专利名称：蝴蝶兰查尔酮合酶编码序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、酶学。生理学以及基因工程等领域，具体涉及一种在蝴蝶兰中表达的chalcone合酶(蝴蝶兰查尔酮合酶，chalcone synthase，CHS)及其核酸序列。本发明还涉及该蛋白和核酸序列的制备方法和用途。
背景技术：
植物花冠的颜色由色素种类来决定，主要是黄酮类色素。而合成其的关键酶为苯基苯乙烯酮合成酶(CHS)，即查尔酮合成酶以及苯类氨酸氨基裂解酶(PAL)。目前多采用反义RNA技术对花卉品质进行改良，荷兰学者首先从矮牵牛中分离出CHS的cDNA，利用反义RNA技术，转化矮牵牛花后获得转基因植株。花色从原来的紫色变成粉红色并有白色，有些植株花全呈白色，这样矮牵牛花色增多，观赏价值得以提高。(napoli等plantsell，1990，2279-289)。Gutterson等也从菊花中分离出CHS基因，并以反义和正义方向导入菊花(开粉红色花)品种，得到开白花与淡粉色的转基因植株。从多种植物中克隆了与花青素代谢有关的查尔酮合酶基因，并将它转入矮牵牛，获得的转基因矮牵牛花色发生了改变，出现了自然界没有的变异。转查尔酮合酶基因矮牵牛已通过农业部的安全性审批并可进入商业化生产。
在本发明中，我们在兰科(Arethusa)植物蝴蝶兰(Phalaenopsis spp.)中克隆到长春花查尔酮合酶基因的同源基因PsCHS。
在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及蝴蝶兰chalcone(查尔酮)合酶序列及其核酸序列。
发明内容
本发明的第一目的就是提供一种新的蝴蝶兰基因Ps-chalcone(PsCHS)，该基因是一个蝴蝶兰Ps-chalcone合酶基因。
本发明的第二目的是提供一种新的蝴蝶兰蛋白Ps-chalcone。
本发明的第三目的是提供一种利用重组技术生产上述新的蝴蝶兰Ps-chalcone蛋白和核酸序列的方法。
本发明还提供了这种蝴蝶兰Ps-chalcone蛋白多肽合编码序列在利用转基因技术控制植物花色上的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括编码具有蝴蝶兰Ps-chalcone合酶活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第501-561位的核苷酸序列由至少85％的同源性；或者所述的或者所述的核苷酸序列能在中度严禁条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第501-561的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。更加地，所述的序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第501-561位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种鉴定蝴蝶兰Ps-chalcone蛋白质多肽，它包括具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片断，或其活性衍生物。较佳地，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
在本发明的另一方面，还提供了一种载体，它包含了上述的DNA分子。
在本发明的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是BL21和烟草。
在本发明的另一方面，还提供了一种产生具有蝴蝶兰chalcone合酶多肽的方法，其步骤如下(1)将编码具有蝴蝶兰chalcone合酶活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连接于表达调控序列，形成chalcone合酶表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第501-561位的核苷酸序列由至少85％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入原核宿主细胞，形成蝴蝶兰Ps-chalcone合酶的重组细胞；(3)在适合表达蝴蝶兰chalcone合酶活性多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)鉴定蝴蝶兰chalcone合酶活性多肽在本发明的另一方面，还提供了一种利用转基因技术将编码具有蝴蝶兰chalcone合酶活性的核苷酸序列转化入植物以改变花色的方法，其步骤如下(1)将蝴蝶兰chalcone合酶活性的核苷酸序列可操作地连于植物表达调控序列，形成含有蝴蝶兰chalcone合酶基因的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第501-561位的核苷酸序列由至少85％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共培养，在25±2℃条件下，暗培养2天后，通过抗生素筛选，获得蝴蝶兰chalcone合酶基因的转化细胞并再生转基因植株。含有蝴蝶兰chalcone合酶基因的转基因植株花色有一定的变化。