重组细胞以及1,4-丁二醇的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种能够由甲醇等生产1，4-丁二醇的重组细胞、及使用该重组细胞 的1，4- 丁二醇的生产方法。
【背景技术】
[0002] 1，4- 丁二醇（1，4-Butanediol)作为合成橡胶的单体是可以作为丁二醇原料的重 要的有机化合物，特别是在轮胎工业中为重要的原材料。近年来，由依赖于石油的基础化学 品的生产工艺向来自植物资源等可再生资源的生产工艺转换的技术的开发和实用化正在 平稳地进行。关于1，4-丁二醇，例如已知利用以糖为原料的重组大肠杆菌进行生产的技术 (专利文献1)。
[0003] 1，4-丁二醇的生物合成途径的例子示于图1。SP，例如能够将琥珀酸（Succinate) 或α -酮戊二酸（a -Ketoglutarate)作为原料物质生物合成1，4- 丁二醇。
[0004] 在将琥泊酸作为原料物质的途径中，琥泊酸经由琥泊酰CoA(Succinyl CoA)、 瑭泊酸半酸（Succinyl semialdehyde)、4_ 羟基丁酸（4_Hydroxybutyrate)、4-羟基丁 酸 CoA(4_Hydroxybutyryl CoA)、以及 4_ 羟基丁酸（4-Hydroxybutyraldehyde)转变为 1,4-丁二醇。对各反应产生催化作用的酶分别为（a)琥泊酰CoA合成酶（Succinyl-CoA synthetase)、（b) CoA依赖型瑭泊酸半酸脱氢酶（CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase)、（e) 4-羟基丁酸脱氢酶（4-hydroxybutyrate dehydrogenase)、（f) 4-轻 基丁酸 CoA 转移酶（4-hydroxybutyryl-CoA transferase)、（g)4_ 羟基丁酸 CoA 还原酶 (4-hydroxybutyryl-CoA reductase)、以及（h)醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase)(图 1)。需要说明的是，（a)所有生物均具有琥珀酰CoA合成酶。
[0005] 另外，有使琥珀酸直接转变为琥珀酸半醛的途径。此时，琥珀酸经由琥珀酸半醛、 4-羟基丁酸、4-羟基丁酸CoA、以及4-羟基丁醛转变为1，4- 丁二醇。对将琥珀酸转变为 琥?白酸半醛的反应产生催化作用的酶是（c)琥泊酸半醛脱氢酶（Succinate semialdehyde dehydrogenase)(图 1)。
[0006] 另一方面，将α -酮戊二酸（a-Ketoglutarate)作为原料物质的途径中，α-酮 戊二酸经由琥珀酸半醛、4-羟基丁酸、4-羟基丁酸CoA、以及4-羟基丁醛转变为1，4- 丁二 醇。对使α-酮戊二酸转变为琥珀酸半醛产生催化作用的酶是（d) 2-2-酮戊二酸脱羧酶 (图 1)。
[0007] 而且，还有通过（i)4_羟基丁醛脱氢酶（4-hydroxybutyraldehyde dehydorgenase)，由4-羟基丁酸直接生成4-羟基丁醛的途径（图1)。
[0008] 然而，在Cl化合物中，甲醇由合成气体等廉价地制造，所述合成气体为燃烧天然 气体及生物质或城市垃圾等废弃物得到的一氧化碳、二氧化碳及氢的混合气体。天然气体 在化石资源中也大量地存在，且〇) 2的产生量比较少，因此，作为新一代能量源备受关注，由 现有的石油向天然气体的转移正在进行。甲醇在水中为可溶等、操作或贮藏容易、而且作为 微生物培养的碳源也适合。
[0009] 甲基营养菌（Methylotroph)是指将分子内不具有C-C键的碳化合物、例如甲烷、 甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺等用作唯一的碳源、能量源的Cl化合物利用性微生物的总称 名。被称为甲烷氧化菌（Methanotroph)、甲烷氧化细菌、甲醇利用性细菌、甲醇利用性酵母、 甲醇利用性微生物等的微生物全部属于甲基营养菌。就作为细菌的甲基营养菌而言，多数 能够利用甲醇，这些有时称为甲烧氧化菌（Methanotroph)。
[0010] 甲基营养菌在将甲醇转变为甲醛之后，进行以将甲醛转变为具有C-C键的有机物 的反应为主的代谢。如图2所示，作为经由甲醛的碳同化代谢途径，已知有丝氨酸途径、核 酮糖单磷酸途径（RuMP途径）及木酮糖单磷酸途径（XuMP途径）。被分类为细菌的甲基营 养菌（甲基营养菌细菌）具有丝氨酸循环或RuMP途径。另一方面，被分类为酵母的甲基营 养菌（甲基营养菌酵母）具有XuMP途径。
[0011]另外，甲基营养菌细菌根据甲醇要求性的不同，被分类为专性甲基营养菌 (obligate methylotroph)和可以利用其它碳化合物的兼性甲基营养菌（facultative methylotroph)〇
