专利名称：祖代b细胞刺激因子的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的因子，祖代B细胞刺激因子，它具有促进造血祖细胞增殖和分化的活性。本发明还涉及编码这种因子的DNA序列、其多肽片段和类似物，以及用该因子治疗造血系统疾病的方法和组合物。
造血生长因子是能够维持基本的和可诱导的血细胞生成的主要调节分子(Brachetal.Acta.Haematol.86，128(1991))。造血生长因子(集落刺激因子和白细胞介素)、生长因子协同因子和生长因子释放因子控制着造血干细胞和谱系定型祖细胞的增殖、分化和功能活性。尽管在集落刺激因子之间存在谱系活性和协同作用的某些重叠，但每种集落刺激因子对于它们所作用的骨髓细胞的谱系各不相同。在许多情况下，生长因子参与特定造血细胞类型的成熟过程是公知的，比如红细胞生成素参与生成红细胞和粒细胞集落刺激因子以生成中性白细胞。不过，在造血细胞发育过程中有几个期，其中刺激因子的识别不完整或完全缺失的。这结于导致早期造血祖代细胞的增殖和发育那些情况尤为正确。
造血祖细胞从多能性逐渐发育成单能性的、定型祖细胞，在此过程中，它们失去了其自我更新能力(OlofssonAca.Oncol.30，889(1991))。这一发育过程取决于特定造血生长因子之间的相与作用。它们通过结合到干细胞的表面受体上刺激它们进入下一步的分化。白细胞介素3(IL-3)对于未分化的祖细胞基本上是一种增殖刺激因子(Pontingetal.GrowthFactors4，165(1991))。粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)在多能干细胞存活、增殖和分化成特定成熟阶段的干细胞过程中也起着主要作用。该阶段的单能干细胞需要红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和IL-5的刺激进行增殖并分别发育成它们的终期产物，红细胞、中性白细胞、单核细胞和嗜酸性细胞。其他的细胞激动素如IL-1β、IL-4和IL-6在这些过程中完成作为辅助因子的重要功能(Araietal.Ann.Rev.Biochem.59，783(1990))。
干细胞因子(CSF)，也称作C-药盒的配体，最近被鉴定为一种能够刺激祖细胞增殖的细胞激动素(PCT申请号No.WO91/05795)。SCF能够与多种广泛的其他造血生长因子起协同作用，以引起定型祖细胞的增殖和分化(Migliaccioetal.J.CellPhysiol.148，503(1991))。正常鼠骨髓细胞的克隆培养中，G-CSF、GM-CSF或IL-3与SCF联合可诱导平均细胞含量增加25倍，而它们的平均祖细胞含量增加6倍(MetcalfProc.Natl.Acad.Sci.USA88，11310(1991))。
定型为淋巴谱系的祖细胞最终发育成B或T淋巴细胞。成熟的B细胞通过产生在血液中循环并结合外来抗原的抗体而介导体液抗体应答。抗原抗体的结合通过吞噬作用或激活补体而导致抗原破坏。产生抗体的B细胞是人体免疫应答的一个主要部分。
生长因子参与造血祖细胞的增殖和分化以发育成为成熟B细胞，这对于保持B细胞含量是必需的。鉴别这些因子对于制定调节B细胞水平治疗方案，尤其是在免疫缺陷病人当中尤为重要。研究领域之一是鉴别在B细胞发育早期起作用以刺激产生B细胞祖代如前-B细胞的因子。前-B细胞的特征是早期的祖细胞，它能在其细胞浆中表达免疫蛋白的μ重链，而不能表达细胞浆轻链或表达免疫球蛋白。
美国专利No.4，965，195公开了白细胞介素-7(IL-7)能够刺激鼠骨髓来源的前-B细胞的增殖。McNiece等人(J.Immunol.146，3785(1991))指出SCF与IL-7相互协同作用刺激B谱系细胞的增殖。不过，Billips等人(Blood79，1185(1992))的工作指出在B细胞形成过程中需要其他的因子。Billips等人在文献中指出由B220-、Ig-祖细胞形成前-B细胞以及免疫球蛋白μ重链的表达特异性地依赖于S17基质细胞的存在，而且用IL-7、SCF或IL-7和SCF共同刺激都不能再产生上述过程。另外，还描述了(PCT申请号No.WO89/06541)能单独刺激B祖细胞分化成前-B细胞的基质来源的淋巴细胞生成因子-1(SDLF-1)。
因此本发明的一个目的是鉴别与促进造血祖细胞，尤其是淋巴祖细胞，增殖和分化成B谱系定型细胞如前-B细胞有关的因子。本发明的因子可以用作体液抗体应答的调节剂，能够刺激B细胞祖代的这种因子的治疗效果使得人们希望鉴别和表达编码所说因子的基因。
本发明提供了一种能够刺激造血祖细胞，特别是祖代B细胞的增殖和分化的新型因子。该因子在本文称之为祖代B细胞刺激因子，或PBSF。PBSF可以具有如SEQIDNO.1中所述的氨基酸序列。本发明还包括具有刺激祖代B细胞增殖和分化能力的PBSF的等位基因变异体，片段和类似物。PBSF可以从天然来源如哺乳动物组织或细胞系纯化得到，或者是外源DNA序列的原核生物或真核生物表达产物，即通过重组方法产生。
本发明包括编码生物活性PBSF的DNA序列。这些DNA序列包括SEQIDNO.1中的序列以及具有生物活性的等位基因变异体、片段和类似物。本发明还提供了含有这些DNA序列的载体以及由这些载体转化或转染的宿主细胞。还包括了该因子的产生方法，该方法的步骤是在合适的营养条件下，使转化或转染的宿主细胞以允许多肽表达的方式生长，并分离该因子。
在干细胞因子和白细胞介素-7存在下，PBSF表现出能刺激定型为淋巴谱系的造血祖细胞，如B细胞祖代的增殖和分化。
本发明还涉及能够特异性结合PBSF，结合含PBSF的融合多肽，或结合含有PBSF部分氨基酸序列之肽片段的抗体。
本发明还提供了含有该因子的药物组合物以及用该因子治疗造血性疾病的方法。
图1表示编码GM-CSF、IL-1β、IL-2、IL-3和IL-6的信号肽酶切割位点的核苷酸序列。还表示了根据信号肽酶切割位点设计的，并且用于在基因文库中筛选细胞激动素的简并寡聚核苷酸探针的序列。
图2表示PBSF的核苷酸及推断的氨基酸序列。
图3表示一致性干扰素-PBSF融合蛋白在大肠杆菌中的表达。泳道1，分子量标志;泳道2，以错误取向插入的一致性干扰素-PBSF融合基因;泳道3，一致性干扰素基因;泳道4、5和6，正确取向的一致干扰素-PBSF融合基因;泳道7，分子量标志。
图4表示在PA317细胞中表达并经被固定的抗PBSF抗体亲和纯化的PBSF的SDS-PAGE。
图5A-C表示PBSF在一种前-B细胞集落形成试验中的活性。PBSF来源于转染的COS细胞的条件培养基(A)，转染的PA317细胞条件培养基(B)或来源于转染的PA317细胞条件培养基的亲和纯化(C)。
图6表示PBSF在外周血淋巴细胞中表达的Northern印迹分析。对照泳道表示在没有细胞激动素表达诱导剂存在下的表达水平，中间泳道表示在商陆分裂素(PWM)存在下的表达，右边的泳道表示在PWM和放线菌酮存在下的表达。
图7表示在人白血病细胞系的单核细胞分化过程中PBSF表达的Northern印迹分析。泳道1，ML-1，未治疗的;泳道2，用PMA治疗的ML-1;泳道3，用肿瘤坏死因子(TNF)治疗的ML-1;泳道4，用TNF和IL-6治疗的ML-1;泳道5，HL-60，未治疗的;泳道6，用PMA治疗的HL-60;泳道7，用TNF治疗的HL-60;泳道8，用TNF和IL-6治疗的HL-60。
图8表示反转酶和PCR分析的PBSF在各种组织中的表达形式。泳道1和10，分子量标志;泳道2，脑组织;泳道3，HeLa细胞;泳道4，心脏;泳道5，骨骼肌;泳道6，脾脏;泳道7，胰腺;泳道8，胸腺;泳道9，骨髓;泳道11，肾脏;泳道12，肝脏;泳道13，肺脏;泳道14，睾丸;泳道15，胎盘;泳道16，外周血淋巴细胞;泳道17，阴性对照。