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片断已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片断已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“蝴蝶兰Ps-chalcone合酶编码序列”指编码具有蝴蝶兰Ps-chalcone合酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第501-561位的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1中第501-561位的核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中第501-561位的核苷酸序列同源性低至约85％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更加的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第501-561位的核苷酸序列的同源性至少85％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的蝴蝶兰Ps-chalcone合酶相同功能的蛋白的SEQID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。
在本发明中，术语“宿主细胞”为原核或真核细胞。常用的原核宿主细胞包括BL21，常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其他植物细胞。
还可用Southern印迹法技术分析蝴蝶兰Ps-chalcone合酶基因在细胞中存在的数量。
此外，本发明还提供了一种可用于作探针的核酸分子，该分子通常具有蝴蝶兰Ps-chalcone合酶核苷酸编码序列的1-1396个连续核苷酸，该探针可用于检测样品中是否存在编码蝴蝶兰Ps-chalcone的核酸分子。
本发明的蝴蝶兰Ps-chalcone合酶核苷酸全长序列或其片断通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后将各次扩增出的片断按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，在转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离到有关序列。
表1为本发明的蝴蝶兰Ps-chalcone合酶与一热带兰Bromheadia finlaysoniana查尔酮合酶的核苷酸序列(GenBank Accession No.AAB62876.)的同源比较(FASTA)表。
表2为本发明的蝴蝶兰Ps-chalcone合酶与热带兰Bromheadia finlaysoniana查尔酮合酶的氨基酸序列(GenBank Accession No.AAB62876.1)的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“*”标出。
图1为转基因蝴蝶兰植株的Southern blot鉴定，1-4为转基因植株。
图2为转基因植株花式表现型。其中T1、T2、T4、T6为超表达植株，T3、T6为目的基因抑制表达植株。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验手册(New YorkCold Spring Harbor Labortary Press，1989)中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1，蝴蝶兰Chalcone synthase基因的克隆1.采取温室生长的蝴蝶兰花瓣立即置于液氮中冷冻保存，应该注意到本实验所选取的材料与选用的蝴蝶兰品种材料没有必然的联系。
2.DNA的提取取部分组织，用研钵研碎，加入盛有预热的裂解液的50ml离心管，65℃保温40分钟，离心。上清中加入RNaseA(0.5μg/ml)，65℃消化RNA1小时；以等体积的酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)抽一次蛋白，以乙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤两遍，最后用TE溶液溶解DNA。用0.8％琼脂糖凝胶检测DNA的质量。
3.全长基因的克隆根据已报道的Chalcone synthase基因的保守序列，设计引物，采用PCR方法从蝴蝶兰基因组DNA中扩增出一条1.4kb左右的条带。将PCR产物回收，连接到T-载体上，用SP6和T7做为通用引物进行测序。将测序结果提交至NCBI非冗余数据库，BLAST结果表明该序列包含Chalcone synthase基因的两个外显子和一个内含子，为全长蝴蝶兰Chalconesynthase基因。
实施例2，蝴蝶兰Chalcone synthase基因的序列信息与同源性分析本发明新的蝴蝶兰Chalcone synthase基因的长度为1396bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中外显子I位于49-226位核苷酸，外显子II位于336-1330位核苷酸，内含子长度为109bp。该基因编码的多肽由390个氨基酸残基组成，分子量45308.26道尔顿，PI为6.119。详细序列见SEQ ID NO.2。
将蝴蝶兰Chalcone synhase全长基因的编码区序列及其编码的蛋白质序列用BLAST程序再Non-redundant GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GeneBank CDStranslations+PDB+SwissPort+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检测，结果发现它与Bromheadia finlaysoniana Chalcone synthase基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它与Bromheadia finlaysoniana Chalcone synthase基因的mRNA编码序列(GeneBank AccessionNo.AF007099.1)有一定的相同性(见表2)，在氨基酸水平上，它与Bromheadia finlaysoniana Chalcone synthase蛋白的第4位到第390位的氨基酸残基有85％的相似性(见表3)。由上可见，该Chalcone synhase基因与Bromheadia finlaysonianaChalcone synthae基因存在较高的同源性，可以认为两者在功能上也有很高的相似性。
