球形节杆菌生产的酮糖3-差向异构酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有特定的氨基酸序列的酮糖3-差向异构酶、以及使用 该酶制造酮糖的方法，具体而言，涉及具有特定的氨基酸序列的，可以由球形节杆菌 (Arthrobacter globiformis)M30 (保藏编号 NITE BP-1111)得到的，并且具有下述（A)和 (B)的底物特异性的酮糖3-差向异构酶，进一步涉及使用了该酶的酮糖的制造方法。
[0002] (A)将D-或L-酮糖的3位进行差向异构化，生成对应的D-或L-酮糖；
[0003] (B)在D-或L-酮糖中对D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特异性最高。
【背景技术】
[0004] D-阿洛酮糖是D-果糖的差向异构体，在甜味的强度和种类方面与D-果糖极其相 似。但是D-阿洛酮糖与D-果糖不同，在体内吸收时几乎不被代谢，热量贡献低。在专利文 献1中记载了能够将D-阿洛酮糖作为低卡路里甜味剂有利地利用于低卡路里饮食品的制 造中。即，D-阿洛酮糖可以作为减肥食品的有效成分使用。被作为非砂糖甜味剂广泛利用 的糖醇类如果摄取超过规定量，则会引起腹泻等的副作用，但是D-阿洛酮糖这样的副作用 少。进一步，由于D-阿洛酮糖在人体内几乎不被代谢，因此，热量值大致接近零，通过抑制 脂质合成酶的活性而具有减少腹部脂肪的功能。因此，D-阿洛酮糖也可以作为有益于体重 减少的甜味剂使用（例如，参照非专利文献1和2)。另外，在专利文献2中记载了由于D-阿 洛酮糖具有抑制血糖上升作用，因此，可以有利地用于健康食品、糖尿病患者用饮食品、瘦 身用饮食品等中。从这样的观点出发，D-阿洛酮糖集中了作为健康食品、减肥甜味剂的多个 关注点，在食品产业中，对于高效且安全地生成D-阿洛酮糖的方法的开发的必要性提高。
[0005] 另一方面，在非专利文献3中公开了来自菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii) ST-24的D-酮糖3-差向异构酶，并且记载了可以通过利用该酶由D-果糖来制造 D-阿洛酮 糖。然而，正如该酶的别名被称为D-塔格糖3-差向异构酶（D-tagatose 3-epimerase)那 样，已知其对D-塔格糖的特异性最高，对D-果糖的作用比较弱。另外，菊苣假单胞菌是植 物病原性微生物，D-酮糖3-差向异构酶生产能力非常低，因此，还不能说其适合利用于工 业上。因此寻求与属于假单胞菌属的微生物不同的、酮糖3-差向异构酶产生能力高且在食 品生产中在安全性上没有问题的微生物，以及对D-果糖的特异性高且适于D-阿洛酮糖的 制造的新型酮糖3-差向异构酶。
[0006] 因此，在专利文献3中，以提供一种新型的酮糖3-差向异构酶及其制造方法、编码 该酶的DNA、含有该DNA的重组DNA以及转化体、以及使用了该酶的酮糖的制造方法为课题， 并通过提供能够由属于根瘤菌属（Rhizobium)的微生物得到的酮糖3-差向异构酶及其制 造方法、编码该酶的DNA和含有该DNA而成的重组DNA以及转化体、以及利用该酶将D-或 L-酮糖的3位差向异构化，并制造对应的D-或L-酮糖的方法，从而解决了上述课题。另 外，在专利文献4中开发了使用来自根癌农杆菌(ARrobacterium tumefaciens)的D-阿洛 酮糖差向异构酶（以下称为阿洛酮糖3-差向异构酶）的D-阿洛酮糖的生成方法。
[0007] 如上所述，为了处理上述问题，对使用D-果糖作为底物，用酶生成D-阿洛酮糖的 方法进行了研宄。然而，至今开发的方法在用于作为食品的D-阿洛酮糖的生成中，在安全 性方面问题点还很多。
[0008] 现有技术文献
[0009] 专利文献