本发明提供了一种新型因子，它是一种能够刺激定型为淋巴谱系的造血祖细胞增殖和分化的多肽。该因子称之为祖代B细胞刺激因子，或PBSF。术语“祖代B细胞”是指能够产生成熟B淋巴细胞的一种细胞。在一种实施方案中，PBSF与IL-7和SCF一起结合使用，表现出能够刺激淋巴祖细胞增殖和分化成前-B细胞。
通过实施例3和4中所述的体外和体内试验测定出了PBSF的生物活性。实施例3公开了一种体外集落形成试验，其中5-氟尿嘧啶处理的鼠骨髓集落的数目和类型在接触PBSF之后增多，实施例3还描述了其他的生长因子。实施例4公开了在体内检测PBSF的活性，包括在转基因小鼠中导入和表达PBSF基因，反转录病毒感染带有PBSF基因的幼鼠，和通过小鼠骨髓移植导入PBSF基因并表达之。
体外实验(实施例3)的结果表明PBSF在SCF和IL-7存在下刺激鼠骨髓培养中B祖细胞的形成。如说明书中所公开的，PBSF似乎与SCF和IL-7协同作用以促进淋巴祖细胞增殖和分化成前-B细胞。如图5所示，当只向鼠骨髓细胞中加入SCF和IL-7的结合物或单独加入PBSF时没有刺激前-B细胞集落形成。但是，当向骨髓细胞培养物中一起加入SCF、IL-7和PBSF时前-B细胞的数目增加50%。
本发明的因子是一种可以从天然来源，如从已知是细胞激动素或生长因子来源的哺乳动物组织或细胞系中分离的多肽。已证明PBSF可在外周血淋巴细胞中由PWM诱导而表达，或在人细胞系Hut78中由PMA诱导而表达(见实施例1)。或者，该因子可以作为一种外源DNA序列的原生物或真核生物表达产物而被分离出来，也即通过重组方法获得。
在一个实施方案中，PBSF具有图2和SEQIDNo.1中所示的氨基酸序列。该氨基酸序列可以是成熟的多肽或者它是未加工过的多肽。将该因子加工成为成熟多肽包括切割前导序列，预计在位于SEQIDNo.1中所示的氨基酸残基14和15之间切割，这样成熟的PBSF将具有一个在Thr15的氨基末端残基。或者，在SEQ.ID.No.1中所示的氨基酸31和32之间切割前导序列，使得成熟PBSF有五个在Lys32的氨基末端残基。也可以有其他的加工方法，如从预计的多肽成熟氨基末端或羧基末端切割一个或多个氨基酸。这些加工过程的某些情况可以将多肽转化成为生物活性形式。
还提供了生物活性PBSF的变异体。这些变异体包括自然发生的等位基因或异体、其中一个或多个氨基酸被不同氨基酸取代的取代类似物、其中一个或多个氨基酸出现缺失的缺失类似物和增加了一个或几个氨基酸的增加类似物。可以在多肽的内部区或氨基或羧基末端缺失和增加一个或几个氨基酸。本发明的多肽还包括在氨基末端包含一个起始蛋氨酸残基。
本发明还提供了融合到异源多肽上的本发明多肽。在一个优选实施方案中，PBSF的成熟氨基酸序列在羧基末端融合到人α干扰素或牛生长激素上。所产生的融合蛋白在大肠杆菌宿主细胞中以高水平表达。如实施例3所述，这种融合多肽可用于产生特异性结合PBSF的抗体。另外，也可以用化学合成的肽片断产生能特异性结合该因子的抗体。
本发明还提供了编码生物活性PBSF的新DNA序列。更可取的是，该序列包括a)如在SEQIDNo.1中所示的DNA序列及其互补链;
b)与(a)中序列杂交的DNA序列;和c)除基因密码子简并外能与(a)和(b)中的序列杂交的DNA序列。
本发明的DNA序列包括那些编码成熟的、未加工形式的多肽以及前体形式多肽的序列。例如，编码前体形式多肽的DNA序列含有分泌所必需的前导序列。
按照实施例1所述，获得编码部分或全部的PBSF编码区的cDNA序列。通过与一系列具有SEQ.ID.No.7中所示序列的混合寡聚核苷酸探针的杂交来筛选从外周血淋巴细胞制备的一种寡聚(dT)引导的cDNA文库。在实施例1G中描述了筛选步骤。该探针是根据与GM-CSF(SEQ.ID.No.2)、IL-1β(SEQ.ID.No.3)、IL-2(SEQ.ID.No.4)、IL-3(SEQID.No.5)和IL-6(SEQ.ID.No.6)mRNA所编码的信号肽酶切割位点周围同源的一种实测的核苷酸序设计的。这种筛选方法的理论说明是用对细胞激动素样分子的分泌部分有特异性的探针识别其他细胞激动素。一种能够杂交的cDNA克隆开始命名为P64，但缺少完整的编码区。接着，在一个从随机引导的外周血淋巴细胞cDNA文库中获得的1.78KbcDNA克隆上得到了完整的编码区。发现该克隆能够刺激前-B细胞形成，而且所表达的蛋白就是PBSF。将编码PBSF的这个1.78Kb片段插入到质粒V19.12中，并转化到大肠杆菌菌株DH5αF′，准备寄存在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号No.-on-。由于该探针混合物的高度简并性(大约65，000倍)，得到了具有与该分子其他区中的信号肽酶切割位点相似的序列的阳性杂交克隆。这就是编码PBSF的基因的情况。
本发明的DNA序列可以是从人和其他哺乳动物来源分离的cDNA和基因组DNA序列。还可以是编码PBSF的合成DNA序列，及其片段，它们可通过本领域中公知的基因合成技术容易制备。本申请中公开的编码PBSF的NDA序列及其片段可用作探针，以分离编码PBSF的基因组DNA。另外，可将含部分或全部PBSF的基因的DNA序列用于检测生物样本中基因的存在，用于确定该基因在人染色体中的图谱位置，以及用于以核酸为基础的治疗中，如反意或三螺旋阻滞，在此需要调节所合成的PBSF的量。
该DNA序列还包括编码生物活性PBSF的变异体的序列。该序列包括那些编码自然发生的等位基因变异体、取代类似物、缺失类似物和增加类似物的序列，其中的缺失和增加可以是发生在氨基或羧基末端或在编码区中。可使用本领域中公知的技术构建这些类似物。这些变异体可以具有一些所需的特性，例如，对蛋白水解的抵抗性更强，抗氧化性更强，或在微生物宿扩中表达更容易再折叠，而仍然保持生物活性。
DNA序列包括那些编码融合蛋白的序列，其中部分或全部的PBSFDNA序列被融合到一种异源蛋白上。优选的是，编码部分的人一致性干扰素或牛生长激素的DNA序列在框架中融合到编码PPBSF的DNA序列5′末端。该融合蛋白的结构描述于实施例3A中。如实施例3B所示，这些融合蛋白可用于产生抗该因子的抗体。
PBSF的特征为它是外源DNA序列的原核生成真核生物宿主(如培养的细菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞)的表达产物，其中该外源DNA序列可以是cDNA、基因组DNA或合成DNA。也即，在一个优选方案中，该因子是通过重组方法产生的。由于由天然来源一般只生产小量造血生长因子，通过重组方法生产该因子的能力基本上能获得足以用于治疗使用量的该因子。
用于在宿主细胞中表达编码PBSF的DNA序列的几种不同载体是容易获得的。已在实施例2A-C中描述了用于在COS、中国仓鼠卵巢(CHO)和PA317哺乳动物细胞系中分别表达PBSF的载体如V19.12、pDSRα2和mpZen。另外，PBSF可以在一些适用于酵母和细菌菌株的载体中表达。如实施例2中所述，PBSF是以具有人α干扰素或牛生长激素序列的融合蛋白形式用载体pCFM756在大肠杆菌中被表达的。可以使PBSF序列最优化以在一种特定的宿主系统中表达，不管该宿主是细菌、酵母或哺乳动物细胞。这种最优化可以包括用于表达的优选密码子的内容。在一个优选方案中，PBSF序列包括一个或几个最优化的密码子用于在大肠杆菌宿主细胞中表达。如实施例4A中所述，本发明还提供了用于在转基因鼠中表达PBSF的载体。
本文描述了生产重组PBSF的方法。该方法包括在合适的营养条件下，使转化或转染的原核生物或真核生物宿主细胞生长，所说的转化或转染是用一种编码生物活性PBSF的DNA序列转化或转染，然后分离由所说DNA序列表达的PBSF。优选的是，该序列是在SEQIDNo.1中所示的序列以及与其杂交的序列。