BLAST的结果表明从蝴蝶兰中得到的基因确为查尔酮合酶基因。已知的查尔酮合酶基因参与类黄酮的合成，催化由对羟基桂皮酰辅酶A向四羟基查尔酮的转化(Stich等，Planta，1992，187103-108)，是类黄酮合成途径的限速酶，故推测次基因具有相同的功能。
实施例3，蝴蝶兰Chalcone synthase基因的原核表达在该实施例中，将全长的蝴蝶兰Chalcone synthase编码序列构建入原核表达载体之中，以表达重组蛋白。
原核表达的构建以及转化原核表达宿主菌感受态细胞根据蝴蝶兰Chalcone synthase基因序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物(分别对应于编码序列5’和3’端的约20个以上的氨基酸)，并在正反向引物上分别引入限制型内切酶位点，以便构建表达载体。以实施例1中的PCR产物为模板进行PCR扩增。将Chalcone synthase基因在保证阅读框正确的前提下克隆至原核表达质粒PET-24α(+)(Nnovagen)。转化大肠杆菌DH5α菌株，经PCR鉴定后测序确认，然后再抽提质粒，转化到原核表达宿主菌BL21的感受态细胞中，涂LB+Kan(50mg/L)的平板，37℃培养1d。
蝴蝶兰Chalcone synthase蛋白的表达随机挑取长出的单菌落，再LB+Kan(50mg/L)的液体培养基37℃培养过夜，吸取50μl然后煮沸5min。12000rpm离心1min，取上清为模板。用Chalcone synthase基因的引物进行PCR扩增。同时以未转化的宿主菌做为对照。观察重组子中是否扩增出预期的蝴蝶兰Chalcone synthase基因片段。将PCR阳性的重组菌接种于5ml的LB+Kan(50mg/L)培养基中，37℃振荡培养(250rpm)3h至OD600＝0.6，取1ml菌液做为对照(诱导前)，在剩下的4ml菌液中加入IPTG使终浓度为1Mm，继续37℃振荡培养(250rpm)3h，吸取1ml菌液，两次吸取的菌液12000rpm离心5min。沉淀用100μl 1×样品缓冲液重悬，取10μl进行SDS-PAGE检测表达产物。
实施例4，蝴蝶兰Chalcone synhase基因在烟草细胞中进行真核表达及转基因植株的表型鉴定含目的基因(蝴蝶兰Chalcone sytnhase基因)表达载体的构建根据蝴蝶兰Chalcone synthase全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反向引物上分别引入限制性内切酶识别位点(视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将蝴蝶兰Chalcone synthase基因克隆到双元表达载体pBI121中，在保证阅读框架的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中。利用叶圆盘法技术转化模式植物烟草。
利用叶盘法转化烟草1、用灭菌牙签挑取YEB选择培养基上的阳性克隆，接种于2mlYEB液体(利福平40mg/L，链霉素50mg/L，卡那霉素50mg/L)，28℃200rpm振荡培养24-36h；2、室温下4000g离心10min；3、弃上清，菌体用1/2MS液体培养基重悬，稀释到原体积的5-20倍，使OD600＝0.5左右；4、取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去其叶主脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；5、将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；6、将侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；7、将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+cef250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天见愈伤组织形成；8、约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基上(1/2MS+NAA(0.5mg/L+Kan50mg/L+cef250mg/L)；9、待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，温室中培养。
对转基因植株进行分子鉴定以CTAB方法大量抽提经初步鉴定的部分转基因植株的基因组DNA，以转pBI121空载体的烟草作为负对照，以HindIII酶切总DNA约10μg)，以0.8％琼脂糖凝胶进行片段分离，将DNA转到Hybond-N+尼龙膜上，固定；以外源基因片段为探针进行Southern杂交，鉴定外源基因在转基因植物中的拷贝数，结果表明，外源基因在转基因植株中均为单拷贝插入(部分结果)。
转基因植株进行表型鉴定总共得到约100棵转基因植株，其中有六棵转基因烟草的花色有显著变化，四棵烟草较对照烟草花色有显著加深，推测外源Chalcone synthase基因在宿主烟草中实现了超量表达，增加了烟草花瓣中的花色素含量；其他2株花色较对照浅，推测由于外源Chalconesynthase基因与烟草内源Chalcone synthase基因在核苷酸水平上有一定的同源性，因此发生了RNA抑制，导致内源Chalcone synthase基因沉默，降低了花瓣中花色素的含量，使花瓣颜色变浅。试验结果表明，实施例1中得到的蝴蝶兰Chalcone synthase基因为有功能的基因，可以用于利用转基因技术改良花卉花色品种的研究和产业化中。
