专利名称：一种重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法。
背景技术：
粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulatingfactor，G-CSF)具有促进粒系造血干细胞增殖分化及增强成熟粒细胞功能的作用，对于骨髓移植时促进中性白细胞增加、癌症化疗时引起的严重中性粒细胞缺乏症、以及再生障碍性贫血伴随的中性白细胞缺乏症均有明显疗效。
基因工程重组G-CSF的生物学活性与天然的相似，可大规模生产，以满足临床需要。现有的生产方法中大肠杆菌表达外源蛋白，多数以不溶性包涵体的形式存在，包涵体是不具有生物学活性的，在生产过程中需要经过变性、复性处理，恢复其生物学活性。普遍存在的问题是复性率低，文献报道的生产工艺多数是用包涵体直接复性的，复性率在20％左右。
发明内容
为了克服现有生产方法存在的重组人粒细胞集落刺激因子复性率低和生产成本高的缺陷，本发明提供了一种重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法。
本发明一种重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法，生产步骤包括发酵→破菌、提取包涵体→分子筛层析→复性→阴离子交换→阳离子交换→原液，是一种简便、稳定、高效的生产方法。
选用BL21作为表达G-CSF的宿主菌G-CSF基因采用化学合成法，按照其基因序列，将编码N端几个氨基酸的密码子改为大肠杆菌偏爱的密码子，全基因合成后重组于表达载体PBV220中，转化不同类型的大肠杆菌，对其表达量和传代稳定性进行考察，筛选出高效表达且传代稳定的菌种，作为工程菌的菌种。重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)生产所用的工程菌等选用大肠杆菌BL21作宿主菌，重组质粒PBV220-G-CSF在其中传代稳定且可实现高效表达。最突出的特点是发酵过程中升温诱导后菌体仍可继续繁殖，使其菌体密度进一步提高。通过比较发现G-CSF在BL21中传代稳定、表达量高且生长繁殖较快。表1为用DH5α和BL21表达G-CSF的比较。
表1.两种宿主菌表达G-CSF的比较
在发酵过程中工程菌菌种接种于摇瓶的LB液体培养基中30℃振荡培养，扩增获得一级种子液，再按1％转种扩大培养获得二级种子液，然后按10％转种于发酵罐中已灭菌的LB+M9培养基中，30℃培养，并通过通气量和搅拌速度控制溶氧、用碱调pH值，适当补料，进一步增菌至OD600在2.5-3.0时，升温至42℃热诱导，诱导4h表达目的蛋白。通过发酵参数的控制，使细菌生长旺盛，并在对数生长期内升温诱导，实现高密度高效表达。
G-CSF在大肠杆菌中以不溶性包涵体的形式表达，离心收集菌体后，用溶菌酶和超声的方法破菌、提取包涵体，并进行洗涤，包涵体用8mol/L的脲变性处理，溶解后的包涵体rhG-CSF纯度可达70％以上，通过包涵体的提取和洗涤，G-CSF得到了初步纯化。
为了提高复性效果，在复性之前用分子筛层析进行了进一步纯化，除去了部分大分子杂质。
rhG-CSF在原核细胞大肠杆菌中表达是以不溶性包涵体的形式存在的，需要变性、复性处理恢复其生物学活性。复性采用透析的复性方法，缓慢降低变性剂的浓度，并加入G-SH/GSSG，促进二硫键的形成，使变性蛋白恢复其空间构象，提高了复性率。
通过阴离子交换层析进一步纯化，去除残留的杂质和聚合体，并且复性液直接上阴离子交换柱纯化，不需要浓缩。
纯化工艺在分子筛层析和阴离子交换层析两步纯化的基础上，进一步阳离子交换，使得原液的细菌内毒素残留量水平明显降低，比活有较大幅度的提高，可得到高纯度、高比活的G-CSF原液。纯化后的原液SDS-PAGE纯度分析上呈现单一条带，HPLC纯度分析呈现单一峰，细菌内毒素按＜3EU/300μg(国家标准10EU/300μg)标准检查仍合格，菌体蛋白残留量＜0.01％(国家标准是0.1％)。阴离子交换柱后的比活为1.1×108U/mg，阳离子交换柱后的比活达1.5×108U/mg。从包涵体到原液的总回收率在20％以上。
图1发酵过程中诱导不同时间时的表达量
1分子量Marker(分子量分别是94、67、43、30、21、14.4KD，以下的Marker相同)2、3、4、5分别是42℃诱导1h、2h、3h、4h时G-CSF的表达量图2rhG-CSF的分子筛层析曲线图3.rhG-CSF的分子筛层析的SDS-PAGE分析结果1分子量Marker 2纯化前 3纯化后 4层析曲线中的第一个峰 5第2个峰的上升支 6第二个峰的下降支图4DEAE-Sepharose FF离子交换层析曲线及SDS-PAGE分析结果1.上样峰；2.0.1mol/L NaCl洗脱峰；3.1mol/L NaCl洗脱峰；4.分子量marker图5.CM-Sepharose FF离子交换层析曲线图6.rhG-CSF纯化过程中的SDS-PAGE分析1包涵体 2分子筛纯化后 3阴离子柱纯化后 4阳离子柱纯化后 5分子量Marker图7.rhG-CSF原液的SDS-PAGE纯度检测结果具体实施方式
实施例1发酵将工程菌菌种接种于LA平板中，30℃培养，长成菌落后，挑取单菌落接种于10mlLA液体培养液中，30℃振荡培养获得一级种子液，按1％转种于LA液体培养基，振荡培养获得二级种子液。
配制发酵培养基，能耐高压的部分加入发酵罐中高压灭菌，将不耐高压的成分过滤除菌，等发酵罐中的液体降温后补加进去，并将新培养的种子液按10％的比例接种于发酵罐中进行发酵。控制培养温度为30℃、用氨水调pH值使pH稳定在6.8和7.4之间、通过调节通气量和转速控制溶氧＞70％，并适当补料。增菌至OD600在2.5-3.0时，升高温度至42℃进行热诱导，诱导不同时间时的表达量见图1。诱导4h结束发酵，离心收集菌体，-70℃冻存备用。每升可得湿菌体10g以上，表达量达50％。