依据表达所用的宿主细胞不同，本发明的多肽可以是糖基化或末糖基化的。通常是在沿氨基酸骨架的特定位置连续上糖链来修饰哺乳动物蛋白。在被选择的天冬酰胺残基处连上糖链称之为N-糖基化，而在丝氨酸或苏氨酸残基处连上糖链称之为O-糖基化。N-连接的或者O-连接的链的存在，或者二者的存在，对于该多肽的生物活性和/或稳定性是必需的。N-连结的糖基化位点的存在可通过序列Asn-X-Ser/Thr而预测，其中X可以是任何氨基酸。根据这一点，PBSF预计有两个N-连接的糖基化位点，分别在Asn29和Asn396。
还可以用水溶性聚合物如聚乙二醇修饰PBSF多肽。使用本领域中熟练技术人员已知的技术可以完成水溶性聚合物与蛋白质的共价结合。并在美国专利No.4，179，937中有所描述，本文引用作为参考。所修饰的多肽会具有所希望的特性，如，在水溶液中的溶解度增加、稳定性增加、体内半衰期延长和生物活性增加。
还可以将PBSF与一个具有放射活性(如，I125)或非放射活性(如，一种荧光染料)的可检测标记物共价结合。结合上一个显示基团(report group)可以提供用于在固体组织和液体样本中检测PBSF的试剂。同样，也可以将编码PBSF的DNA序列共价结合到可检测标记上用于作为生物样本中PBSF的探针，例如，确定人PBSF基因组中的位置，以及检测PBSF相关序列的存在。
本发明还说明了特异性结合该因子的抗体。该抗体可以是单克隆的或多克隆的，并且可以特异性结合多肽片段、融合蛋白以及完整的蛋白。在实施例3B中描述了抗人一致性干扰素-PBSF融合和牛生长激素-PBSF融合蛋白抗体的生产。该抗体可以用来对生物样本(如血或尿)中的因子进行定量。该因子的浓度异常可以是某种造血性疾病的一种有用性指示。而且，该特异性结合PBSF的抗体可以用于从自然来源或者从重组质粒的表达纯化多肽的方法，其中该方法包括下列步骤a)将一种抗体结合到一种固相载体上，b)将所说结合的抗体与一种含有该多肽的溶液接触以达到使多肽抗体选择性地结合;和c)洗脱所结合的多肽。
该含有多肽的溶液可以是一种粗制的或部分纯化的混合物。在实施例5中描述了使用一种抗-PBSF抗体亲和柱子对PBSF的纯化。
本发明提供了含有治疗有效量的PBSF和药物学上接受的稀释剂、佐剂、载体、防腐剂、乳化剂和/或增溶剂的药物组合物。本文所用的“治疗有效量”是指为一种给定状况和给药方案提供治疗效果的量。可以预知本领域中的熟练人员能够确定对于任何所要治疗的给定状况其PBSF的治疗有效量。药物组合物包括各种缓冲液稀释剂(如，Tris、乙酸盐、磷酸盐)，增溶剂(如，吐温、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯)，载体如人血清白蛋白，防腐剂(硫柳汞，苄醇)和抗氧化剂如抗坏血酸。也可以将该因子结合到聚合物的特定制剂中以在病人体内控制释放一段延长的时间。对于药物组合物中成份的更广泛性研究参见Remington′sPharmaceuticalSciences.，18thed.A.R.Gennaro，ed.，Mack，Easton，PA(1990)。
用于治疗造血系统疾病的PBSF剂量取决于一系列因素，包括所要治疗疾病的性质和严重程度、给药途径、PBSF与其他治疗剂的结合使用。还应当考虑PBSF多肽或其修饰形式的体内半衰期，其中该修饰可以是用一种水溶性聚合物如聚乙二醇修饰。本领域中的熟练人员可以根据这些因素确定本文所用PBSF的“治疗有效量”。
PBSF可以通过皮下、静脉内或肌肉注射给药，或者口服或鼻内给药。给药途径取决于所需治疗的特定状况。
在治疗一些造血性疾病中，PBSF可以单独使用或与其他治疗剂结合使用。在一个优选方案中，PBSF与SCF和IL-7结合使用以用于治疗B细胞疾病。该因子也可以与其它的已知与各个生血阶段相关的因子如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、低分子量B细胞生长因子(L-BCGF)或高分子量B细胞生长因子(H-BCGF)一起使用用于治疗B细胞疾病。其它血生成因子的给药可经与PBSF的给药同时给药，或在其之前或之后给药。
PBSF单独使用或与其他因子联合使用可用于治疗一些继发于骨髓疾病或损伤的造血性疾病。这些疾病包括下述疾病血细胞减少症、再生障碍性贫血、脊髓发育不良综合症、白血病和干细胞移植。另外，因放疗或化疗产生的骨髓损伤导致的脊髓抑制可通过用该因子治疗而克服。在一个优选方案中，PBSF与SCF和IL-7联合给药用于治疗B细胞疾病，特别是那些涉及B细胞水平降低的疾病。B淋巴细胞的缺乏导致免疫应答降低和更易患病。给免疫低下的病人使用PBSF是有益的。
PBSF可以用于在同系、同种或自身骨髓移植之前在骨髓中扩充B祖细胞。该因子可以直接给病人给药以增加骨髓内B祖细胞的产生或在移植之前体外给骨髓培养物用药。可以预想到这种治疗可以缩短移植后病人所要经历的免疫抑制阶段。
下面提供的实施例更全面地解释了本发明，但不是用于限制其范围。
实施例1鉴别编码PBSF的cDNA克隆(P64)
A.分离淋巴细胞从由Hemacare(Sherman，Oaks，CA)获得的新鲜制备的血沉棕黄层分离外周血淋巴细胞。用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)稀释血沉棕黄层三次，将30ml稀释的血沉棕黄层吸入到50ml的培养试管(FisherScientific，Pittsburgh，PA)中，并加入10ml的Ficoll-Paque(Pharmacia，Piscataway，NJ)。以3200×g离心之后，将处于中间相的单核细胞去除，并每次用30mlPBS洗涤3次。然后将沉淀小丸悬浮于50ml的RPMI1640和10%胎牛血清(FBS)中，稀释50倍，测定细胞数目。
B.诱导细胞激动素的表达将大约5×106细胞/ml与美洲商陆分裂素(PWM.，10μg/ml.Sigma，St.Louis，MO)一起孵育19小时，然后加入放线菌酮(Sigma)至10μg/ml再孵育6小时。为了进行比较，将相同量的细胞与PWM或不与PWM一起孵育相同时间。在37℃和5%CO2条件下完成孵育。
C.分离RNA使用硫氰酸鈲技术(Chirgwin et al.Biochemistry，18，5294(1979))从诱导的外周血淋巴细胞中分离总RNA。简言之，通过离心收集细胞，并于一种含有4%巯基乙醇的4M硫氰酸鈲溶液中裂解。将附着的细胞裂解于相同溶液中并收集。穿过一个18号针头 三次之后，将裂解物置于一逐级梯度的5.7M氯化铯之上。在Beckman L2超速离心机中于20℃以76，000xg离心24小时。离心之后，将沉淀的RNA悬浮于10mM Tris、1 mM EDTA，PH7.5加0.1% SDS之中，加入2.5体积的100%乙醇和乙酸钠(PH5.0)至0.3M使其沉淀。
D.选择多聚(A)+RNA使用Maniatis等人所述的方法(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，1st ed.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1982))在寡聚(dT)-纤维素(Collaborative Research，Bedford，MA)上通过色谱分析，乙醇沉淀和离心选择多聚(A)+RNA。将最终得到的沉淀小丸溶于蒸馏水中并等份储存于氮中。
