专利名称：一种酶合成胸腺五肽的方法
技术领域：
本发明属于多肽激素制备技术领域，特别涉及一种酶合成胸腺五肽的方法。
背景技术：
胸腺肽是动物胸腺产生的一种多肽激素，在我国临床应用已有20多年的历史，普通胸腺肽属于生化制品，是健康小牛或猪等动物的胸腺组织提取物。该药是一种生物反应调节因子，能促进淋巴细胞成熟，调节和增强人体免疫机制，在临床上具有抗衰老、抗病毒复制、抗肿瘤细胞分化的作用。由于胸腺肽有效成分不明确、含量低、含致敏大分子蛋白，不符合WHO对免疫调节剂的五项标准(化学成分明确；易于降解；刺激适中；不致癌，致畸变；无累积毒性，无不良反应及后继作用)，因而疗效低、安全性差，不良反应尤其是严重过敏反应频繁发生，由此引发了国家药品不良反应监测中心对该类药品进行通报。使用胸腺肽制剂曾出现过敏性休克、皮疹、发热、寒战、畏寒，胸闷、心悸、呼吸困难、头痛、紫绀等多项不良反应，使用前需做皮内敏感试验，在皮试阴性时，仍需加强临床用药监护。胸腺五肽是人工合成的五肽，其氨基酸序列为Arg-Lys-Asp-Val-Tyr (精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-酪氨酸)，取自胸腺肽的第32-36位氨基酸，为胸腺肽的主要活性部位，与胸腺肽有着相同的生理功能和药效，其特点是药物纯度高、含量稳定、安全可靠，且不含有大分子蛋白质，在临床推广过程中，胸腺五肽由于纯度高、质量稳定、疗效确切、安全可靠而受到广大医患的欢迎，使用前无需皮试。胸腺五肽是具有良好药效的五肽类药物，开发成熟、成本较低的合成胸腺五肽方法，具有重要的社会意义和巨大的市场前景。国内生产胸腺五肽这样高端产品的企业只有几家，而且都是应用化学方法合成的。化学方法合成的缺点表现在反应条件剧烈，合成中存在产物消旋化的问题，需要对侧链基团进行保护，有副反应，产品难于回收，易造成化学污染，工艺复杂，成本高，生产效率低。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种酶合成胸腺五肽的方法。本发明的目的通过下述技术方案实现:一种酶合成胸腺五肽的方法，包括如下步骤:(I)叔丁氧羰基-缬氨酸-酪氨酸-甲酯(Boc-Val-Tyr-OMe) 二肽的合成:将0.2 0.8mol/L pH5.0 8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比4 10:40 55:20 35依次加入木瓜蛋白酶(papain，PA)、叔丁氧羰基-纟颜氨酸(Boc-Val)和酪氨酸-甲酯(Tyr-OMe),于30 60°C反应12 48h,得到叔丁氧羰基-缬氨酸-酪氨酸-甲酯二肽；(2 )[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7_五甲基苯并呋喃_5_磺酰基)_赖氨酸-甲酯](Boc-Arg (pbf) -Lys-Ome) 二妝的合成:将 0.6 1.2mol/L pH4.0 7.0 三轻甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比4 10:45 55:40 55依次加入木瓜蛋白酶、[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)](Boc-Arg(pbf))和赖氨酸-甲酯(Lys-OMe),于30 60°C反应36 72h,得到[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)-赖氨酸-甲酯]二肽；(3 )[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7_五甲基苯并呋喃_5_磺酰基)_赖氨酸-天冬氛酸 _ 甲酷](Boc-Arg (pbf) -Lys-Asp-OMe)三妝的合成:将 0.2 0.8mol/L pH5.0
8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比3 10:2 7:4 10依次加入木瓜蛋白酶、[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃_5_磺酰基)-赖氨酸](Boc-Arg (pbf)-Lys)和天冬氨酸_甲酯(Asp-OMe),于30 60°C反应36 72h，得到[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃_5_磺酰基)-赖氨酸-天冬氨酸-甲酯]三肽；(4)精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-酪氨酸(Arg-Lys-Asp-Val-Tyr)五肽的合成:将0.2 0.8mol/L pH5.0 8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比2 6:4 10:4 10依次加入木瓜蛋白酶、[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2, 4, 6, 7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)_赖氨酸-天冬氨酸](Boc-Arg (pbf) -Lys-Asp)和缬氨酸-酪氨酸-甲酯(Val-Tyr-OMe)，于30 60°C反应36 72h，得到混合物；将混合物处理后，得到精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-酪氨酸五肽；步骤(I)中:所述的0.2 0.8mol/L pH5.0 8.0三羟甲基氨基甲烷_盐酸缓冲液与乙酸乙酯体积比为0.5 2:1，优选为1:1 ；所述的叔丁氧羰基-缬氨酸-酪氨酸-甲酯二肽的合成优选采用以下方法进行:将0.2 0.6mol/L pH5.0 7.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比8:44:23依次加入木瓜蛋白酶、叔丁氧羰基-缬氨酸和酪氨酸-甲酯，于40 60 V反应12 48h，得到 叔丁氧羰基-缬氨酸-酪氨酸-甲酯二肽；步骤(2)中:所述的0.6 1.2mol/L pH4.0 7.0三羟甲基氨基甲烷_盐酸缓冲液与乙酸乙酯的体积比为0.05 0.2:1，优选为0.11:1 ;所述的[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃_5_磺酰基)-赖氨酸-甲酯]二肽优选采用以下方法进行合成:将0.8 1.0mol/L pH4.0 7.