专利名称：丙型肝炎病毒多表位抗原的基因克隆及其编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药工程技术领域，是丙型肝炎病毒多表位抗原的基因克隆hcvme及其编码序列HCVME在丙型肝炎疫苗制备中的应用。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)过去曾称为肠道外(经血)传播的非甲非乙型肝炎(NANBH)病毒，1989年确定其3′端约75％的基因序列后才正式命名。它有世界性分布、传播途径广、基因组易变异、转慢率高、能与其它各型肝炎混合感染、引起肝硬变及肝细胞癌等特点。HCV属于黄病毒科，病毒基因组为线性单股RNA，长约9500核苷酸，由5′端非编码区、核心(C)区、包膜(E)区、非结构区1～5(NS1～5)组成。HCV基因组高度变异，在同一感染者体内常以准毒株形式存在。研究报道及本实验室前期的研究工作表明，HCV E2蛋白中存在中和表位，其相应的中和抗体不仅可以阻止病毒对靶细胞的粘附，而且在感染痊愈过程中起着重要作用。同时，HCV各组成蛋白中的Th(辅助性T细胞)和CTL(细胞毒性T细胞)抗原表位诱导的T细胞反应及外周血和肝脏内的Th1/Th2表型对感染后病毒的清除及“顿挫感染”起决定性作用。
分析HCV疫苗的研究现状，可以看出，因HCV无法在体外大量扩增，故传统的减毒/灭活疫苗不能研制。重组亚单位疫苗研究中，虽然明确E蛋白中存在诱导中和抗体的抗原决定簇，但其交叉保护性较低，面临HCV的高变异而失去中和突变株的能力；虽然HCV的各种蛋白成分中存在CTL表位，但重组亚单位蛋白的免疫又会出现许多类似HCV感染后的致病表现，对免疫系统造成损伤，使似乎能够清除HCV的T细胞免疫出现最终的无能化，而且，存在致病性的潜在危险。由此来看，表位多肽疫苗在HCV疫苗研究中具有明显的优点，其可联合应用已经发现的有利于HCV疫苗研制的各种抗原表位，协同诱导保护和治疗性免疫反应。
在表位疫苗的设计中，表位的选择是首要考虑的问题。HCV E2蛋白中的HVR1(HCV高变区1)区存在具有中和性的株特异性B细胞表位，许多研究者对其进行了深入研究。Francois等对欧洲分子生物学数据库收集的1382条HCV序列和6个经1FN-α2a治疗的丙肝患者的HVR1序列进行软件分析比较，发现HVR1的结构存在一定的保守性，氨基酸总体倾向于疏水性，中性及亲水性氨基酸稀少，碱性氨基酸数远高于酸性氨基酸，且种类和位置相对保守。[参见Francois F.等人，病毒学杂志，755703(2001)]。同时，Puntoriero等提出HVR1的免疫原性变化较其基因结构变化小，以234条变异的HVR1基因序列为基础，设计出兼并保守的氨基酸序列，以此构建噬菌体展示肽库，以不同丙肝患者的血清对肽库进行筛选，鉴定出了具有交叉反应性的模拟表位。以此模拟表位MAPs合成肽免疫动物，可诱导出能与不同株HVR1交叉反应的抗体[参见Puntoriero G.等人，欧洲分子生物学协会杂志，173521-3533(1998)]。Watanabe等发现天然的HVR1序列同Puntoriero提出的HVR1保守序列的相似性可决定同丙肝患者血清的交叉反应性[参见Watanable K.等人，病毒学，264153-158(1999)]。而且，Zucchelli等用这些模拟HVR1表位替换天然的E2蛋白中的HVR1序列，构建了多个模拟E2蛋白的核酸疫苗，以单一和“鸡尾酒”形式免疫家兔，提出了HVR1模拟表位联合性疫苗研究的新途径[参见Zucchelli S等人，肝脏，33692(2001)]。
在T细胞表位的选择中，Renard等报道了C区的35～45(YLLPRRGPRL)和132～140(DLMGYIPLV)两段氨基酸序列为CTL表位，其在HLA-A2转基因鼠中得到充分的验证，而且在16例丙肝患者中，有6例可检测到针对132～140的CTL反应[参见RenardN.等人，肝脏学杂志，2000；32(2)363-364]。Brinster等对前期在丙肝患者中确定的NS3区的4条HLA-A2的CTL表位在HLA-A2转基因小鼠体内验证其效果，发现1073～1081(CVNGVCWTV)多肽在NS3 DNA免疫后和多肽免疫后都表现出可靠而强劲的CTL反应[参见Brinster C.等人，肝脏.2001；34(6)1206-1217]。Diepolder等研究发现在NS3区存在能同多种MHC II类分子结合的HCV的Th表位1251～1259(VLVLNPSVA)，能结合的分子包括HLA-DR4，HLA-DR11，HLA-DR12，HLA-DR13，和HLA-DR16，充分表明其作为T细胞辅助表位应用于疫苗研究中的前景[参见Diepolder HM.等人，病毒学杂志，1997；71(8)6011-6019]。
但迄今为止，关于B细胞表位、CTL表位、及Th表位之间的协同作用的报道，由于选择的表位不甚理想，效果也不理想，故无法用于丙肝疫苗制备等用途。
发明内容
本发明提供一种有应用前景的丙型肝炎病毒多表位抗原的基因克隆hcvme及其编码序列HCVME。
