专利名称：一种胸腺五肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域中多肽的合成方法，具体说是一种胸腺五肽液相合成制备方法。 可适用于大规模。
技术背景胸月泉五肽，英文名Thymopoietin pentapeptide; TP-5; Thymopentin， 结构式为 Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-0H，分子式及分子量C,。H化NA，679.77 。胸腺五肽通过促进或抑制的双向调节作用使免疫能力趋于7H常，是一种很有发展前景的 免疫功能调节药物。而且迄今为止的实验药理学研究和临床药理学研究以及临床应用均未发 现胸腺五肽有任何毒副作用。胸腺五肽于1985年在意大利上市，商品名为Timunox 。传统的胸腺五肽合成均由固相合成法完成，成本高，难于规模化生产，产物纯化难度很大，有时甚至用高压液相色谱法也难于达到所希望的纯度。发明内容本发明提供了一种采用混合酸酐法合成胸腺五肽Arg-Lys- Asp- Val-Tyr-0H的方法。 所述方法过程有二肽合成-三肽合成-四欣合成-五肽合成-粗品生成；它是以N-甲基吗啉 为催化剂，采用氯甲酸垸基酯为活化剂，活化被保护的氨基酸形成高反应活性的混合酸酐， 与氨基端裸露的氨基酸或肽反应来合成胸腺五肽；各肽合成中均采用N-甲基吗啉为催化剂， 氯甲酸烷基酯为活化剂，氯甲酸烷基酯(ClC0具，RpEt、 'Bu)选用氯甲酸乙酯、氯甲酸异丁 酯。各肽合成过程包括混合酸酐的生成-过滤-减压浓縮-酸碱洗涤-千燥除水-各肽生成-脱保 护基的过程，合成五肽后，脱掉保护基团，生成粗品胸腺五肽，再纯化；所述被保护的氨基酸按各肽合成顺序是酪氨酸苄酯与缬氨酸的混合酸酐反应得到二肽、天门冬氨酸的混合酸酐 与二肽反应得到三肽、赖氨酸的混合酸酐与三肽反应得到四肽、精氨酸的混合酸酐与四肽反 应得到五肽粗品，所用氨基酸的2-氨基采用芴甲氧羰基(Fmoc)保护，精氨酸的2-氨基由叔 T氧羰基(Boc)保护，天门冬氨酸的侧链羧基采用叔丁酯基保护，赖氨酸的侧链氨基用叔丁 氧羰基基保护，精氨酸的侧链胍基HC1保护，酪氨酸的酚羟基用苄基保护，羧基用酯基保护； 酪氨酸酯为酪氨酸苄酯。混合酸酐的生成过程中的反应温度为-20 -15°C;各肽合成过程中 的反应温度为-10 (TC。酸洗涤-干燥除水，分别用稀盐酸和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠 干燥；脱保护基过程为，加入哌啶脱除芴甲氧羰基(Fmoc)保护基团，减压浓縮后，用醚洗； 加入有机溶剂溶解，有机溶剂可以是二氯甲垸、氯仿，在用二氯甲烷或氯仿溶解并冷藏备用， 其中溶剂优选二氯甲垸；所述粗品生成是指合成五肽后，用三氟乙酸-巯基茴香醚系统脱除所 有保护基团。在粗品生成后的纯化过程为，用制备性高压液相色谱纯化，得到纯度大于99%的胸腺五 肽水溶液，然后用冷冻干燥机冷冻干燥得到白色冻干粉状物固体，纯度可以达到99%以上。 所用的各种保护氨基酸均能很容易从厂家购得。本发明与现有技术相比有如下优点 1产成本相对较低，以固相合成胸腺五肽为例，其实际产率仅为理论产率的50%,而本发明 的产率大于理论产率的60%;2在整个的生产工艺中所用的试剂价格相对较低；3在整个的生产过程中所主要采用的是通用设备，而不象现有技术中需依赖大型设备，因此 生产费用较低；4生产工艺较为简单，反应过程易于控制，生产工艺的可重复性强； 5综合生产周期较短，进一步减小生产成本，提高生产效率； 6合成规模可大幅度提高，容易实现工业化的大规模生产。
具体实施方式