表1蝴蝶兰Chalcone sytnhase基因核苷酸序列与Bromheadia finlaysoniana Chalconesytnhase基因核苷酸序列的同源性比较gi|2253118|gb|AF007099.1|AF007099Bromheadia finlaysoniana clone OCHS8chalcone synthase(CHS)mRNA，complete cdsLength＝1439Score＝50.1bits(25)，Expect＝0.014Identities＝52/61(85％)Strand＝Plus/PlusQuery501 aggactgggggcagcctaaatcgcgtataactcacctaatcttctgcaccacgagcggca 560|||| ||||| || || ||||| || |||||||| || |||||||||||||||||||||Sbjct377 aggaatggggacaccccaaatctcgcataactcatctcatcttctgcaccaccagcggca 436Query561 t 561|Sbjct437 t 437Query为蝴蝶兰Chalcone sytnhase基因核苷酸序列Sbjct为Bromheadia finlaysoniana Chalcone sytnhase基因核苷酸序列(GeneBank AccessionNo.AF007099.1)表2蝴蝶兰Chalcone synthase基因编码的蛋白质序列与Bromheadia finlaysoniana Chalconesytnhase的氨基酸序列的同源性比较
gi|2253119|gb|AAB62876.1|chalcone synthase[Bromheadia finlaysoniana]gi|5921766|sp|023731|CHS8_BROFICHALCONE SYNTHASE 8(NARINGENIN-CHALCONESYNTHASE 8)Length＝394Score＝517bits(1331)，Expect＝e-145Identities＝250/388(64％)，Positives＝310/388(79％)，Gaps＝1/388(0％)Query3 SLESIKKAPRADGFASILAIGRANPDNIIEQSAYPDFYFRVTNSEHLVDLKKKFQRICEK 62++E I++A RA+G A++LAIG + P N + Q+ YPD+YFR+T SEHL +LK+KF+R+C+KSbjct4 AMEEIRQAQRAEGPAAVLAIGTSTPPNALYQADYPDYYFRITKSEHLTELKEKFKRMCDK 63Query63 TAIRKRHFVWNEEFLTANPCFSTFMDKSLNVRQEVAISEIPKLGAKAATKAIEDWGQPKS 122+ I+KR+EE L NPFM SL+ RQ++ ++E+PKL +AA +AI++WG PKSSbjct64 SMIKKRYMYLTEEILKENPNICAFMAPSLDARQDIVVTEVPKLAKEAAARAIKEWGHPKS 123Query123 RITHLIFCTTSGMDLPGADYQLTQILGLNPNVERVMLYQQGCFAGGTTLRLAKCLAESRK 182RITHLIFCTTSG+D+PGADYQLT++LGL P+V R MLYQQGCFAGGT LRLAK LAE+Sbjct124 RITHLIFCTTSGIDMPGADYQLTRLLGLRPSVNRFMLYQQGCFAGGTVLRLAKDLAENNA 183Query183 GARVLVVCAETTTVLFRAPSEEHQDDLVTQALFADGASAVIVGADPDEAADERASFVIVS 242GARVLVVC+E T V FR PSE H D LV QALF DGA+A+IVG+DPD +A ER F +VSSbjct184 GARVLVVCSEITAVTFRGPSESHLDSLVGQALFGDGAAAIIVGSDPD-SATERPLFQLVS 242Query243 TSQVLLPDSAGAIGGHVSEGGLLATLHRDVPQIVSKNVGKCLEEAFTPFGISDWNSIFWV 302SQ +LP+S GAI GH+ E GL L +DVP ++SKN+ KCL +AF P G+ DWNSIFW+Sbjct243 ASQTILPESEGAIDGHLREIGLTFHLLKDVPGLISKNIQKCLLDAFKPLGVHDWNSIFWI 302Query303 PHPGGRAILDQVEERVGLKPEKLSVSRHVLAEYGNMSSVCVHFALDEMRKRSANEGKATT 362HPGG AILDQVE ++GLK EKL+ SR+VLAEYGNMSS CV F LDEMR+RSA G+ATTSbjct303 AHPGGPAILDQVEIKLGLKAEKLAASRNVLAEYGNMSSACVLFILDEMRRRSAEAGQATT 362Query363 GEGLEWGVLFGFGPGLTVETVVLRSVPL 390
GEGLEWGVLFGFGPGLTVET+VLRSVP+Sbjct363 GEGLEWGVLFGFGPGLTVETIVLRSVPI 390Query为蝴蝶兰Chalcone sytnhase蛋白氨基酸序列Sbjct为Bromheadia finlaysoniana Chalcone sytnhase蛋白氨基酸序列(GeneBank AccessionNo.AAB62876.1)本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度1396bp(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型核酸(iii)序列描述SEQ ID NO.11attcacctttccccttcctcaaaaacaaaatcacaaaaacttcccaccatgctgagcctt61 