本发明构建的hcvme包含了HCV基因组E2区中HVR1模拟B细胞表位基因9条和T细胞表位基因4条，其中T细胞表位基因的4条为C区保守CTL表位2条、NS3区保守CTL表位1条及NS3区保守Th表位1条。它们是从已报道的HCV各表位中优选出来的[分别参见Puntoriero G.等人，欧洲分子生物学协会杂志，173521-3533(1998)；Renard N.等人，肝脏学杂志，32(2)363-364(2000)；Brinster C.等人，肝脏，34(6)1206-1217(2001)；Diepolder HM.等人，病毒学杂志，71(8)6011-6019(1997)]。各表位的氨基酸序列及特点见序列表1(SEQ ID NO.1)。
本发明将各表位之间以三个氨基酸的编码序列为接头，通过PCR方法合成由上述13条表位基因串联而成的多表位抗原的基因克隆。但各表位抗原基因的设计，是采用毕赤酵母偏性密码子并适当应用大肠杆菌偏性密码子，以便既可在原核细胞中表达，也可在真核细胞中表达。表位之间接头的设计，采用B表位之间及B表位和T表位之间为甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸，T表位之间为丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸，以使各表位相对独立。
丙型肝炎病毒多表位抗原基因克隆(hcvme)的构建，采用混合PCR合成基因和酶切、连接相结合的方法，包括如下步骤1、合成相应的26条寡核苷酸片段，这26条寡核苷酸片段中分别有相应片段在5′端和3′端彼此互补。其中5′端互补的片段编号分别为2号和3号、4号和5号、6号和7号、8号和9号、10号和11号、12号和13号、16号和17号、18号和19号、20号和21号、22号和23号、24号和25号；3′端互补的片段编号分别1号和2号、3号和4号、5号和6号、7号和8号、9号和10号、11号和12号、13号和14号、15号和16号、17号和18号、19号和20号、21号和22号、23号和24号、25号和26号；26条寡核苷酸片段的核苷酸序列见序列表2(SEQ ID NO.2)，其中5′端互补部分见表中()内部分，3′端互补部分见表中[]内部分。
2、丙型肝炎病毒多表位抗原基因克隆的分段克隆上述26条寡核苷酸片段既是引物也是模板，用混合PCR方法，将序列表2中前1-14条寡核苷酸片段合成hcvme前段A，其中3′端包含kpnI酶切位点；将后15-26条寡核苷酸片段合成hcvme后段B，其中5′端包含kpnI酶切位点。这两条片段中都包含了相应的表位接头编码序列。
3、丙型肝炎病毒多表位抗原基因克隆的全长基因克隆利用丙型肝炎病毒多表位抗原基因克隆前段A和后段B的kpnI酶切位点，经酶切和连接后将A和B连接起来，即为本发明全长基因克隆hcvme；将hcvme与原核或真核重组表达载体连接并转化相应菌株或细胞后，可表达hcvme编码的蛋白HCVME。
本发明具有如下特点1、采用设计26条前后相互重叠的寡核苷酸片段混合PCR分段合成基因，限制性内切酶酶切和连接酶连接基因片段相结合的方法，并分为A、B两段分别进行PCR合成，构建丙型肝炎病毒多表位抗原基因全长克隆，避免了由于全基因较长，一次性合成容易出现突变的缺点。
2、应用毕赤酵母偏性密码子并适当应用大肠杆菌偏性密码子来设计基因，为hcvme基因既能在大肠杆菌中表达进行前期研究又能在真核细胞中大量表达为后期准备扩大生产奠定基础。
3、B表位之间及B表位和T表位之间用甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸分开，T表位之间用丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸分开，为各表位都能被有效提呈提供了条件。
4、利用丙型肝炎病毒多表位抗原基因克隆，可以研制多种形式、兼有防治功能的丙型肝炎侯选疫苗，用于HCV感染的防治；可以研制多种丙肝病毒抗原或抗体的检测试剂，用于HCV患者的诊断。
图1.pMD-HCVME重组质粒结构示意2.hcvme前段基因片段A的合成示意3.hcvme后段基因片段B的合成示意4.重组质粒pMD-HCVME1的构建流程5.重组质粒pMD-HCVME2的构建流程6.重组质粒pMD-HCVME的构建流程7.原核融合表达质粒pGEX-HCVME的构建流程8.10条天然HVR1合成肽与雄性家兔免疫血清(1∶1000)的交叉反应频率图具体实施方式
丙型肝炎病毒多表位抗原基因克隆(hcvme)的具体构建方法如下一、合成hcvme基因所需的26条寡核苷酸片段(见SEQ ID NO.2，由上海申能博彩生物技术公司合成)。
二、26条寡核苷酸片段既是引物也是模板，经PCR反应分别合成前后两段基因片段A和B，PCR合成和拼接反应均应用ExpandTMLong Template PCR系统。
1、hcvme前段基因片段A的合成(图2)1-14号寡核苷酸片段(30μM)各0.5μldNTP(10mM) 2.0μl10×PCR buffer 5.0μlDNA聚合酶混合液(10单位/μl) 1.0μl灭菌重蒸水 35μl按下述条件进行PCR反应94℃ 30秒、65℃ 30秒、74℃ 1分钟，进行35个循环，然后74℃延伸10分钟。
2、hcvme后段基因片段B的合成(图3)15-26号寡核苷酸片段(30μM) 各0.5μldNTP(10mM) 2.0μl10×PCR buffer 5.0μlDNA聚合酶混合液(10单位/μl) 1.0μl灭菌重蒸水 35μl按下述条件进行PCR反应94℃ 30秒、65℃ 30秒、74℃ 1分钟，进行35个循环，然后74℃延伸10分钟。