[0010] 专利文献1 :日本特开2001-011090号公报
[0011] 专利文献2 :日本特开2005-213227号公报
[0012] 专利文献3 :W02007/058086号公报
[0013] 专利文献4 :日本特表2008-541753号公报
[0014] 非专利文献
[0015] 非专利文献 I :Matsuo, T.，Y. Baba, M. Hashiguchi, K. Takeshita, K. Izumori and H. Suzuki1Asia Pac. J. Clin. Nutr. , 10:233-237(2001)
[0016] 非专利文献2:]\^七8110，1'.&11(11(.121111101'；[，八8 13?&。.]\〇1；[11· Nutr.， 13:S127(2004)
[0017] 非专利文献 3 ： K e n Izumori et al, Biosci. Biotech. Biochem.，57, 1037-1039(1993)
【发明内容】
[0018] 发明所要解决的课题
[0019] 本发明的课题在于提供从作为在制造食品时使用被认可的、收录于现有添加物名 册收录清单中的菌种并且几乎没有毒性的菌种中，以高收率取得催化从D-果糖向D-阿洛 酮糖的异构化的新型酮糖3-差向异构酶，以及使用了该酶的酮糖的制造方法。
[0020] 本发明者们每次有机会就采集各地的土壤，从其中分离微生物，持续探索具有酮 糖3-差向异构酶产生能力的属于假单胞菌属的微生物以外的微生物。除了上述日本现有 添加物名册收录清单以外，还着眼于在欧洲和美国作为食品使用被认可的清单中记载的菌 种中几乎没有毒性的菌种，持续专门探索。
[0021] 其结果，在大量分离的菌株中发现了产生新型的酮糖3-差向异构酶的属于节杆 菌(Arthrobacter)属的微生物。另外，来自该微生物的新型的酮糖3-差向异构酶具有作 用于D-或L-酮糖的3位，催化向对应的D-或L-酮糖进行差向异构化的广泛的底物特异 性，并意外地发现其在D-或L-酮糖中，对D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特异性最高，适于 由D-果糖制造 D-阿洛酮糖。从而确立了能够通过属于节杆菌(Arthrobacter)属的微生 物得到的新型酮糖3-差向异构酶及其制造方法，并且确立利用了该酶的酮糖的转换方法 以及酮糖的制造方法，从而完成了本发明。
[0022] 即，本发明的目的在于提供一种能够由属于节杆菌(Arthrobacter)属的微生物 得到的酮糖3-差向异构酶，并且提供一种利用该酶将D-或L-酮糖的3位进行差向异构化， 制造对应的D-或L-酮糖的方法。
[0023] 属于节杆菌(Arthrobacter)属的微生物的新型酮糖3_差向异构酶产生能力比较 高，并且和菊苣假单胞菌不同，不具有植物病原性。另外，能够由该微生物得到的本发明的 酮糖3-差向异构酶尤其能够良好地催化D-阿洛酮糖和D-果糖间的相互转换，因此，对于 由D-果糖制造 D-阿洛酮糖有用。
[0024] 解决课题的技术手段
[0025] 本发明以下述（1)至（5)中记载的酮糖3-差向异构酶为要点。
[0026] (1) -种酮糖3-差向异构酶，其中，所述酮糖3-差向异构酶来自作为球形节杆菌 M30(保藏编号为NITE BP-1111)的微生物，作为部分氨基酸序列，包含序列表中的序列号1 所示的氨基酸序列，具有下述（A)、(B)的底物特异性，并且具有下述（A)~（B)的物理化学 性质：
[0027] (A)将D-或L-酮糖的3位差向异构化，生成对应的D-或L-酮糖；
[0028] (B)在D-或L-酮糖中对D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特异性最高。