gaatccatcaagaaggccccaagagccgacggcttcgcctccattttggccatcgggaga121 gcgaacccagacaatattattgaacagagcgcctacccagacttctactttcgtgtcacc181 aatagcgagcacttggtcgacctcaaaaagaaatttcaacgcatctgtaagtcatctcaa241 ttatctaaagtctgttctaatataatcgatctcctttaatagcattcctcatattataaa301 caggctagagttaataaatttataataatcttcaggtgagaagacggcaatcagaaagcg361 ccactttgtctggaacgaggaatttctcactgcaaacccttgcttcagcacattcatgga421 caaatctttaaacgtaaggcaagaggttgctataagcgagataccaaagctgggcgcgaa481 ggcggccaccaaggctatcgaggactgggggcagcctaaatcgcgtataactcacctaat541 cttctgcaccacgagcggcatggacttacctggtgctgattaccagctcacccaaatcct601 tggcctcaacccaaatgttgagcgtgtcatgctctatcagcagggctgttttgctggcgg661 aaccacgcttcgcctggccaagtgtcttgctgagagccgcaaaggcgcacgagttctagt721 ggtttgtgcagagaccaccaccgtgttatttcgtgcaccttctgaggagcatcaggatga781 ccttgtgacccaggctttatttgccgatggtgcctctgcagttatagtgggcgccgatcc841 agatgaggcggctgatgagcgggcgagtttcgtcatagtttcaacatctcaagtcttact
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权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有蝴蝶兰chalcone合酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第501-561位的核苷酸序列由至少85％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严禁条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第501-561位的核苷酸系列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第501-561位的核苷酸序列。
4.一种分离出的蝴蝶兰chalcone合酶，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片断，或其活性衍生物。
5.一种载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA。
6.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞，其特征在于它是原核或真核细胞。
7.一种产生具有蝴蝶兰chalcone合酶活性的多肽的方法，其特征在于其步骤如下(1)将编码具有蝴蝶兰chalcone合酶活性的多肽的纯化的核苷酸序列连接于表达调控序列，形成蝴蝶兰chalcone合酶表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第501-561位的核苷酸序列由至少85％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成蝴蝶兰chalcone合酶的重组细胞；(3)在适合表达蝴蝶兰chalcone合酶多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)鉴定具有蝴蝶兰chalcone合酶活性的多肽。
8.一种利用转基因技术将编码具有蝴蝶兰chalcone合酶活性的核苷酸序列转化入植物以改变花式的方法，其特征在于具体步骤如下(1)将蝴蝶兰chalcone合酶活性的核苷酸序列可操作地连接于植物表达调控序列，形成含有从核苷酸第501-561位的核苷酸序列由至少85％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入植物细胞；(3)通过筛选，获得转化细胞并最终再生转基因植株。
9.一种核酸分子，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA分子中501-561个连续核苷酸。
10.一种用于检测样品中是否存在蝴蝶兰chalcone合酶核苷酸序列的方法，其特征在于它包括用权利要求9所述探针与样品杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是植物基因组DNA，经限制性内切酶酶切后的核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供了一种在蝴蝶兰中表达的新的chalcone合酶、编码序列及其在改良植物花色上的应用。本发明涉及包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体。还涉及所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物。本发明将所说基因在植物中表达，所获得的转基因植物具有花色改良的特性。
文档编号C12Q1/68GK1597960SQ20041006666
公开日2005年3月23日 申请日期2004年9月24日 优先权日2004年9月24日
发明者明凤, 韩颖颖, 沈大棱, 叶鸣明 申请人:复旦大学