三、按常规将PCR合成后纯化的前段基因片段A与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布Amp+琼脂培养平板，37℃过夜，挑取8个克隆进行小量质粒抽提，所得质粒经酶切及1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，确认获得阳性克隆。重组质粒命名为pMD-HCVME1。(图4)四、按常规将PCR合成后纯化的后段基因片段B与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布Amp+琼脂培养平板，37℃过夜，挑取8个克隆进行小量质粒抽提，所得质粒经酶切及1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，确认获得阳性克隆。重组质粒命名为pMD-HCVME2。(图5)五、按常规将重组质粒pUC-HCVME1用BamHI+KpnI酶切，回收约568bp的基因片段；将重组质粒pUC-HCVME2用KpnI+Sal I酶切，回收约432bp的基因片段。回收的两个片段与经BamHI+Sal I酶切的pMD18-T载体相连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布Amp+琼脂培养平板，37℃过夜，挑取8个克隆进行小量质粒抽提，所得质粒经酶切及1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，确认获得阳性克隆。重组质粒命名为pMD-HCVME。(图6)六、取pMD-HCVME质粒进行核苷酸序列测定。结果表明，hcvme基因全长975bp，其核苷酸序列及相应的氨基酸序列分别见序列表3和序列表4(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)，与所设计的序列相同。
丙型肝炎病毒多表位抗原基因(hcvme)同gst基因融合表达一、构建原核融合表达质粒pGEX-HCVME重组质粒pMD-HCVME经BamHI/SalI双酶切后，回收目的片段。原核融合表达载体pGEX-4T-1经BamHI/SalI双酶切后，回收载体片段。两个片段在DNA连接酶作用下于16℃连接过夜，转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布Amp+琼脂培养平板，37℃过夜，挑取16个克隆进行小量质粒抽提，用BamHI/SaI酶切及1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定出阳性克隆。重组质粒命名为pGEX-HCVME。(图7)二、筛选高效表达克隆从上述鉴定出的pGEX-HCVME阳性克隆中挑取6株菌，用转入空白载体pGEX-4T-1的2株菌作对照，分别在3mL的2×YT培养基中37℃扩增12h，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度为0.6mmol/L诱导3h。诱导结束后各取1mL菌液，常规处理及7.5％PAGE电泳检测，根据肉眼观察电泳条带中目的蛋白条带浓度来筛选高效表达克隆。
三、优化诱导表达条件用上述筛选获得的高效表达株进一步实验优化诱导表达条件。首先，确定诱导的菌液浓度，在3mL的2×YT培养基中，新鲜过夜培养菌液按1∶100接种，于37℃培养，高速振摇250rpm/min，取不同时间点测定OD600值，在不同OD600值下以0.6mmol/L IPTG诱导3h，收集菌液1mL，检测蛋白表达情况。而后，确定IPTG诱导的温度，以菌液OD600约为1.0时开始诱导，分别在20℃、25℃、28℃、30℃及37℃诱导3h，收集菌液1mL，检测蛋白表达量。而后，在菌液OD600约为1.0，诱导温度28℃，IPTG浓度0.6mmol/L条件下，确定诱导时间，取诱导1h、2h、3h及4h的菌液1mL，检测蛋白表达量。最终确定菌液OD600＝0.6、温度为28℃、IPTG浓度为0.6mmol/L、诱导时间为3h为最佳诱导表达条件。
四、融合蛋白GST-HCVME的大量表达和亲和层析纯化应用上述确定的诱导表达条件，并优化超声破碎条件和洗脱条件来大量获得融合蛋白GST-HCVME。具体步骤将重组菌划Amp+琼脂培养平板，37℃过夜。挑取单克隆菌落在10mL的2×YT培养基中37℃扩增12h，而后，按1∶100接种稀释接种于预热的2×YT培养基中，高速振摇2h，加入IPTG至终浓度为0.6mmol/L，于28℃诱导3h。用8000rpm/min×10min 4℃离心收集菌体，对应1mL菌液用50μL冰预冷的1×PBS悬浮细菌，在冰浴中进行超声破碎，取少量尝试在破碎时分别加入溶菌酶或加入TritonX-100或加入DTT辅助破碎。而后，破碎液内加入20％的TritonX-100至终浓度1％，室温下低速振荡30min，溶解蛋白。用12000rpm/min×10min 4℃离心后将上清转移到干净的器皿中，即为胞浆蛋白提取液。用1×PBS平衡10mL的Glutathione SepharoseTM 4B后，加入上述胞浆蛋白提取液，控制流速1mL/min，用10倍柱床体积的1×PBS洗至基线后，用10mmol/L的还原性谷胱甘肽(溶于50mmol/L Tris-HCl，pH8.0)，洗脱GST-HCVME蛋白。蛋白经透析除盐、冷冻干燥后，用纯水溶解，用Bradford法测定浓度