E.cDNA文库构建在室温下用10mM氢氧化甲基汞使10μl的大约5μg多聚A+RNA变性10分钟，然后加入β-巯基乙醇至10mM，再加入RNasin(Promega，Madison，WI)至3μ/μl，在室温下孵育5分钟。然后加入下列成份至所示的最终浓度50μg/ml寡聚(dT)，2mMdNTP(Pharmacia)，100μg/ml。牛血清白蛋白，第一股链缓冲液(50mM Tris-HCl，PH 8.6，75mM KCl，10mM MgCl2，Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，MD)和20u/μl Superscript反转录酶(BRL)。使第一股链合成在37℃下进行1小时。然后用第二股链缓冲液(20mM Tris-HCl，PH7.5，5mM MgCl2，100mM KCl，50μg/ml，牛血清白蛋白，10mM二硫苏糖醇，BRL)，0.125μ/μl，大肠杆菌DNA聚合物酶Ⅰ(BRL)，0.08μ/μl Rnase H(BRL)，0.1μ/μl大肠杆菌DNA连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)和0.15mM NADP(Sigma)稀释该混合物。所述的所有浓度是在反应混合物中的浓度。将该混合物在15℃保温1小时，然后在25℃保温1小时。然后加入T4DNA聚合酶(Pharmacia)至0.01u/μl，并使反应液在37℃保温30分钟以产生平整末端。通过在2M乙酸铵存在下进行两次乙醇沉淀以去除结合的dNTPs。
然后根据下列步骤用EcoRⅠ和AluⅠ甲基化酶(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)使双股cDNA甲基化。向双股cDNA水溶液中加入甲基化缓冲液，100μMS-腺苷甲硫氨酸和1μ/μl的AluⅠ甲基化酶，并在37℃保温1小时。然后加入NaCl至0.1M，并加入EcoRⅠ甲基化酶至10μ/μl。使反应液在37℃保温30分钟。
将具有序列5′GCTTGAATTCAAGC3′(见SEQID.No.8)的寡聚连接物连接至cDNA上过夜。在0.8%琼脂糖凝胶上使cDNA电泳，从凝胶中电洗脱长于500bp的分子。用1∶1酚/氯仿混合物提取洗脱的cDNA。用乙醇沉淀，再悬浮于水中，并用HindⅠⅠⅠ和EcoRⅠ限制酶连续消化，以在该分子的5′端上产生EcoRⅠ粘性末端和在该分子的3′端上产生HindⅠⅠⅠ粘性末端。
将含有来源于噬菌体M13的复制原点的592bpAatⅡ/ClaⅠ片段插入到真核表达载体V19.8(在PCT申请No.WO91/05795中有所描述)中，以产生载体V19.10。用EcoRI和HindⅢ消化V19.10，并用细菌碱性磷酸酶处理。以不同的cDNA与载体DNA的比例完成连接反应，并选择能在传染之后产生最高数量克隆的比例进行大规模连接。用感受态的DH5αF′大肠杆菌细胞(Gibco-BRL)进行转染。该文库在15个150mm平皿上进行平板培养，然后在SOB(Okayama，等人，MethodsinEnzymol.154，3(1987))存在下刮下，并于-80℃下存放于7%DMSO中。
由从外周血淋巴细胞分离的多聚A选择的RNA构建另外一个cDNA文库，其中使用一个随机的六聚体引物(Pharmacia)引导第一股cDNA合成。如上所述用于产生寡聚dT引导的文库的方法制备双股平整末端的cDNA。将一个具有如SEQ.IDNO.9中序列5′CTTTCCAGACACA3′GAAAGGTC的连接物(InVitrogen，SanDiego，CA，目录号No.N408-8)连接到该cDNA上。通过在V19.10的HindⅢ和NotⅠ位点之间插入pCDM8(InVitrogen)的HindⅢ/NotⅠ填充片段构建V19.12。用BstⅪ限制酶消化V19.12，然后连接到该cDNA上。如上所述转化大肠杆菌DH5αF′宿主细胞并储存该细胞。
F.探针设计根据在少数细胞激动素的信号肽酶切割位点周围的某些序列同源性设计混合物的寡聚核苷酸探针。使用来源于GM-CSF、IL-1、IL-2、IL-3和IL-6的编码信号肽酶切割位点的公开序列(Wongetal.Science228，810(1985);Nishidaetal.Biochem.Biophys.Res.Comm.143，345(1987)，Taniguchietal.Nature302，305(1983);Yangetal.Cell.47，370(1986);和Mayetal.Proc.Natl.Acad.Sci.83，8957(1986)设计如图1中所示的探针。所说探针混合物的简并是65，536。由于高度简并性，有可能分离出在区域中具有除信号肽酶切割位点之外的相似序列的克隆。
G.筛选CDNA文库在GENE SCREEN PLUS膜上(New England Nuclear/DuPont，Boston，MA)以每个150mm平皿平板培养大约10，000集落来完成高密度筛选DH5αF′大肠杆菌中的寡聚(dT)引导的外周血淋巴细胞文库。制备一个第二基因筛选膜印迹，使印迹平板上的集落在一个含有100μg/ml药物氨苄青霉素的LB平板上生长过夜。然后将印迹膜置于一个含有100μg/ml氯霉素的LB平板上以扩增质粒DNA。扩增过夜之后，使集落中的DNA在0.5N NaOH和1.5M NaCl中变性5分钟，然后在1M Tris-HCl PH7.5中复性。将该膜空气干燥并在80℃真空干燥2小时。滤纸在2X SSC中湿润，接着在6X SSC，0.2%SDS中预洗两次各30分钟。在6X SSC，5X Denhardt，0.1%SDS中预杂交4-5小时。利用T4多聚核苷酸激酶以γP32-ATP标记20Pmole的混合寡聚核苷酸探针，通过离心穿过一个Sephadex G-50柱子去除未结合的标记物。使用大约每毫升2×106cpm于55℃在6X SSC，0.1%SDS和5X Denhardt′s溶液中进行杂交。20小时之后，将滤纸在55℃于 6X SSC和0.1%SDS中洗涤30分钟，洗两次。在相同温度下于2X SSC加0.1%SDS中完成另一次洗涤。露置过夜之后，括下主培养平板(Master Plate)中对应于阳性信号区的区域，并悬浮于SOB中。将集落的系列稀释液置于氨苄青霉素平板上进行第二次筛选。鉴别单个集落，并使之生长过夜以分离质粒DNA。通过使寡聚核苷酸探针与来源于不同集落的质粒DNA杂交完成最后筛选。通过这种方式大约鉴别出80个阳性克隆。
使用与19.10载体中序列杂交的引物(它们是cDNA插入物的5′和3′)对来自阳性克隆的质粒DNA双股进行测序。按照Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.74，5463(1977))所述完成cDNA克隆的DNA测序。将该DNA序列与存在于GenBank序列数据库的各种形式的序列进行比较。通过获得全长度克隆的序列并使用遗传学计算机组(UniversityofWisconsin)软件分析该序列只对那些在GenBank中未出现的序列进行特征描述。下面继续进行研究的克隆之一被命名为P64。
从寡聚dT引导的外周血淋巴细胞cDNA文库分离的P64克隆缺少该基因的5′端，这由起始因子蛋氨酸残基的缺乏所表示。为了获得P64的全长度克隆，用P64cDNA克隆对从Clontech实验室(Palo Alto.CA，Cataloy No.HL 1068b)获得的一个PMA活化的Hut 78λ gt 11 cDNA文库进行筛选。将每个150mm平皿大约10，000-20，000个斑块印到基团筛选滤纸上，并用通过随机引物方法用32P标记的P64克隆进行探测筛选。第二次筛选之后，鉴别单个阳性克隆。用EcoRⅠ消化阳性λ cDNA克隆产生插入物，并亚克隆到Bluescript SKⅡ质粒(Stratagene，La Jolla，CA)中，并且测序。此克隆含有上游编码序列，但起始因子蛋氨酸密码子仍然缺失。