实施例2破菌、洗涤包涵体将湿菌体用TE(50mmol/LTris-Cl、5mmol/LEDTA)按1∶10(g/ml)的比例悬浮菌体，加溶菌酶至终浓度1mg/ml，4℃放置4h，冰浴中超声破碎，6min/次，歇间3min，共7次。4℃、8500rpm离心15min，弃上清，沉淀重悬于T E缓冲液中，重复上述过程两次，沉淀用2mol/L脲洗涤二遍。
沉淀用8mmol/L脲，2mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，50mmol/LTris-HCl pH 8.0的液体溶解，4℃、8500rpm离心15min，上清即包涵体溶出液。
实施例3分子筛层析取上述包涵体溶出液，加DTT至终浓度5mmol/L，30℃水浴30min上柱，流动相为8mmol/L脲，2mmol/L EDTA，1mmol/LDTT，50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，流速约0.7ml/min，分部收集洗脱峰。层析曲线见图2，目的蛋白位于第二个峰中，经分子筛纯化，可去掉分子量大于30KD的杂蛋白，见图3。
实施例4复性初步纯化后的样品用8mmol/L脲、1mmol/L EDTA，1mmol/LDTT，50mmol/L Tris-HCl pH 8.0稀释至OD280＝0.25，装于透析袋中，对4倍体积的4mmol/L脲、20mmol/L Tris-HCl pH8.0，4mmol/LG-SH/1mmol/LGSSG透析过液，换1mmol/L脲、20mmol/L Tris-HCL，pH8.0，透析24h，换同样体积的20mmol/LTris-HCl，pH8.0透析8h以上。将样品溶液经孔径0.45um滤膜过滤，准备上DEAE层析柱。
实施例5DEAE-SepharoseFF柱纯化平衡缓冲液20mmol/L Tris-HCl pH8.0，目的蛋白在0.1mol/L NaCl的盐浓度下被洗脱，1mol/L NaCl浓脱变性蛋白和杂蛋白，层析曲线和SDS-PAGE见图4。
实施例6CM-SephroseFF阳离子交换柱纯化平衡缓冲液20mmol/L NaAc-HCL PH4.0先用含0.3M NaCL的20mM NaAc-HAc PH4.0洗柱，再用含0.45M NaCL的20mM NaAc-HAc pH4.0缓冲液洗脱目的蛋白见图5。
实施例7G-CSF纯度分析采用SDS-PAGE和HPLC两种方法进行，结果见图6、图7，分别呈现单一条带和单一峰。
权利要求
1.一种重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法，其特征在于操作步骤如下发酵→破菌、提取包涵体→分子筛层析→复性→阴离子交换→阳离子交换→原液。
2.如权利要求1所述重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法，其特征在于选用BL21作为表达G-CSF的宿主菌。
3.如权利要求1所述重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法，其特征在于发酵过程中，工程菌菌种接种于摇瓶的LB液体培养基中30℃振荡培养，扩增获得一级种子液，再按1％转种扩大培养获得二级种子液，然后按10％转种于发酵罐中已灭菌的LB+M9培养基中，30℃培养，并通过通气量和搅拌速度控制溶氧、用碱调pH值，适当补料，进一步增菌至OD600在2.5-3.0时，升温至42℃热诱导，诱导4h表达目的蛋白，通过发酵参数的控制，使细菌生长旺盛，并在对数生长期内升温诱导。
4.如权利要求1所述重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法，其特征在于破菌、提取包涵体的步骤中采用溶菌酶和超声的方法破菌、提取包涵体，并进行洗涤，包涵体用8mol/L的脲变性处理。
5.如权利要求1所述重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法，其特征在于复性步骤中采用透析的方法，缓慢降低变性剂的浓度，并加入G-SH/GSSG，促进二硫键的形成。
6.如权利要求1所述重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法，其特征在于阴离子交换采用DEAE-SepharoseFF柱纯化。
7.如权利要求1所述重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法，其特征在于阳离子交换采用CM-SephroseFF阳离子交换柱纯化。
全文摘要
本发明一种重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法，涉及生物技术领域。生产工艺发酵→破菌、提取包涵体→分子筛层析→复性→阴离子交换→阳离子交换→原液。选用BL21作宿主菌，获得繁殖速度快，传代稳定，表达量高的工程菌菌种；几个纯化步骤使得原液的细菌内毒素残留量水平明显降低，比活有较大幅度的提高。包涵体先进行初步纯化后再进行复性，复性采用透析法，缓慢降低变性剂的浓度，使复性率保持在较高水平。本发明的方法能够达到稳定、高效、批量生产的要求。
文档编号C07K1/00GK1814779SQ200510045388
公开日2006年8月9日 申请日期2005年12月20日 优先权日2005年12月20日
发明者陈文芳, 宋磊, 刘红军 申请人:山东泉港药业有限公司