[0012] 现有技术文献
[0013] 专利文献
[0014] 专利文献1 :国际公开第2010/141920号
【发明内容】
[0015] 发明所要解决的问题
[0016] 关于来自可再生资源的生产工艺，其现有技术的大部分包含上述1，4- 丁二醇生 产技术，是依赖于有机物、特别是糖、甘油或油成分等并利用微生物的生产方法。但是，为了 供应来自石油的众多的基础化学品的世界生产量，就来自植物资源等的、现状可使用的糖 质、甘油或油成分的量而言，作为微生物的碳源必定不足。即，依赖于糖质或油成分的、利用 微生物的基础化学品的生产量在将来也是有限的。另外，这种工艺也有可能产生与食物的 竞争。
[0017] 鉴于上述现状，本发明的目的在于，提供一种用于由甲醇等生产1，4-丁二醇的一 系列的技术。
[0018] 用于解决问题的技术方案
[0019] 用于解决上述的问题的本发明的1个方式为：一种重组细胞，其通过将下列基因 导入宿主细胞中而得到：编码选自琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰CoA合成酶、CoA依赖型琥珀 酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟 基丁醛脱氢酶、以及醇脱氢酶中的至少1种酶的基因，所述宿主细胞为甲基营养菌，该基因 在所述宿主细胞内表达，所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中 的至少1种Cl化合物生产1，4- 丁二醇。
[0020] 如图1所示，能够由琥珀酸生物合成1，4_ 丁二醇。并且，本发明的重组细胞是将 下列基因导入宿主细胞中而得到：编码在由琥珀酸生物合成1，4-丁二醇的途径中发挥作 用的酶群的基因，即，编码选自琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰CoA合成酶、CoA依赖型琥珀酸半 醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁 醛脱氢酶、以及醇脱氢酶中的至少1种酶的基因，所述宿主细胞为甲基营养菌，该基因在所 述宿主细胞内表达。并且，所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺 中的至少1种Cl化合物生产1，4- 丁二醇。
[0021] 根据本发明的重组细胞，以甲基营养菌本身具有的"使甲醇和/或甲酸转变为甲 醛的功能"和"甲醛固定化能力"为基础，能够经由琥珀酸，由上述Cl化合物生产本1，4- 丁 二醇。
[0022] 用于解决问题的本发明的其他方式为：一种重组细胞，其通过将编码选自2-酮戊 二酸脱羧酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基 丁醛脱氢酶、以及醇脱氢酶中的至少1种酶的基因导入作为甲基营养菌的宿主细胞中而得 到，该基因在所述宿主细胞内表达，所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛 及甲酰胺中的至少1种Cl化合物生产1，4- 丁二醇。
[0023] 如图1所示，能够由α-酮戊二酸生物合成1，4_ 丁二醇。并且，本发明的重组细胞 是将下列基因导入宿主细胞而得到：编码在由α-酮戊二酸生物合成1，4-丁二醇的途径中 发挥作用的酶群的基因，即，编码选自2-酮戊二酸脱羧酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸 CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁醛脱氢酶、以及醇脱氢酶中的至少1种酶的 基因，所述宿主细胞为甲基营养菌，该基因在所述宿主细胞内表达。并且，所述重组细胞能 够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种Cl化合物生产1，4-丁二醇。
[0024] 根据本发明的重组细胞，以甲基营养菌本身具有的"使甲醇和/或甲酸转变为甲 醛的功能"和"甲醛固定化能力"为基础，能够经由α -酮戊二酸，由上述Cl化合物生产本 1，4_ 丁二醇。
[0025] 优选选自丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径及木酮糖单磷酸途径中的至少1种Cl碳 同化途径作为甲醛的固定化途径。
[0026] 优选进一步导入编码3-己酮糖-6-磷酸合成酶的基因和编码6-磷酸-3-己酮糖 异构酶的基因，该基因在所述宿主细胞内表达。