在另一个试图获得全长度P64克隆的尝试中，用从Hut78文库中分离的P64cDNA克隆作为探针在V19.12中筛选一个随机引导的外周血淋巴细胞cDNA文库。获得了多个阳性杂交克隆，并将该DNA插入物亚无隆到M13mp21中且测序。有几个克隆具有等同于Hut78克隆的编码区，另外还含有编码起始因子蛋氨酸残基的序列。一种分离物含有一个大约1780bp的插入物，它具有P64的完整编码区。此克隆编码被命名为祖代B细胞刺激因子或PBSF的多肽。
这个已插入到质粒V19.12并转化到大肠杆菌菌株DH5αF′中的1.78KbDNA片段已寄存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号为-on-。
H.DNA测序和分析对GenBank、EMBL和SwissProt数据库进行检索以寻找与PBSF序列的核酸和氨基酸水平上等同或高度同源的序列。使用GCG软件包的FastA和TfastA程序进行检索。使用定位(Mab)和翻译(Translate)程序完成对核酸结构的分析。使用Pepplot、Pepstructure、Motifs和Isoelectric程序分析PBSF的氨基酸序列。使用Sigsegl程序预测信号肽切割位点。多次检索GenBankEMBL数据库以将PBSF序列与数据库中的序列相比较。检索中没有发现PBSF与数据库中的序列有高度同源性。
由从hut78文库获得的和从寡聚dT引导的及随机引导的PBL文库获得以cDNA推断的P64的DNA序列示于图2和SEQ.ID.No.1中。该序列长2376bp.从该DNA序列推断出的P64蛋白的大小是大约52KDa，包括含有引导序列的491个氨基酸。如VonHeinje所述(Nuc.AcidRes.14，4683(1986))该信号肽切割位点预测位于SEQ.ID.NO.1中14位的氨基酸残基丙氨酸和15位的苏氨酸之间。在31位的丝氨酸和32位的赖氨酸之间也存在着断裂的可能。有一个长的3′未翻译区，含有多个TATT和TTTT序列段，它们存在于一些细胞激动素分子中(Shaw等人，Cell49，659(1986))。该预测的蛋白质具有一个疏水性氨基末端。有6个半胱氨酸残基。通过GCG软件包中的程序ISOELECTRIC预测其等电点是7.25。在Asn29和Asn396有两个可能的N-连接的糖基化位点。另外，有4个可能的蛋白激酶C磷酸化位点和5个肌酸激酶ⅠⅠ磷酸化位点。
实施例2重组PBSF蛋白的表达A.在Cos细胞中的表达用含有1.78Kb PBSF cDNA插入物的V19.12 DNA通过电击穿转染Cos细胞。使用电细胞操作仪600(BTX，San Diego，CA)以500伏/电容和电阻对PBS中的大约3×106个细胞进行电击穿，电容1000μF，电阻48欧姆，在一个宽2mm，400μl体积的小池中以150伏的激发电压进行。脉冲长度为8.3至10.5毫秒。将小池置于冰上5分钟，然后在含有10%胎牛血清的DMEM中稀释，置于一个10cm平皿中平板培养。在37℃，5%CO2条件下保温过夜后，更换培养基以消除死亡细胞。向平皿中加入不含血清的DMEM，并在72小时之后收集条件培养基(CM)用于生物检测。将CM无菌过滤，等份冷藏于-20℃。如下所述使用抗P64融合蛋白的抗体通过Western印迹分析在培养基中检测出了P64蛋白的存在。
B.在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达如下所述产生能基本产生PBSF的CHO细胞。用含有PBSF编码区的载体pDSRα2(pCT申请号No.WO91/05795)转染CHO(DHFR-)细胞。将下面的引物用于PCR以扩增PBSF编码区5′TGTCCTCCGGCCCGAGATGA(核苷酸12-31，见SEQ ID No.1);和5′GGTTTGTGTTTTATGATACATTAC(核苷酸1567-1590见SEQ.ID NO.1)用Hind Ⅲ和SalⅠ消化扩增的DNA，并克隆到pDSRα2中。在含有透析血清的培养基中开始筛选转化子之后，在存在氨甲喋呤浓度增加至1μM情况下进一步筛选细胞以用子质粒扩增。通过Northern印迹杂交分析的检查所筛选克隆中PBSF基因的表达。通过使CHO(DHFR-)细胞在无血清DMEM中生长72小时制备用于生物检测的条件培养基。
C.在PA317细胞中的表达将编码PBSF的1.78KbHindⅢ片段插入到mpZen载体(JohnsonDev.Biol.Stand.69.3(1988))中以在骨髓及外骨髓增殖肉瘤病毒(MPSV)启动子下表达PBSF。通过用含有PBSF基因的mpZen和质粒SVZ-Neo一起电穿孔以转染Psi2细胞(Milleretal.Biotechnique7，980-990(1989))。在G418上筛选新霉素抗性集落，并用RNA点样印迹分析和杂交以鉴别那些产生高水平PBSF的集落。用含高水平产生体的条件培养基在Polybrene存在下感染兼性营养包裹细胞系PA317(Milleretal.Mol.Cell.Biol.6.2895-2902(1986))。从转染的PA317培养物制备条件培养式用于生物检测，并感染幼鼠(见下文)。这些细胞还将用于骨髓移植实验。
实施例3表达PBSF融合蛋白和产生抗体
A.大肠杆菌融合蛋白使用hut 78来源的PBSF的cDNA克隆产生与人一致性干扰素或牛生长激素的融合蛋白。将含有人一致性干扰素的前80个氨基酸或牛生长激素的前108个氨基酸的一个DNA片段与P64编码区在Asn2残基在框架内融合。由质粒pCFM756，即pCFM736的一种修饰变异体pCFM736描述于美国专利No.4，710，473)的PL启动子开始表达一致性干扰素-PBSF或牛生长激素-PBSF融合蛋白。用编码该融合蛋白的基因转染大肠杆菌FM5，并在28℃下生长直至OD600为0.3至0.5。然后温度增加至42℃持续2-3小时。通过光学显微镜可观察到包含体的出现。然后将大肠杆菌细胞裂解于Laemmli缓冲液中，并在10%凝胶上通过SDS-PAGE分析。用考马斯蓝染色观察蛋白带，一致性干扰素-PBSF融合蛋白的表达示于图3中。
B.抗体产生如上所述产生一致性干扰素-PBSF或牛生长激素-PBSF融合蛋白的大肠杆菌生长并以500ml分批诱导。离心之后，将沉淀的细胞悬浮于冷水中，并在7500磅/平方英寸的压力下使这些细胞经过法式压榨器三次而进行破碎。离心之后用5M尿素提取沉淀的包含体以减少大肠杆菌蛋白的污染。按文献所述(HunkapillerM.etal，MethodsinEnzymol.91，227-236)从聚丙烯酰胺凝胶分离融合蛋白。将凝胶分离的融合蛋白冻干并注射到兔子中以激发抗体。或者，合成SEQIDNo.10中所示的一个PBSF肽片段(Cys-Arg-Glu-Lys-Lys-Thr-Glu-Asn-Ser-Lys-Leu-Arg-Lys-Val-Lys-Tyr)，连接到钥孔戚血蓝素(CalBiochem，LaJolla，CA，目录号No.374811)上并注射到兔子中以激发抗体(Liuetal.Biochem.18，690-697(1979))。
实施例4纯化PBSFA.纯化兔抗-PBSF抗体并在溴化氰活化的琼脂糖上固定。
使用Affi-凝胶蛋白AMAPS药盒按厂家出版的方法步骤在一种Affi-凝胶蛋白A琼脂糖柱子上(Bio-Rad，Richmond，CA，目录号No.153-6153)纯化抗牛生长激素-PBSF融合蛋白的粗制兔抗体。按照IMMUNOPURE抗原/抗体固定药盒(Pierce，Rockford，IL，目录号No.44890)中附带出版的方法将纯化的抗体偶联到溴化氰活化的琼脂糖上。