hcvme同gst基因融合表达产物GST-HCVME的免疫原性研究一、GST-HCVME与丙肝抗体阳性血清的反应性用ELISA方法检测。所用HCV ELISA检测试剂盒购自上海复星长征医学科学有限公司。
方法是以纯化的GST-HCVME包被酶标板，用正常人血清作阴性对照，分别检测20份丙肝抗体阳性血清。具体步骤如下1、包被纯化的GST-HCVME用包被液稀释为0.5μg/μl，加100μg/孔，于4℃包被过夜。
2、封闭用封闭液将孔加满，并去除各孔中的贴壁气泡，37℃封闭40min(或4℃封闭过夜)。
3、准备包被过夜的酶标板用洗涤液洗涤3次，每次3min，并将孔条作好标记。
4、加样用样品稀释液按1∶10、1∶100或1∶200分别稀释待测血清和阴性对照血清，按100μl/孔加入检测孔中，以样品稀释液作为空白对照，所有检测均设复孔。
5、孵育粘上封板纸，置37℃恒温反应60分钟。
6、洗板弃孔中液体，用洗涤液加满孔洗涤，放置15-20秒钟后弃液体，在吸水纸上拍干，如此反复洗五次。
7、酶标每孔加酶标二抗工作液(HRP-羊抗人IgG 1∶1000稀释)100μl，粘上封板纸，置37℃恒温反应60分钟。
8、洗板同前(6)。
9、显色每孔加TMB显色剂A、B各50μl，37℃避光显色5-10分钟。
10、终止每孔中加终止液50μl，轻轻混匀，终止反应。
11、比色测双波长OD450nm/630nm，空白孔校零，酶标检测仪测光吸收值。
12、结果判定P/N≥2.1时为阳性；反之为阴性。
结果见表1
表1、GST-HCVME与丙肝抗体阳性血清的反应性样品 OD450/630结果 样品 OD450/630结果 样品 OD450/630结果1 0.144 + 9 1.00+ 170.045 -2 0.132 + 10 0.15+ 180.051 -3 0.065 - 11 0.12+ 190.034 -4 0.382 + 12 0.20+ 200.131 +5 0.657 + 13 0.13+ C10.032 -6 0.041 - 14 0.11+ C20.042 -7 0.111 + 15 0.84+ C30.035 -8 0.163 + 16 0.90+ C40.028 -注意表中数据为两次独立检测结果的平均值。C为阴性对照(N)，以P/N≥2.1为阳性(+)。
由表1数据计算可知GST-HCVME能同20份丙肝抗体阳性血清中的15份发生反应，反应频率为75％。
二、抗GST-HCVME与10条天然HVR1合成肽的交叉反应性1、动物免疫及免疫血清的收集①制备GST-HCVME乳化液将纯化的GST-HCVME经干燥后用纯水溶解，调整蛋白浓度为0.2μg/μl，加入等体积的完全弗氏佐剂(首次接种时)和不完全弗氏佐剂(加强免疫时)后，用超声破菌器在100w功率下，冰水浴中多次乳化(一次乳化2mL，共需10次左右)，取乳化后液体5～10μl滴入冷水中，油滴浮于水面而不分散者为乳化完全。
②免疫动物新西兰雄性家兔(够自第二军医大学动物实验中心)共6只，分为两组，每组各3只；一组为实验组(注射GST-HCVME乳化液)，一组为阴性对照组(不注射)。
将实验组家兔背部皮肽剃毛消毒，选择6～8个部位分别注射乳化液0.5～1ml/处，以后每隔2周接种一次，共接种5次，首次接种剂量为1.0mg/只·次，加强免疫接种为0.2～1.0mg/只·次。免疫前和每次免疫后一周采血，血液置室温中凝固约1h，然后置4℃过夜进一步收缩血块，第2天离心，收集上清液即为免疫血清。及时分装冻存待测。
③制备抗GST-HCVME多克隆抗体家兔末次免疫14天(即首次免疫后第12周)后，动物禁食24h，心脏采血，血清以33％饱和硫酸铵沉淀(4℃，静置30min)，5000rpm离心15min。弃沉淀，上清再以50％饱和硫酸铵沉淀(4℃，静置30min)，5000rpm离心15min。沉淀溶于适量PBS(pH7.2)溶液中，置透析袋对PBS(pH7.2)透析去除硫酸铵即为抗GST-HCVME多克隆抗体。0.22μm滤器过滤除菌后，分装、冻存备用。
2、抗GST-HCVME抗体与天然HVR1合成肽的交叉反应性以10条不同的HVR1变异株的合成肽[氨基酸序列见(SEQ ID NO.5)]分别包被Immunuoplate Maxisorp检测板，应用ELISA方法检测免疫兔血清中是否含有交叉识别GST-HCVME的特异性抗体(结果见图8)。由图可以看出，从首次免疫后第8周，10条肽中的9条可识别抗GST-HCVME多克隆抗体，仅第5条不与抗GST-HCVME多克隆抗体反应，而且各个HVR1肽的识别反应强度不同。此结果提示，GST-HCVME中的模拟表位在一定程度上可诱导出交叉反应性抗体，预示其作为疫苗应用时，具有诱导交叉保护的能力。
由以上结果表明，本发明丙型肝炎病毒多表位抗原的基因克隆hcvme及其表达的蛋白HCVME，可用于制备HCV抗原或抗体的检测试剂，也可用于制备HCV核酸疫苗及多肽疫苗。
