一种纯化重组人粒细胞集落刺激因子的方法

专利名称：一种纯化重组人粒细胞集落刺激因子的方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及药用重组人粒细胞集落刺激因子蛋白 的纯化，特别涉及反相填料层析方法在重组人粒细胞集落剌激因子的纯化方法。
技术背景粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,简称重组人粒 细胞集落刺激因子)具有促进粒细胞造血干细胞增殖分化及增强成熟细胞功能 的作用，对于骨髓移植时促进中性白细胞增加、癌症化疗时引起的严重的中性 粒细胞缺乏症、以及再生障碍性贫血伴随的中性白细胞缺乏症均有明显的疗效， 但其天然产物来源非常有限，而基因工程的重组重组人粒细胞集落刺激因子的 生物学活性与天然的相似，且可大规模生产。重组人粒细胞集落刺激因子主要来源于巨噬细胞、内皮细胞及纤维母细胞。 能高度特异性的刺激中性白细胞系的前体细胞存活、增殖和分化，同时也是成 熟的中性白细胞的功能活化因子。重组人粒细胞集落刺激因子是糖蛋白，它的 分子量是19.6KD，等电点为约为6.0，分子中含有5个半胱氨酸残基，可形成 两个二硫键。基因定位在染色体17，它的基因含有5个外显子和4个内含子， 现已成功地分离出两个cDNA，分别编码177个和174个氨基酸的蛋白质。分析 表明两种形式的重组人粒细胞集落刺激因子都有生物活性，但作用上可能有所 差别。1993年，瞿成奎等人在国内首先克隆了人重组人粒细胞集落剌激因子 cDNA，并在大肠杆菌中获得表达。由于原核细胞表达系统缺乏糖基化等翻译后 的加工能力，生产的重组人粒细胞集落刺激因子在体内会部分降解而降低药效， 所以研究人员在真核细胞表达系统中进行了重组人粒细胞集落刺激因子基因的构建，均成功地实现了重组人粒细胞集落刺激因子的表达。为了使重组人粒细 胞集落刺激因子的产量有进一步的提高，研究人员还进行了将重组人粒细胞集 落刺激因子与其它细胞因子融合表达的研究，崔立斌等人成功的获得了重组人 粒细胞集落刺激因子-硫氧还原蛋白融合蛋白的可溶性表达，表达水平为总细胞 可溶蛋白的41%。目前，有关重组人粒细胞集落刺激因子分离纯化的方法己有许多相关报道。 冃前，大多釆用"离子交换色谱一排阻色谱"纯化法来纯化重组人粒细胞集落刺激因子。先纯化重组人粒细胞集落刺激因子的包含体，可得到含量为90%重组人粒细胞集落刺激因子的包含体，然后进行复性和一歩离子交换层析，可使最终蛋白纯度达到95%,回收率为35%。通过"离子交换色谱一疏水层析"纯 化重组人粒细胞集落刺激因子，比活可达到6.1Xl(^U/mg，蛋白纯度为98%， 回收率为13.2%。采用稀释法复性蛋白，之后经SP-seharoseFF阳离子层析纯化 至纯度95%，重组人粒细胞集落刺激因子的比活可达到2.3 X 108 U/mg。反相液相色谱(reverse - phase liquid chromato2graphy ， RPLC)是目前液相 色谱分离中使用最为广泛的一种模式，其特点是固定相的极性比流动相弱。 RPLC与其他色谱方法相比具有分辨率和回收率高、重复性好、操作简便等优 势。由于RPLC可使用挥发性体系如水溶三氟乙酸(TFA)、乙腈(ACN)等，纯 化产物不必进行洗脱，因此大大简化了操作步骤。另外，在RPLC中，蛋白质 分子通过色谱柱时会发生或多或少的去折叠，内部某些疏水残基暴露并与固定 相相互作用，从而表现出与其他色谱及电泳方法不同的选择性，提供其他方法不 能提供的信息，这成为RPLC在蛋白质分离分析中的又一有利因素。因此，RPLC 己成为目前广泛使用的一种分离模式，普遍用于蛋白质的分离分析。Chlenov等 用RPLC对甲状腺刺激激素进行了纯化，Chertov等对T-淋巴细胞趋化因子进行了RPLC纯化分析。传统方法复性和纯化重组人粒细胞集落刺激因子主要遇到的问题是重组 人粒细胞集落刺激因子的疏水性很强，在稀释复性时，大量的蛋白聚集沉淀， 仅有少量的蛋白在溶液中复性，进而才能继续被分离纯化。针对重组人粒细胞 集落剌激因子的这一特点，本发明采用反相色谱填料对重组人粒细胞集落刺激 因子液进行了纯化，不仅使重组人粒细胞集落剌激因子的纯度和比活达到满意 的结果，而且大大简化了操作步骤、縮短了生产周期。 发明内容本发明可解决现有重组人粒细胞集落刺激因子纯化技术的不足，是对基因工程蛋白分离纯化手段的创新，大幅度提高重组人粒细胞集落刺激因子分离纯 化后的蛋白纯度、比活和稳定性。本发明解决的技术问题所采用的技术方案是在纯化工艺中采用了反相填料 的精细分离纯化步骤。包括步骤a、 将工程菌进行发酵培养；b、 对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到粗品包涵体；c、 对粗品包涵体进行复性，获得复性产物；d、 对复性产物进行离子柱层析处理，得到离子柱层析产物；e、 离子柱层析产物进行精细分离，采用反相填料柱层析处理，得到蛋白。 同现有技术相比较，采用本专利的反相填料精细分离，重组人粒细胞集落刺激因子电泳纯度由90%提高到99%， HPLC纯度由90X提高到99X，其比活由 6.1X107U/mg提高到2.3X108U/mg。可见，采用本发明的重组人粒细胞集落刺 激因子的纯化工艺，可以大幅度的提高重组人粒细胞集落刺激因子的纯度、比 活、稳定性。降低在临床中的副作用。