B.纯化PBSF由mpZEN-PBSF转染的PA317细胞制备的条件培养基是PBSF的来源。将样本加到抗体柱子上以及从柱子中洗脱PBSF的方法见IMMUNOPURE药盒中所述方法。从柱子中洗脱之后，用PBS透析纯化的PBSF，并通过SDS-PAGE分析，对10%凝胶进行银染色。结果如图4中所示。
实施例5PBSF的体外生物活性集落形成试验从正常成年的Balb/c小鼠或用5-氟尿嘧啶(5-FU)预先治疗的小鼠获得骨髓细胞，并如以往所述(Bradley et al.J.Gell Physiol 94.507(1978))在35mm平皿中的双层琼脂培养基本平板培养上述细胞。使用补充有20%胎血清的Eagle′s MEM α-改良液(Flow Labs，Mclean，VA)作为全部的培养基。将生长因子(SCF、IL-7和PBSF)以最大值为总培养体积(1.5ml/平皿)13.2%量掺入到底层。培养基中通入5%O2∶10%CO2∶85%N2的混合气体并孵育10至14天。只对含有50或更多细胞的集落进行评价。
所有集落形成试验是在大肠杆菌中表达并按Martin等人所述(Cell63，203(1990))纯化的长度为164氨基酸的重组大鼠干细胞因子(rrSCF164)和重组IL-7(BiosourceInternational，Westlake，CA)存在下进行的。rrSCF164和重组人IL-7各加至最终为每毫升培养液200ng。在图5A中，进行试验以比较由Cos细胞来源的条件培养基激发的前-B细胞形成，所说的Cos细胞已用载体19.12或含有1.78KbPBSFDNA片段的载体19.12转染。在图5B中，进行实验以测定条件培养基中由携带反转染病毒载体pZen中PBSF基因的PA317细胞产生的前-B细胞的形成。在图5C中，按照实施例4中所述制备纯化的PBSF，并以所示体积加至骨髓细胞中。通过证实所形成的集落表达B220Ag和细胞浆μ链但不表达表面Ig，证实有前-B细胞的出现。
实施例6PBSF的体内生物活性A.转基因小鼠将携带PBSF基因的1.78KbHindⅢ克隆到类似于V19.12但含有大鼠白蛋白启动子而不是SV40早期启动子的V19.13中。将DNA片段插入到大鼠白蛋白和加强子的3′方向。通过在CsCl上走带并用1X注射缓冲液(注射缓冲液是10mMTris，0.1mMEDTA，PH7.5)透析而纯化含有白蛋白启动子的PBSFcDNA的编码序列。每个卵细胞注射1-2ng/μl的DNA(相当于大约线性DNA分子的500个拷贝)。将注射的卵细胞植入假孕小鼠中，20天以后出现子代。通过对从尾巴中分离的DNA进行PCR扩增确定“建立者”(founder)中的PBSFDNA序列存在。将从尾血收集的血液在Sysmex上进行分析以对白血球、红血球和血小板进行计数。
然后使“建立者”近亲交配产生F1动物，对其进行筛选是否有PBSF基因的存在。通过反转录和PCR对从F1小鼠的肝脏、骨髓、脾脏和肌肉分离的RNA进行筛选以检测PBSF的表达。
为了对PBSF表达的全身效应特征化，分离F1的不同器官，且固定之，并切成薄的切片以进行组织化学分析。
B.幼鼠的反转录病毒感染给3至4日龄的Balb/c幼鼠肌肉内注射50μl的条件培养基混合物，该混合物是由用mpZen载体，含编码G-CSF的基因的mpZen载体或含PBSF基因的mpZen转染的PA317细胞制备的条件培养基和由用野生莫洛尼(Moloney)病毒感染的NIH3T3细胞制备的条件培养基的混合物。PA317条件培养基和3T3条件培养基以分别为10∶1(V/V)的比例存在。在1、2、3个月的间隔之后，从尾静脉采血存放于EDTA涂层的微量离心管中。制备血液涂片以进行吉姆萨(Giemsa)染色和分类计数。进行血液的Sysmex分析以对白血球、红血球和血小板计数。在死亡时或在安乐死术后，取出选择的生命器官用于组织学分析。
C.骨髓基因转移对B57/J小鼠进行辐射以破坏骨髓细胞。然后用从供体动物中获得的骨髓细胞对这些鼠进行骨髓细胞移植，所说的供体动物已用携带有mpZen载体或含G-CSF或PBSF基因的载体的PA317细胞在体外通过共同培养5天而进行感染。经过以存活证实了移植成功之后，从血液中分离RNA，并分析相应外源基因的表达。然后通过Sysmex对血液进行分类学分析。
实施例7PBSF表达的诱导和组织特异性A.PBSF表达的诱导对在各种诱导条件下的PBSF表达进行研究以确定是否能在一般的已知条件下诱导P64表达以激发细胞激动素的合成。按照实施例1B和1C中所述，从用商陆分裂素(PWM)或PWM和放线菌酮处理的或未处理的外周血淋巴细胞分离RNA。将RNA在一种1.2%琼脂糖凝胶上电泳，并用来源于寡聚dT引导的外周血淋巴细胞文库的、通过随机引物方法用32P标记的PBSF cDNA克隆进行探测筛选。结果示于图6。
对处于人白血病细胞诱导分化期间的PBSF的表达也进行了Northern印迹分析。对三个来源于人体的脊髓单核细胞系(HL-60，ATCCNo.CCL-240，KG-1，ATCCNo.CCL-246和ML-1，(Samaletal.Leuk.Res.14，575-580(1990))通过用PMA、肿瘤坏死因子(TNF)或TNF和IL-6处理以诱导朝巨噬细胞分化。分离RNA，并按如用于PWM和放线菌酮诱导所述进行Northern分析。结果示于图7。在由PWM诱导的HL-60细胞中观察到了最高水平的PBSFmRNA合成。在任何条件下的KG-1和ML-1细胞中只观察到了非常低水平的P64mRNA。
B.PBSF表达的组织特异性通过Northern分析和RT/PCR测定P64的组织特异性表达。使用A节中所述的32P标记的PBSF克隆作为探针，通过Northern印迹分析(Lehrach H.et al.Biochem，16，4743(1977))对大约10μg来源于人脑、肺和胎盘的总RNA(均购自Clontech Laboratories)和10μg来源于HeLa和PMA活化Jurkat细胞的RNA进行分析。发现PBSF RNA存在于肺组织和HeLa细胞中。
用RT/PCR分析(Noonanetal.NucleicAcidRes.16，10366(1988))获得了类似的结果。按照实施例1E所述，从大约10μg来源于HeLa细胞和来源于人脑、心脏、骨骼肌、脾脏、胸腺、骨髓、肾、肝、肺、睾丸和胎盘的总RNA合成第一股cDNA。通过自动热循环仪(PerkinElmerCetus，)使用具有下列序列的两个引物5′AGGGATGGAACTACATTC3′(有意义引物);和3′TCATAGCTATCGCTGACC3′(反意引物)来扩增PBSFmRNA。有意义引物序列与SEQ.ID.No.1中的核苷酸323-340相对应，而反意引物与SEQ.ID.No.1中的核苷酸855-872互补。在严格的条件下使引物杂交，总共27个循环以便使退火温度为大约处于引物-模板复合物的溶解温度(Tm)之下2℃。在1.5%琼脂糖凝胶上分析所产生的引物延伸产物。结果示于图8。在HeLa细胞、骨髓、肝和肺中有PBSFmRNA表达，而除了在40次或更多次循环时外，所测定的其他组织很少可检测出其表达。通过Southern印迹分析证实鉴别出的扩增产物是PBSF。使用通过随机引导用32P标记的PBSF克隆的一种1190bp HindⅢ/XbaⅠ亚片段作为探针。
尽管以优选实施例的形式描述了本发明，应当明白的是对于那些本领域中的技术人员而言可以对本发明有所变更或修改。因此，应当指出所附带的权利要求书包括了落在本发明权利要求范围之内的所有这些等同变化。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人Samal，BabruB.
(ⅱ)发明名称祖代B细胞刺激因子(ⅲ)序列数10(ⅳ)联系地址(A)收件人AmgenInc.