以下通过实施例、实验例详细说明本发明的内容，但这些实施例并不构成对本发明的限制。实施例1 二肽化合物Val-Try(Bzl)0bzl HC1的合成把13. 58克的Fmoc-Val-0H溶解于160ml 二氯甲垸中，加入35ml的N-甲基吗啉，反应 瓶冷却，在-20 -15'C条件下向其中加入6.76ml的氯甲酸丁酯，反应10分钟后，将15. 92 克酪氨酸苄醚苄酯盐酸盐的二氯甲垸溶液160ml预冷至-15 -l(TC加入反应瓶内，再向其中 加入8ml的N-甲基吗啉，加样完毕后，反应自然恢复至室温。并继续反应l小时，至反应完 全。加入2%稀盐酸水溶液洗涤3次和饱和食盐水洗涤3次，有机层用无水硫酸钠十燥，过滤 出干燥剂，加入80ml哌啶，搅拌20分钟，减压蒸T-，得黄色油状物，用石油醚洗涤干燥得 固体18. 29克。实施例2 三肽化合物Asp(OBut)-Val-Try(Bzl)Obzl HC1的合成。将实施例1中合成的二肽化合物18.29克，用160ml 二氯甲垸溶解预冷至-15'C ，备用。 将16. 46克Fmoc-Asp-OH溶解于160ml 二氯甲烷中，向其中加入35ml N-甲基吗啉，反 应瓶冷却，在-20 -15'C条件下向其中加入6.76ml的氯甲酸丁酯，反应10分钟后，再向反 应瓶内加入上述预冷的脱Fmoc-保护后的二肽的二氯甲烷溶液，将反应自然恢复至室温，并 继续搅拌1小时左右，用TLC和HPLC检测反应至完全结束后，加入2%稀盐酸水溶液洗涤3 次和饱和食盐水洗涤3次，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤出干燥剂，加入80ml哌啶，搅拌20分钟，减压蒸干，得黄色油状物，用石油醚洗涤干燥得固体25.36克。 实施例3 四肽化合物Lys(OBut)- Asp (OBut)-Val-Try (Bzl) Obzl HC1的合成。将实施例2中合成的三肽化合物25. 36克，用160ml 二氯甲烷溶解预冷至-15。C，放置冰相备用o使18. 74克Fmoc-Lys ( OBut)-OH溶于160ml 二氯甲烷中，向其中加入35ml N-甲基吗啉， 反应瓶冷却，在-20 -15'C条件下向其中加入6.76ml的氯甲酸丁酯，反应10分钟后，再向 反应瓶内加入上述预冷的脱Fmoc-保护后的三肽的二氯甲烷溶液，将反应自然恢复至室温， 并继续搅拌1小时左右，用TLC和HPLC检测反应至完全结束后，加入2%稀盐酸水溶液洗涤3 次和饱和食盐水洗涤3次，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤出干燥剂，加入80ml哌啶，搅 袢20分钟，减压蒸干，得黄色油状物，用石油醚洗漆干燥得固体34.45克。 实施例4 五肽化合物Arg- Lys(OBut)- Asp(0But)-Va1-Try (Bzl)Obzl HC1的合成。将实施例3中合成的三肽化合物34. 45克，用160ml 二氯甲垸溶解预冷至-15'C ,放置冰 箱备用。将13. 12克Boc-Arg-OH HC1溶于160ml 二氯甲烷中，向其中加入35ml N-甲基吗啉， 反应瓶冷却，在-20 -15'C条件下向其中加入6. 76ml的氯甲酸丁酯，反应10分钟后，再向 反应瓶内加入上述预冷的脱Fmoc-保护后的四肽的二氯甲垸溶液，将反应自然恢复至室温， 并继续搅拌1小时左右，用TLC和HPLC检测反应至完全结束后，加入2%稀盐酸水溶液洗涤3 次和饱和食盐水洗涤3次有机层用无水硫酸钠干燥，过滤出干燥剂，加入80ml哌啶，搅 拌20分钟，减压蒸干，得黄色油状物，用石油醚洗涤干燥得固体50.65克。 实施例5胸腺五肽粗肽的合成向50.65克五肽化合物Arg- Lys(0But)- Asp (OBut) -Val-Try (Bzl) Obzl HC1中加入 400 ml切割液(95%TFA、 2. 5%水、2. 5%巯基茴香醚)反应2小时，冷却至-40。C。加入用乙 醚5L和石油醚10L (预先冷却至-4CTC)的混合溶液析出结品。然后离心干燥得胸腺五肽粗 品约40克。实施例6胸腺五肽的纯化将40克胸腺五肽粗品溶于200ml水中，调PH值8. 0，制备型高压液相色谱柱纯化(C18 柱乙腈/水梯度洗脱)冷冻干燥机干燥得胸腺五肽为白色冻干粉状固体16克，收率60%。
权利要求