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(accaaggatc tggtttggtg)agaaacaaca ccaccggtg[g tgtgggtttg acctggaccc]60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName6SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的6号片段Sequence--------<213>OrganismName7<400>PreSequenceString(caccaaacca gatccttggt)tggtttgttc tctccaggtc[cacaacaaaa cggtccaggtc]61<212>TypeDNA<211>Length61SequenceName7SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的7号片段Sequence--------<213>OrganismName8<400>PreSequenceString(gggtagcgtg agaaacttga)ccaccggtgg tggtggttt[g acctggaccg ttttgttgtg]
60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName8SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的8号片段Sequence--------<213>OrganismName9<400>PreSequenceString(tcaagtttct cacgctaccc)acggtttgac cggtttgtt[c tctttgggtc cacaacaaaag]61<212>TypeDNA<211>Length61SequenceName9SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的9号片段Sequence--------<213>OrganismName10<400>PreSequenceString(agcaacagaa ccaccaacgg)tgtgggtagt acctggacc[c ttttgttgtg gacccaaagag]61
<212>TypeDNA<211>Length61SequenceName10SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的10号片段Sequence--------<213>OrganismName11<400>PreSequenceString(ccgttggtgg ttctgttgct)agacaagttc actctttg[ac cggtttgttc tctccaggtc]60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName11SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的11号片段Sequence--------<213>OrganismName12<400>PreSequenceString(accggtggtg tgggtttgac c)tggaccctt ttgttgtg[ga cctggagaga acaaaccggt]60<212>TypeDNA
<211>Length60SequenceName12SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的12号片段Sequence--------<213>OrganismName13<400>PreSequenceString(ggtcaaaccc acaccaccgg t)ggtgttgtt ggtcacgct[a cctctggttt gacctctttg]60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName13SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的13号片段Sequence--------<213>OrganismName14<400>PreSequenceStringggtggtacct ggaccctttt gagatggacc tggagagaa[c aaagaggtca aaccagaggt]60<212>TypeDNA<211>Length60
SequenceName14SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的14号片段Sequence--------<213>OrganismName15<400>PreSequenceStringcggtaccacc accaccaccg gtggtcaagt tggtcac[caa acctctggtt tgaccggtttg]61<212>TypeDNA<211>Length61SequenceName15SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的15号片段Sequence--------<213>OrganismName16<400>PreSequenceString(ggtttgacct ggaccgtttt)gttgagcacc tggagagaa[c aaaccggtca aaccagaggtttg]63<212>TypeDNA<211>Length63