(B)街道AmgenCenter.1840DehavillandDrive(C)城市ThousandOaks
(D)州加利福尼亚(E)国家美国(F)邮政编码91320-1789(V)计算机阅读形式(A)媒介类型软盘，3.5in.，DS，1.4MB(B)计算机AppleMacintosh(C)操作系统MacintoshOS7.0(D)软件MicrosoftWordVersion5.0(ⅵ)本申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(2)SEQIDNo1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度2376核苷酸(B)类型核酸(C)链数双链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNo1
CGCGCGGCCC CTGTCCTCCG GCCCGAG ATG AAT CCT GCG GCA GAA 45Met Asn Pro Ala Ala Glu15GCC GAG TTC AAC ATC CTC CTG GCC ACC GAC TCC TAC AAG GTT 87Ala Glu Phe Asn Ile Leu Leu Ala Thr Asp Ser Tyr Lys Val101520ACT CAC TAT AAA CAA TAT CCA CCC AAC ACA AGC AAA GTT TAT 129Thr His Tyr Lys Gln Tyr Pro Pro Asn Thr Ser Lys Val Tyr2530TCC TAC TTT GAA TGC CGT GAA AAG AAG ACA GAA AAC TCC AAA 171Ser Tyr Phe Glu Cys Arg Glu Lys Lys Thr Glu Asn Ser Lys354045TTA AGG AAG GTG AAA TAT GAG GAA ACA GTA TTT TAT GGG TTG 213Leu Arg Lys Val Lys Tyr Glu Glu Thr Val Phe Tyr Gly Leu505560CAG TAC ATT CTT AAT AAG TAC TTA AAA GGT AAA GTA GTA ACC 255Gln Tyr Ile Leu Asn Lys Tyr Leu Lys Gly Lys Val Val Thr657075AAA GAG AAA ATC CAG GAA GCC AAA GAT GTC TAC AAA GAA CAT 297Lys Glu Lys Ile Gln Glu Ala Lys Asp Val Tyr Lys Glu His808590TTC CAA GAT GAT GTC TTT AAT GAA AAG GGA TGG AAC TAC ATT 339Phe Gln Asp Asp Val Phe Asn Glu Lys Gly Trp Asn Tyr Ile95100CTT GAG AAG TAT GAT GGG CAT CTT CCA ATA GAA ATA AAA GCT 381Leu Glu Lys Tyr Asp Gly His Leu Pro Ile Glu Ile Lys Ala105110115GTT CCT GAG GGC TTT GTC ATT CCC AGA GGA AAT GTT CTC TTC 423Val Pro Glu Gly Phe Val Ile Pro Arg Gly Asn Val Leu Phe120125130ACG GTG GAA AAC ACA GAT CCA GAG TGT TAC TGG CTT ACA AAT 465Thr Val Glu Asn Thr Asp Pro Glu Cys Tyr Trp Leu Thr Asn135140145TGG ATT GAG ACT ATT CTT GTT CAG TCC TGG TAT CCA ATC ACA 507Trp Ile Glu Thr Ile Leu Val Gln Ser Trp Tyr Pro Ile Thr150155160
GTG GCC ACA AAT TCT AGA GAG CAG AAG AAA ATA TTG GCC AAA 549Val Ala Thr Asn Ser Arg Glu Gln Lys Lys Ile Leu Ala Lys165170TAT TTG TTA GAA ACT TCT GGT AAC TTA GAT GGT CTG GAA TAC 591Tyr Leu Leu Glu Thr Ser Gly Asn Leu Asp Gly Leu Glu Tyr175180185AAG TTA CAT GAT TTT GGC TAC AGA GGA GTC TCT TCC CAA GAG 633Lys Leu His Asp Phe Gly Tyr Arg Gly Val Ser Ser Gln Glu190195200ACT GCT GGC ATA GGA GCA TCT GCT CAC TTG GTT AAC TTC AAA 675Thr Ala Gly Ile Gly Ala Ser Ala His Leu Val Asn Phe Lys205210215GGA ACA GAT ACA GTA GCA GGA CTT GCT CTA ATT AAA AAA TAT 717Gly Thr Asp Thr Val Ala Gly Leu Ala Leu Ile Lys Lys Tyr220225230TAT GGA ACG AAA GAT CCT GTT CCA GGC TAT TCT GTT CCA GCA 759Tyr Gly Thr Lys Asp Pro Val Pro Gly Tyr Ser Val Pro Ala235240GCA GAA CAC AGT ACC ATA ACA GCT TGG GGG AAA GAC CAT GAA 801Ala Glu His Ser Thr Ile Thr Ala Trp Gly Lys Asp His Glu245250255AAA GAT GCT TTT GAA CAT ATT GTA ACA CAG TTT TCA TCA GTG 843Lys Asp Ala Phe Glu His Ile Val Thr Gln Phe Ser Ser Val260265270CCT GTA TCT GTG GTC AGC GAT AGC TAT GAC ATT TAT AAT GCG 885Pro Val Ser Val Val Ser Asp Ser Tyr Asp Ile Tyr Asn Ala275280285TGT GAG AAA ATA TGG GGT GAA GAT CTA AGA CAT TTA ATA GTA 927Cys Glu Lys Ile Trp Gly Glu Asp Leu Arg His Leu Ile Val290295300TCG AGA AGT ACA CAG GCA CCA CTA ATA ATC AGA CCT GAT TCT 969Ser Arg Ser Thr Gln Ala Pro Leu Ile Ile Arg Pro Asp Ser305310GGA AAC CCT CTT GAC ACT GTG TTA AAG GTT TTG GAG ATT TTA 1011Gly Asn Pro Leu Asp Thr Val Leu Lys Val Leu Glu Ile Leu315320325GGT AAG AAG TTT CCT GTT ACT GAG AAC TCA AAG GGT TAC AAG 1053Gly Lys Lys Phe Pro Val Thr Glu Asn Ser Lys Gly Tyr Lys330335340TTG CTG CCA CCT TAT CTT AGA GTT ATT CAA GGG GAT GGA GTA 1095
Leu Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Val Ile Gln Gly Asp Gly Val345350355GAT ATT AAT ACC TTA CAA GAG ATT GTA GAA GGC ATG AAA CAA 1137Asp Ile Asn Thr Leu Gln Glu Ile Val Glu Gly Met Lys Gln360365370AAA ATG TGG AGT ATT GAA AAT ATT GCC TTC GGT TCT GGT GGA 1179Lys Met Trp Ser Ile Glu Asn Ile Ala Phe Gly Ser Gly Gly375380GGT TTG CTA CAG AAG TTG ACA AGA GAT CTC TTG AAT TGT TCC 1221Gly Leu Leu Gln Lys Leu Thr Arg Asp Leu Leu Asn Cys Ser385390395TTC AAG TGT AGC TAT GTT GTA ACT AAT GGC CTT GGG ATT AAC 1263Phe Lys Cys Ser Tyr Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Ile Asn400405410GTC TTC AAG GAC CCA GTT GCT GAT CCC AAC AAA AGG TCC AAA 1305Val Phe Lys Asp Pro Val Ala Asp Pro Asn Lys Arg Ser Lys415420425AAG GGC CGA TTA TCT TTA CAT AGG ACG CCA GCA GGG AAT TTT 1347Lys Gly Arg Leu Ser Leu His Arg Thr Pro Ala Gly Asn Phe430435440GTT ACA CTG GAG GAA GGA AAA GGA GAC CTT GAG GAA TAT GGT 1389Val Thr Leu Glu Glu Gly Lys Gly Asp Leu Glu Glu Tyr Gly445450CAG GAT CTT CTC CAT ACT GTC TTC AAG AAT GGC AAG GTG ACA 1431Gln Asp Leu Leu His Thr Val Phe Lys Asn Gly Lys Val Thr455460465AAA AGC TAT TCA TTT GAT GAA ATA AGA AAA AAT GCA CAG CTG 1473Lys Ser Tyr Ser Phe Asp Glu Ile Arg Lys Asn Ala Gln Leu470475480AAT ATT GAA CTG GAA GCA GCA CAT CAT TAGGCTTTAT 1510Asn Ile Glu Leu Glu Ala Ala His His485490