1.一种合成胸腺五肽Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH的方法，其特征在于进行如下步骤的反应(1)酪氨酸苄酯盐酸盐为起始原料，以N-甲基吗啉为催化剂，采用氯甲酸烷基酯为活化剂，活化Fmoc-Val-OH形成高活性的混合酸酐，与Tyr(Bzl)-Obzl·HCl反应，得到Fmoc-Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl二肽；(2)采用脱保护试剂将(1)中制得的二肽的氨端脱保护，得到Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl二肽；(3)以N-甲基吗啉为催化剂，采用氯甲酸烷基酯为活化剂，活化Fmoc-Asp(OBut)-OH形成高活性的混合酸酐，使(2)中制得的产物与Fmoc-Asp(OBut)-OH反应得到Fmoc-Asp(OBut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl三肽；(4)采用脱保护试剂将(3)中制得的三肽的氨端脱保护，得到Asp(OBut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl三肽；(5)以N-甲基吗啉为催化剂，采用氯甲酸烷基酯为活化剂，活化Fmoc-Lys(OBut)-OH形成高活性的混合酸酐，与(4)中制得的产物反应，得到Fmoc-Lys(OBut)-Asp(OBut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl四肽；(6)采用脱保护试剂将(5)中制得的四肽的氨端脱保护，得到Lys(OBut)-Asp(OBut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl四肽；(7)以N-甲基吗啉为催化剂，采用氯甲酸烷基酯为活化剂，活化Boc-Arg-OH·HCl形成高活性的混合酸酐，与(6)中制得的产物反应，得到保护的Boc-Arg-Lys(OBut)-Asp(OBut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl五肽；(8)将(7)中制得的五肽中加入适量的TFA/H2O/TIS＝95/2.5/2.5脱保护，得到Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH五肽。
2. 权利要求1的方法，所述方法还包括将(8)中制得的产物经C18反相柱纯化脱盐，得到纯 化产物。
3. 权利要求1的方法缩合步骤采用氯甲酸乙酯或氯甲酸异丁酯为活化剂。
4. 权利要求1的方法所述，其步骤(1)、 (3)、 (5)和(7)中混合酸酐生成过程中的反应温 度为-20'C -lOt:,各肽生成反应温度为-1(TC (TC，其步骤(2)、 (4)、 (6)脱保护反应温 度为20"C 30。C，其步骤(8)脱保护反应温度为10'C 4(TC。
5. 权利要求1的方法所述，其步骤(1)、 (3)、 (5)和(7)中混合酸酐生成过程中的反应时 间为0.5 1小时，各肽生成反应为] 4小时，其步骤(2)、 (4)、 (6)脱保护反应时间为 20分钟~40分钟。
全文摘要
本发明公开了一种胸腺五肽的制备方法。包括如下步骤以酪氨酸苄酯盐酸盐为起始原料，以N-甲基吗啉为催化剂，采用氯甲酸烷基酯为活化剂，活化被保护的氨基酸形成高活性的混合酸酐与氨基端裸露的氨基酸或肽反应。通过二肽合成-三肽合成-四肽合成-五肽合成-粗品生成-纯化，制备高纯度胸腺五肽。本发明的方法简化了工艺，三废污染少，便于工业化实施。
文档编号C07K1/02GK101597318SQ20081006465
公开日2009年12月9日 申请日期2008年6月3日 优先权日2008年6月3日
发明者任仲辉, 冷国庆, 李会成, 李郑武, 胜 梁, 王永存, 田学萍, 葛存慧, 赵华南, 陈玉军 申请人:哈药集团生物工程有限公司