SequenceName16SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的16号片段Sequence--------<213>OrganismName17<400>PreSequenceString(aaaacggtcc aggtcaaacc)accaccaccg gtggttctg[c ttctcacgct gtttcttctttg]62<212>TypeDNA<211>Length62SequenceName17SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的17号片段Sequence--------<213>OrganismName18<400>PreSequenceString(ggaccgtttt gcttagaacc)tggagagaac aaaccggt[ca aagaagaaac agcgtgagaag]61<212>TypeDNA<211>Length61SequenceName18
SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的18号片段Sequence--------<213>OrganismName19<400>PreSequenceString(ggttctaagc aaaacggtcc)aggtaagcaa accaccgtt[g ttggtggttc tcaatctcac]60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName19SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的19号片段Sequence--------<213>OrganismName20<400>PreSequenceString(aagcacctgg agagaacaaa)gaggtcaaac ctctaacggt[gtgagattga gaaccaccaac]61<212>TypeDNA<211>Length61SequenceName20SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的20号片段
Sequence--------<213>OrganismName21<400>PreSequenceString(tttgttctct ccaggtgctt)ctcaaaacgg tccaggttgt[gttaacggtg tttgttggac]60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName21SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的21号片段Sequence--------<213>OrganismName22<400>PreSequenceString(agcaacagat gggttcaaaa)ccaaaacgta agcagcaacg[gtccaacaaa caccgttaac]60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName22SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的22号片段
Sequence--------<213>OrganismName23<400>PreSequenceString(ttttgaaccc atctgttgct)gctgcttact acttgttgc[c aagaagaggt ccaagattgg]60<212>TypeDNA<211>Length60SequenceName23SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的23号片段Sequence--------<213>OrganismName24<400>PreSequenceString(gcagcaacca atgggatgta)acccatcaag tcgtaagcag[ccaatcttgg acctcttcttg]61<212>TypeDNA<211>Length61SequenceName24SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的24号片段Sequence--------
<213>OrganismName25<400>PreSequenceString(tacatcccat tggttgctg[c) ttactaagcggccgcgtcgacg]42<212>TypeDNA<211>Length42SequenceName25SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的25号片段Sequence--------<213>OrganismName26<400>PreSequenceString[cgtcgacgcg gccgcttagtaag]23<212>TypeDNA<211>Length23SequenceName26SequenceDescription合成的26条寡核苷酸片段中的26号片段注()中为5′端互补部分，[]中为3′端互补部分。