GACTGGGTGT GTGTTGTGTG TATGTAATAC ATAATGTTTA TTGTACAGAT 1560GTGTGGGGTT TGTGTTTTAT GATACATTAC AGCCAAATTA TTTGTTGGTT 1610TATGGACATA CTGCCCTTTC ATTTTTTTTC TTTTCCAGTG TTTAGGTGAT 1660CTCAAATTAG GAAATGCATT TAACCATGTA AAAGATGAGT GCTAAAGTAA 1710GCTTTTTAGG GCCCTTTGCC AATAGGTAGT CATTCAATCT GGTATTGATC 1760TTTTCACAAA TAACAGAACT GAGAAACTTT TATATATAAC TGATGATCAC 1810ATAAAACAGA TTTGCATAAA ATTACCATGA TTGCTTTATG TTTATATTTA 1860ACTTGTATTT TTGTACAAAC AAGATTGTGT AAGATATATT TGAAGTTTCA 1910GTGATTTAAC AGTCTTTCCA ACTTTTCATG ATTTTTATGA GCACAGACTT 1960TCAAGAAAAT ACTTGAAAAT AAATTACATT GCCTTTTGTC CATTAATCAG 2010CAAATAAAAC ATGGCCTTAA CAAAGTTGTT TGTGTTATTG TACAATTTGA 2060AAATTATGTC GGGACATACC CTATAGAATT ACTAACCTTA CTGCCCCTTG 2110TAGAATATGT ATTAATCATT CTACATTAAA GAAAATAATG GTTCTTACTG 2160GAATGTCTAG GCACTGTACA GTTATTATAT ATCTTGGTTG TTGTATTGTA 2210CCAGTGAAAT GCCAAATTTG AAAGGCCTGT ACTGCAATTT TATATGTCAG 2260AGATTGCCTG TGGCTCTAAT ATGCACCTCA AGATTTTAAG GAGATAATGT 2310TTTTAGAGAG AATTTCTGCT TCCACTATAG AATATATACA TAAATGTAAA 2360ATACTTACAA AAGTGG 2376(3)SEQIDNo2的资料(ⅰ)序列特征(A)长度45核苷酸(B)类型核酸(C)链数单链(D)拓扑结构线性
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNo2ACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTGCCCCAGCCCC45(4)SEQIDNo3的资料(ⅰ)序列特征(A)长度45核苷酸(B)类型核酸(C)链数单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNo3CTTGCACTTGTCACAAACAGTGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAG45(5)SEQIDNo4的资料(ⅰ)序列特征(A)长度45个核苷酸(B)类型核酸(C)链数单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNo4AACGAGGCTTATGTGCACGATGCACCTGTACGATCATGAACTGC45(6)SEQIDNo5的资料(ⅰ)序列特征(A)长度45核苷酸
(B)类型核酸(C)链数单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNo5GTGTTGCCTGCTGCCTCCCCTGCCCCAGTACCCCCAGGAGAAGAT45(7)SEQIDNo6的资料(ⅰ)序列特征(A)长度45核苷酸(B)类型核酸(C)链数单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEDIDNo6CTGGTCCGCCCCGGACTCCAAGCTCCCATGACCCAGACAACGCCC45(8)SEQIDNo7的资料;
(ⅰ)序列特征(A)长度30个核苷酸(B)类型核酸(C)链数单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNo;7ATGTCGACMWCSVTGCMCCHRYMYSMYCMA30
(9)SEQIDNo8的资料(ⅰ)序列特征(A)长度14个核苷酸(B)类型核酸(C)链数单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNo8GCTTGAATTCAAGC14(10)SEQIDNo9的资料(ⅰ)序列特征(A)长度13个核苷酸(B)类型核酸(C)链数双链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNo9CTTTCCAGACACAGAAGGTC13(11)SEQIDNo10的资料(ⅰ)序列特征(A)长度16个氨基酸(B)类型氨基酸
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No:10:
Cys Arg Glu Lys Thr Glu Asn Ser Lys Leu1510Arg Lys Val Lys Tyr1权利要求
1.一种具有刺激产生前-B细胞活性的纯化的和分离的多肽。
2.如权利要求1的多肽，其中刺激产生前-B细胞的活性是在干细胞因子和白细胞介素-7存在下才具有的。
3.如权利要求1的多肽，它具有SEQ.ID.No.1中所示的氨基酸序列或其一个生物学活性片段或类似物。
4.如权利要求3的多肽，它具有SEQ.ID.No.1中所示的从残基15至491或者从残基32至491的氨基酸序列。
5.如权利要求3的多肽，其特征在于它是一种外源DNA序列的原核或真核表达产物。
6.如权利要求5的多肽，它是CHO细胞表达的产物。
7.如权利要求5的多肽，其中外源序列是一种cDNA序列。
8.如权利要求5的多肽，其中该外源序列是一种基因组DNA序列。
9.如权利要求5的多肽，其中该外源序列是一种合成的DNA序列。
10.如权利要求5的多肽，其中该外源序列是被一种自动复制DNA质粒或病毒载体所携带。
11.如权利要求1或5的多肽，其进一步特征在于它是与一种可检测的标记共价结合。
12.如权利要求5的多肽，其进一步特征在于它与一种水溶性聚合物共价结合。
13.如权利要求5的多肽，它有一个蛋氨酸残基从所说多肽的氨基末端部分续展。
14.一种DNA序列，编码一种具有刺激产生前-B细胞活性的多肽，其中所说的序列选自下列一组序列a)SEQ.ID.No.1中所示的DNA序列及其互补链;b)与(a)中序列杂交的DNA序列;和c)除了遗传密码子的简并外能与(a)和(b)中序列杂交的DNA序列。
15.如权利要求14的DNA序列，它是cDNA。
16.如权利要求14的DNA序列，它是基因组DNA。
17.如权利要求14的DNA序列，它是合成的DNA。
18.如权利要求14的DNA序列，它与一种可检测的标记共价结合。
19.如权利要求14的DNA序列，它包括一个或多个优选用于在大肠杆菌宿主细胞中表达的密码子。
20.如权利要求14的DNA序列，基本上由SEQ.ID.NO1组成。
21.一种生物功能性质粒或病毒DNA载体，包含一个如权利要求14或20的DNA序列。
22.一种用权利要求21的DNA载体稳定转化或转染的原核或真核宿主细胞。
23.一种原核或真核宿主细胞表达的多肽产物，所说的宿主细胞是用权利要求14或20的DNA序列以允许所说多肽、片段或类似物表达的方式转化或转染的。
24.一种纯化权利要求1或4多肽的方法，所说的方法包括a)将一种抗体结合到一种固体相载体上，所说抗体特异性结合该因子;b)使所说被结合的抗体与一种含有多肽的溶液接触，以使多肽与抗体选择性地结合;和c)洗脱该结合的多肽。
25.一种产生根据权利要求4所说多肽的方法，所说方法包括在合适的营养条件下，将用权利要求13、14或21的一种DNA序列转化或转染的原核生物真核生物宿主细胞以允许所说多肽表达方式生长;和分离所说DNA序列表达的所说多肽。
26.一种药物组合物，含有一种权利要求1治疗有效量的多肽和一种药物学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。
27.一种治疗哺乳动物体内造血性疾病的方法，包括施用一种根据权利要求1的治疗有效量的PBSF和治疗有效量的一种或几种IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、SCF、L-BCGF或H-BCGF。
28.一种治疗经过骨髓移植的病人的方法，包括施用一种根据权利要求1的治疗有效量的多肽和治疗有效量的一种或几种IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、SCF、L-BCGF或H-BCGF。
29.如权利要求27的方法，其中造血性疾病是一种前-B细胞缺陷，并且PBSF与IL-7和SCF一起给药。
30.一种融合蛋白，它包括人一致性干扰素或牛生长激素的氨基末端延伸的部分或全部氨基酸序列，所说的人一致性干扰素或牛生长激素已与一种具有SEQ.ID.NO1中所示的从2位至491位氨基酸序列的多肽在框架内进行融合。
31.如权利要求30的融合蛋白，它是在大肠杆菌宿主细胞中的表达产物。
32.一种特异性结合权利要求1多肽或其肽片段的抗体。
33.一种特异性结合权利要求31融合蛋白的抗体。
34.权利要求32或33的抗体，它是一种单克隆抗体。
全文摘要
本文描述了一种祖代B细胞刺激因子，它促进前-B细胞的形成。本文还公开了该因子的生产和纯化方法以及编码该因子的DNA的序列。该因子可以用于治疗造血性疾病和用于骨髓移植。
文档编号C07K16/24GK1094093SQ9312143
公开日1994年10月26日 申请日期1993年11月18日 优先权日1992年11月20日
发明者B·B·沙马尔 申请人:安姆根有限公司