具体实施方式
以下通过实施例、实验例详细说明本发明的内容，但这些实施例并不构成 对本发明的限制。 实施例1使用半制备型MKF-RP柱。样品阳离子层析产物200ml，蛋白浓度2mg/ml。配制洗脱液A为含50mmolNaCl和20mmol Tris-HCl缓冲液(pH 8)，洗脱液 B为含50mmolNaCl溶液20mmol Tris-HCl 60。/。乙腈(pH 8)。先用洗脱液A洗脱，再用梯度洗脱15X-90X洗脱液B洗脱，10-55分钟收集样品峰。被收集的样品经低温蒸发，除去有机物质，然后透析浓縮后保存在4'C条件下。实施例2使用XK 50/30柱，用SBC MCL GEL型反相制备液相色谱填料装柱。 样品阴离子层析产物500ml，蛋白浓度2.2mg/ml。洗脱液A为20%磷酸盐缓冲液，洗脱液B为含0.02%tween80的30%甲醇 溶液，流速为15ml /min 。梯度洗脱，在10-80分钟20X-75。/。洗脱液B洗脱，收集样品峰。收集样品 时，收集中间部分。被收集的样品经低温蒸发，除去有机物质，然后透析浓縮 后保存在4"C条件下。实施例3使用Butyl-Sepharose 4Fast Flow， XK50H16层析柱。样品阴离子层析产物500ml，蛋白浓度1.5mg/ml。添加硫酸铵到0.8M。平衡液20mmol/mlTris-HCl， PH8.0， 0.8M硫酸铵 预洗脱液20mmol/mlTris-HCl， PH8.0, 0.5M硫酸铵 洗脱液20mmol/mlTris-HCl， PH8.0， 0.2M硫酸铵收集洗脱液洗脱部分，透析除盐即得。在4。C条件下对实施例1、 2、 3的样品进行稳定考察，考察结果如下:0月批号比活电泳纯度HPLC纯度内毒素蛋白浓度实施例12. 3X10Wmg99%99%符合规定1. 3mg/ml实施例22. 1 X 108U/mg99%99%符合规定1. 3mg/ml实施例30. 6X108U/mg92%92%符合规定1. 2mg/ml3月批号比活电泳纯度HPLC纯度内毒素蛋白浓度实施例12. 3X108U/mg99%99%符合规定1. 3mg/ml实施例22. 1 X 108U/mg99%99%符合规定1. 3mg/ml实施例30. 6X108U/mg91%92%符合规定1. 2mg/ml6月批号比活电泳纯度HPLC纯度内毒素蛋白浓度实施例12. 2X108U/mg98%98%符合规定1. 3mg/ml实施例22.0XlOWmg98%97%符合规定1. 2mg/ml实施例30. 5X108U/mg89%88%符合规定1. lmg/ml12月批号比活电泳纯度HPLC纯度内毒素蛋白浓度实施例12. 0X詢/mg98%98%符合规定1. 2mg/ml实施例21. 9X 108U/mg97%97%符合规定1. 2mg/ml实施例30. 4X108U/mg86%85%符合规定1. Omg/ml以上数据说明，通过反向填料方法获得的实施例1、 2样品较实施例3，电泳纯度与HPLC纯度在12个月内均大于97%，比活达到2.0X 108U/mg以上，其他各项指标也符合药典要求，实施例l、 2样品可在4。C条件下放置12个月， 实施例3样品在考察6个月时出现比活降低，蛋白纯度下降的现象。说明通过 反向填料方法获得重组人粒细胞集落刺激因子蛋白更加稳定。 '
权利要求
1、一种纯化重组人粒细胞集落刺激因子的工艺方法。其特征在于采用了反相填料层析分离。
2、 根据权利要求1所述的反相填料层析分离前的样品要求，其特征在于经过初 步的分离纯化。
3、 根据权利要求2所述的初步分离纯化，其特征在于经过阴离子或阳离子柱层 析处理。
4、 根据权利要求1所述的反相填料柱，其特征在采用预装型柱和制备型杵。
5、 根据权利要求1所述的反相填料层析，其特征在采用反相色谱预装柱或反相 填料预装柱。
全文摘要
本发明涉及一种纯化重组人粒细胞集落刺激因子的方法。本发明首次将反相填料的精细分离步骤应用于重组人粒细胞集落刺激因子的纯化工艺中。同现有技术相比较，本发明首次采用反相填料精细分离重组人粒细胞集落刺激因子，电泳纯度由90％提高到99％，HPLC纯度由90％提高到99％，其比活由6.1×10⁷U/mg提高到2.3×10⁸U/mg。采用本发明的重组人粒细胞集落刺激因子的纯化工艺，可以大幅度的提高重组人粒细胞集落刺激因子的纯度、比活、稳定性，将有效降低其在临床中的副作用。
文档编号C07K1/20GK101597319SQ20081006465
公开日2009年12月9日 申请日期2008年6月3日 优先权日2008年6月3日
发明者淼 于, 冷国庆, 睿 庞, 李会成, 李郑武, 梁秋波, 赵华南, 静 陈, 陈玉军 申请人:哈药集团生物工程有限公司