<120>TitleSEQ ID NO.3<130>AppFileReference3<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate＿＿-＿-＿Sequence--------<213>OrganismName1<400>PreSequenceStringatgggtccag gtagacaaac ccacaccacc ggtggtcaag ctggtcacca agctcactct60ttgaccggtt tgttctctcc aggtgctaag caaaacggtc caggtactac ccacaccggt120ggtcaacaag ctcacaccac ctccagattg gtttctttgt tctctccagg tgcttctcaa180aagggtccag gtcaaaccca caccaccggt ggtgttgttt ctcaccaaac cagatccttg240gttggtttgt tctctccagg tccacaacaa aacggtccag gtcaaaccac caccaccggt300ggtcaagttt ctcacgctac ccacggtttg accggtttgt tctctttggg tccacaacaa360aagggtccag gtactaccca caccgttggt ggttctgttg ctagacaagt tcactctttg420accggtttgt tctctecagg tccacaacaa aagggtccag gtcaaaccca caccaccggt
480ggtgttgttg gtcacgctac ctctggtttg acctctttgt tctctccagg tccatctcaa540aagggtccag gtaccaccac caccaccggt ggtcaagttg gtcaccaaac ctctggtttg600accggtttgt tctctccagg tgctcaacaa aacggtccag gtcaaaccac caccaccggt660ggttctgctt ctcacgctgt ttcttctttg accggtttgt tctctccagg ttctaagcaa720aacggtccag gtaagcaaac caccgttgtt ggtggttctc aatctcacac cgttagaggt780ttgacctctt tgttctctcc aggtgcttct caaaacggtc caggttgtgt taacggtgtt840tgttggaccg ttgctgctta cgttttggtt ttgaacccat ctgttgctgc tgcttactac900ttgttgccaa gaagaggtcc aagattggct gcttacgact tgatgggtta catcccattg960gttgctgctt actaa975<212>TypeDNA<211>Length975SequenceNamehcvmeSequenceDescriptionhcvme基因核苷酸序列
<120>TitleSEQ ID NO.4<130>AppFileReference4<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate＿＿-＿-＿Sequence--------<213>OrganismName1<400>PreSequenceStringMGPGRQTHTT GGQAGHQAHS LTGLFSPGAK QNGPGTTHTG GQQAHTTSRL VSLFSPGASQ60KGPGQTHTTG GVVSHQTRSL VGLFSPGPQQ NGPGQTTTTG GQVSHATHGL TGLFSLGPQQ120KGPGTTHTVG GSVARQVHSL TGLFSPGPQQ KGPGQTHTTG GVVGHATSGL TSLFSPGPSQ180KGPGTTTTTG GQVGHQTSGL TGLFSPGAQQ NGPGQTTTTG GSASHAVSSL TGLFSPGSKQ240NGPGKQTTVV GGSQSHTVRG LTSLFSPGAS QNGPGCVNGV CWTVAAYVLV LNPSVAAAYY300LLPRRGPRLA AYDLMGYIPLVAAY324<212>TypePRT<211>Length324SequenceNameHCVME
SequenceDescriptionhcvme基因编码的蛋白序列<120>TitleSEQ ID NO.5<130>AppFileReference5<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate＿＿-＿-＿Sequence--------<213>OrganismName1<400>PreSequenceStringNTRITGGSAARTTGGFVGLFSPGAKQN27<212>TypePRT<211>Length27SequenceNameHCV-SH3SequenceDescription天然HVR1合成肽Sequence--------<213>OrganismName2<400>PreSequenceString