[0029] (2)如上述⑴所述的酮糖3-差向异构酶，其中，具有下述（a)~（f)的物理化学 性质，
[0030] (a)分子量：
[0031] 通过SDS-PAGE测定的亚单位的分子量为约32kDa，通过凝胶过滤法测定的分子量 为120kDa，是亚单位的分子量为32kDa的同源四聚体（homotetramer)结构；
[0032] (b)最佳 pH :
[0033] 在30°C下、反应30分钟、20mM的镁（Mg2+)存在下的条件下为6至11 ;
[0034] (c)最佳温度：
[0035] 在ρΗ7· 5下、反应30分钟、20mM的镁（Mg2+)存在下的条件下为60至80°C ;
[0036] (d) pH 稳定性：
[0037] 在4°C、保持24小时的条件下至少在pH5至11的范围内稳定；
[0038] (e)热稳定性：
[0039] 在pH7. 5、保持1小时、4mM的镁离子（Mg2+)存在下的条件下，在约50°C以下稳定。 在镁离子（Mg 2+)不存在的条件下，在约40°C以下稳定；
[0040] (f)通过金属离子的活化，
[0041] 通过二价锰离子（Mn2+)、二价钴离子（Co2+)、钙（Ca2+)以及镁离子（Mg 2+)进行活化。
[0042] (3)如上述⑴或⑵所述的酮糖3-差向异构酶，其中，具有下述的底物特异性 1.~8.，
[0043] 1.将D-果糖作为底物时的相对活性为43. 8% ;
[0044] 2.将D-阿洛酮糖作为底物时的活性为100% ;
[0045] 3.将D-山梨糖作为底物时的相对活性为1. 13% ;
[0046] 4.将D-塔格糖作为底物时的相对活性为18. 3% ;
[0047] 5.将L-果糖作为底物时的相对活性为0. 97% ;
[0048] 6.将L-阿洛酮糖作为底物时的相对活性为21. 2% ;
[0049] 7.将L-山梨糖作为底物时的相对活性为16. 6% ;
[0050] 8.将L-塔格糖作为底物时的相对活性为44. 0 %，
[0051] 其中，将D-阿洛酮糖的差向异构化活性作为100时对各酮糖的活性作为相对活性 来表示。
[0052] 另外，本发明以用下述所记载的碱基序列特定的基因编码的酮糖3-差向异构酶 为要点。
[0053] (4) -种酮糖3-差向异构酶，其中，所述酮糖3-差向异构酶由序列表中的序列号 3或序列号4所不的喊基序列、或者序列表中的序列号3或序列号4所不的喊基序列中在保 持编码的酶的活性的范围内缺失、置换或加成有1个或2个以上的碱基序列而成的碱基序 列、或者与其互补的碱基序列编码的，将D-或L-酮糖的3位差向异构化，生成对应的D-或 L-酮糖。
[0054] (5)如上述（7)所述的酮糖3-差向异构酶，其中，酮糖3-差向异构酶是D-阿洛酮 糖异构酶。
[0055] 进一步，本发明以下述（6)所记载的酮糖的转换方法、以及下述（7)所记载的酮糖 的制造方法为要点。
[0056] (6) -种酮糖的转换方法，其特征在于，使上述（1)~（5)中任一项所述的酮糖 3_差向异构酶作用于含有选自D-或L-酮糖中的1种以上的溶液，将该酮糖的3位差向异 构化。
[0057] (7) -种酮糖的制造方法，其特征在于，使上述⑴~（5)中任一项所述的酮糖 3_差向异构酶作用于含有选自D-或L-酮糖中的1种以上的溶液，将该酮糖的3位差向异 构化，生成对应的酮糖并采集该酮糖。
[0058] 发明的效果
[0059] 本发明产生以下的效果。
[0060] 1.作为将来自球形节杆菌的本酶用于食品产业中的最大优势在于菌的安全性。
[0061] 2.对于D-阿洛酮糖生产菌的最佳pH，假单胞菌属(Pseudomonas)为7~9,根瘤 菌属(Rhizobium)为9~9. 5, 土壤杆菌属