[0027] 根据所述的技术方案，赋予或增强了基于核酮糖单磷酸途径的甲醛固定化能力。
[0028] 优选宿主细胞是甲醇利用性酵母，并进一步导入编码通过脱氢反应将甲醇转变为 甲醛的酶的基因，该基因在宿主细胞内表达。
[0029] 通常，酵母对醇的抗性高。在此，本方式中采用甲醇利用性酵母作为宿主，重组细 胞对1，4-丁二醇的抗性高。并且，通常酵母中，醇氧化酶发挥使醇转变为甲醛的反应的作 用。因此，在该转变反应中氧是必须的，具体而言，在培养时需要激烈地通气。在此，本方式 中，导入编码"通过脱氢反应将甲醇转变为甲醛的酶"的基因，从而实现在不需要依赖氧的 情况下进行由甲醇转变为甲醛的转变反应。
[0030] 用于解决同样问题的本发明的其它方式为一种重组细胞，其通过将下列基因导入 宿主细胞中而得到：赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因、赋予甲醛固定化能 力的基因和编码选自琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰CoA合成酶、CoA依赖型琥珀酸半醛脱氢 酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁醛脱氢 酶、以及醇脱氢酶中的至少1种酶的基因，该基因在所述宿主细胞内表达，所述重组细胞能 够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种Cl化合物生产1，4-丁二醇。
[0031] 本发明的重组细胞通过将下列基因导入宿主细胞中而得到："赋予将甲醇和/或 甲酸转变为甲醛的功能的基因"、"赋予甲醛固定化能力的基因"及编码在由琥珀酸生物合 成1，4-丁二醇的途径中发挥作用的酶群的基因，即，编码选自琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰 CoA合成酶、CoA依赖型琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、 4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁醛脱氢酶、以及醇脱氢酶中的至少1种酶的基因，这些基 因在宿主细胞内表达。而且，能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1 种Cl化合物生产1，4- 丁二醇。
[0032] 即，由于本发明的重组细胞导入了"赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的 基因"和"赋予甲醛固定化能力的基因"，因此，具有与甲基营养菌同样的特性。而且，以这 些外来基因所赋予的"将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能"和"甲醛固定化能力"为基础， 可以经由琥珀酸，由所述的Cl化合物生产1，4- 丁二醇。
[0033] 用于解决同样问题的本发明的其它方式为一种重组细胞，其通过将下列基因导入 宿主细胞中而得到：赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因、赋予甲醛固定化能 力的基因和编码选自2-酮戊二酸脱羧酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、 4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁醛脱氢酶、以及醇脱氢酶中的至少1种酶的基因，该基因 在所述宿主细胞内表达，所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中 的至少1种Cl化合物生产1，4- 丁二醇。
[0034] 本发明的重组细胞通过将下列基因导入宿主细胞中而得到："赋予将甲醇和/或 甲酸转变为甲醛的功能的基因"和"赋予甲醛固定化能力的基因"，以及编码在由α-酮戊 二酸生物合成1，4-丁二醇的途径中发挥作用的酶群的基因，即，编码选自2-酮戊二酸脱羧 酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁醛脱氢 酶、以及醇脱氢酶中的至少1种酶的基因，这些基因在宿主细胞内表达。而且，能够由选自 甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种Cl化合物生产1，4- 丁二醇。
[0035] 即，本发明的重组细胞导入了"赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因" 和"赋予甲醛固定化能力的基因"，因此，具有与甲