高速离心25,000g，40min，4℃以去除泛影葡胺、浓缩样品，沉淀用少量PBS悬浮，即纯化的类立克次氏体；二、根据我们已完成的栉孔扇贝类立克次氏体在细菌分类学上具有保守功能的16S rDNA序列中的三段特有的DNA序列设计合成内引物和外引物引物序列为外引物Out1.5’-CTTCTTCGGAGGTGTATTCT-3’Out2.5’-TTGCGACCGTACTCCC-3’内引物In1.5’-AATCCGAAGACCCGACGTTTA-3’In2.5’-GCCAAACTTGAGATCGGAAGA-3’；三、制备栉孔扇贝类立克次氏体DNA模板1、类立克次氏体粗提取约1g扇贝消化腺或鳃匀浆，悬浮于1.5ml PBS中，13000rpm离心30分钟，沉淀再次匀浆于350μl的去离子水中，3000rpm离心5min，取上清300μl；2、模板提取粗提的类立克次氏体中加入300-400μl溶液I，混匀，置室温20min后冰上置10min→4000rpm离心2min→弃上清，加600μl溶液II，混匀，4000rpm离心2min→弃上清，加600μl溶液II再洗一次→4000rpm离心2min，弃上清→37℃烘干20-40分钟后加20μl去离子水，56℃ 10min→4000rpm离心2min，上清即DNA模板，其中溶液I和溶液II取自军事医学科学院微生物流行病学研究所玻璃酚核酸提取试剂盒；四、进行套式PCR套式PCR样品反应体系均为25μl，含2.5μl 10×buffer Sangon promega，上海，200mMdNTP，3mM Mg2+，1U Tag酶Sangon promega，上海，第一轮反应体系含外引物Out1和Out2各1mM，所提模板3μl，第二轮反应体系含内引物In1和In2各1mM，第一轮PCR产物50倍稀释液1μl，第一轮扩增条件为94℃变性35sec，57℃煺火30sec，72℃延伸30sec，重复30个循环后72℃，7min，循环前95℃预变性3min，第二轮扩增的条件为94℃变性35sec，59℃煺火30sec，72℃延伸20sec，重复30个循环后置72℃，7min，循环前95℃预变性3min，每次检测都平行设一阴性对照，即以水代替模板；五、结果观察第二轮扩增产物用2.5％的琼脂糖胶含0.5％溴化乙淀电泳，紫外照射下观察，Marker用TaKaRa的DL2000。
全文摘要
套式PCR法检测栉孔扇贝病原类立克次氏体，主要解决能早期、快速、灵敏和特异性强的检测引起栉孔扇贝发病死亡的类立克次氏体。其检测方法，首先从扇贝组织中纯化出类立克次氏体；然后根据我们已完成的栉孔扇贝类立克次氏体在细菌分类学上具有保守功能的16SrDNA序列中的三段特有的DNA序列设计合成内引物和外引物，引物序列为外引物Out1. 5’－CTTCTTCGGAGGTGTATTCT－3’，Out2.5’－T TGCGACCGTACTCCC－3’；内引物In1.5’－AATCCGAA GACCCGACGTTTA－3’，In2.5’－GCCAAACTTGAGA TCGGAAGA－3’。制备栉孔扇贝类立克次氏体DNA模板；最后进行套式PCR扩增来检测栉孔扇贝病原类立克次氏体。应用本发明定期抽样检测，可早期发现类立克次氏体感染，便于对疾病早期诊断，及时采取措施预防疾病的暴发。
文档编号C12Q1/68GK1635149SQ200410066929
公开日2005年7月6日 申请日期2004年9月30日 优先权日2004年9月30日
发明者吴信忠, 李登峰 申请人:浙江大学, 中国科学院南海海洋研究所