GTYTTGGAQGRATQGLTSLFSRGSAQK27<212>TypePRT<211>Length27SequenceNameHCV-BJ2SequenceDescription天然HVR1合成肽Sequence--------<213>OrganismName3<400>PreSequenceStringSTHVTGGVQGHSLQRLTSLFTFGPAQK27<212>TypePRT<211>Length27SequenceNameXL1SequenceDescription天然HVR1合成肽Sequence--------<213>OrganismName4<400>PreSequenceStringHTRTTGGVAARTTSGLTSLFSSGPSQK27<212>TypePRT
<211>Length27SequenceNameXL11SequenceDescription天然HVR1合成肽Sequence--------<213>OrganismName5<400>PreSequenceStringGTRVTGGAQGRYHRSLTSLFTPGPTQR27<212>TypePRT<211>Length27SequenceNameXL15SequenceDescription天然HVR1合成肽Sequence--------<213>OrganismName6<400>PreSequenceStringETHTSGGSVARAAFGLTSIFSPGAKQN27<212>TypePRT<211>Length27SequenceName6
SequenceDescription天然HVR1合成肽Sequence--------<213>OrganismName7<400>PreSequenceStringNTYVTGGSAGRAVAGFAGLLQPGAKQN27<212>TypePRT<211>Length27SequenceName7SequenceDescription天然HVR1合成肽Sequence--------<213>OrganismName8<400>PreSequenceStringETHSVGGSAAHTTSRFTSLFSPGPQQN27<212>TypePRT<211>Length27SequenceName8SequenceDescription天然HVR1合成肽
Sequence--------<213>OrganismName9<400>PreSequenceStringSTYSMGGAAAHNARGLTSLFSSGASQR27<212>TypePRT<211>Length27SequenceName9SequenceDescription天然HVR1合成肽Sequence--------<213>OrganismName10<400>PreSequenceStringETYIIGAATGRTTAGLTSLFSSGSQQN27<212>TypePRT<211>Length27SequenceName10SequenceDescription天然HVR1合成肽
权利要求
1.一种丙型肝炎病毒多表位抗原的基因克隆hcvme，其特征在于包含了HCV基因组E2区中HVR1模拟B细胞表位基因9条和T细胞表位基因4条，其中T细胞表位基因的4条为C区保守CTL表位2条、NS3区保守CTL表位1条及NS3区保守Th表位1条，各表位基因之间以三个氨基酸的编码序列为接头串联而成，其中B表位之间及B表位和T表位之间为甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸的编码序列，T表位之间为丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸的编码序列，hcvme的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。
2.权利要求1所述基因克隆hcvme所表达的多表位抗原HCVME，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4。
3.权利要求1所述的基因克隆hcvme在制备HCV核酸疫苗或多肽疫苗中的应用。
4.权利要求2所述的多表位抗原HCVME在制备HCV多肽疫苗及HCV抗原或抗体的检测试剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物医药工程技术领域，是丙型肝炎病毒多表位抗原的基因克隆hcvme及其编码的多表位抗原HCVME。hcvme包含了HCV基因组E2区中HVR1模拟B细胞表位基因9条和T细胞表位基因4条，其中T细胞表位基因的4条为C区保守CTL表位2条、NS3区保守CTL表位1条及NS3区保守Th表位1条。经一系列试验研究表明，其与gst基因的原核融合表达产物GST－HCVME和丙肝抗体阳性血清有高交叉反应性，GST－HCVME免疫雄性家兔后的血清对天然HVR1合成肽有高识别频率。因此，hcvme及其表达产物HCVME可用于制备丙型肝炎的核酸疫苗、多肽疫苗以及HCV抗原或抗体的检测试剂。
文档编号C12N15/13GK1609213SQ20041006647
公开日2005年4月27日 申请日期2004年9月17日 优先权日2004年9月17日
发明者戚中田, 高军, 赵平, 龚育平, 赵兰娟, 潘欣 申请人:中国人民解放军第二军医大学