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比4 8:53:46依次加入木瓜蛋白酶、[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)]和赖氨酸-甲酯，于50 60°C反应48 72h，得到[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)-赖氨酸-甲酯]二肽；步骤(3)中:所述的0.2 0.8mol/L pH5.0 8.0三羟甲基氨基甲烷_盐酸缓冲液与乙酸乙酯的体积比为0.05 0.2:1，优选为0.11:1 ;所述的[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃_5_磺酰基)-赖氨酸-天冬氨酸-甲酯]三肽优选采用以下方法进行合成:将0.3 0.6mol/L pH6.0 7.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比3 6:7:6依次加入木瓜蛋白酶、[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)_赖氨酸]和天冬氨酸-甲酯，于40 50°C反应36 48h，得到[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)-赖氨酸-天冬氨酸-甲酯]三肽；步骤(4)中:所述的0.2 0.8mol/L pH5.0 8.0三羟甲基氨基甲烷_盐酸缓冲液与乙酸乙酯的体积比为0.05 0.2:1，优选为0.11:1 ;所述的精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-酪氨酸五肽优选采用以下方法进行合成:将0.2 0.6mol/L pH5.0 7.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比2 6:8:8依次加入木瓜蛋白酶、[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)-赖氨酸-天冬氨酸]和缬氨酸-酪氨酸-甲酯，于40 50°C反应36 72h，得到混合物；将混合物处理后，得到精氨酸_赖氨酸_天冬氨酸-缬氨酸-酪氨酸五肽；所述的混合物处理优选采用以下方法进行:将混合物加入95%的三氟乙酸中，避光条件下，室温反应I 2h，得到反应液；将反应液加入甲醇中，加入LiOH，调pH至13，室温反应I 2h，得到精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-酪氨酸五肽；所述的95%的三氟乙酸是指三氟乙酸和水按体积比95:5混合得到的混合液；本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:本发明以木瓜蛋白酶为催化剂、在乙酸乙酯-水中合成胸腺五肽，提高了胸腺五肽的合成效率，酶的利用率高，生产成本低；产品容易回收，不会造成化学污染，工艺简单，具有重要的社会意义和巨大的市场前景。在乙酸乙酯-水中合成胸腺五肽，反应条件温和；立体专一性强，避免了在化学法合成中存在的产物消旋问题；不用侧链保护基，几无副反应；有机底物在有机溶剂中比在水中溶解性好，而酶不溶于有机介质，因此酶易于回收；由氨基酸合成肽的反应在水中热力学平衡是不利的，如果在有机溶剂中进行，则有利于平衡向形成肽键的方向移动；酶在有机溶剂中比在水中更稳定，不存在由于微生物污染而使酶失活的问题。
图1是实施例1的标样Boc-Val-Tyr-OMe的总离子流图与质谱图；其中a为标样Boc-Val-Tyr-OMe的总离子流图，b为标样Boc-Val-Tyr-OMe的质谱图。图2是实施例1合成的Boc-Val-Tyr-OMe的总离子流图与质谱图；其中a为Boc-Val-Tyr-OMe的总离子流图，b为Boc-Val-Tyr-OMe的质谱图。图3是实施例1的标样Boc-Arg (pbf) -Lys-OMe的总离子流图与质谱图；其中a为Boc-Arg (pbf) -Lys-OMe 的总离子流图，b 为 Boc-Arg (pbf)-Lys-OMe 的质谱图。图4是实施例1合成的Boc-Arg(pbf)-Lys-OMe的总离子流图与质谱图；其中a为Boc-Arg (pbf) -Lys-OMe 的总离子流图，b 为 Boc-Arg (pbf)-Lys-OMe 的质谱图。图5是实施例1的标样Boc-Arg (pbf)-Lys-Asp-OMe的总离子流图与质谱图；其中a 为 Boc-Arg(pbf)- Lys-Asp-OMe 的总离子流图，b 为 Boc-Arg(pbf)-Lys-Asp-OMe 的质谱图。图6实施例1合成的Boc-Arg (pbf)-Lys-Asp-OMe的总离子流图与质谱图；其中a为 Boc-Arg(pbf)-Lys-Asp-OMe 的总离子流图，b 为 Boc-Arg(pbf)-Lys-Asp-OMe 的质谱图。
图7是实施例1的标样Arg-Lys-Asp-Val-Tyr的总离子流图与质谱图；其中a为Arg-Lys-Asp-Val-Tyr 的总离子流图，b 为 Arg-Lys-Asp-Val-Tyr 的质谱图。图8实施例1合成的Arg-Lys-Asp-Val-Tyr的总离子流图与质谱图；其中a为Arg-Lys-Asp-Val-Tyr 的总离子流图，b 为 Arg-Lys-Asp-Val-Tyr 的质谱图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1(I)Boc-Val-Tyr-OMe 二肽的合成:将 0.2mol/L ρΗ6.0 的 Tris-HCl 缓冲液 0.5ml加入0.5ml乙酸乙酯中，搅拌均勻，然后依次加入8mg木瓜蛋白酶(PA)、44mg Boc-Val和23mg Tyr-OMe,于 40°C反应 48h，得到 Boc-Val-Tyr-OMe 二肽；产率为 63.7% ；标样Boc-Val-Tyr-OMe的总离子流图与质谱图见图1，PA催化合成的物质的总离子流图与质谱图见图2 ;从总离子流图与质谱图可以看出PA成功合成了 Boc-Val-Tyr-OMe二肽，其分子量为411.5,与标样的分子量411.5 一致；(2) Boc-Arg (pbf) -Lys-OMe 二肽的合成:将 0.8mol/L ρΗ7.0 的 Tris-HCl 缓冲液0.1ml加入0.9ml乙酸乙酯中，搅拌均勻，然后依次加入4mg木瓜蛋白酶(PA)、53mgBoc-Arg (pbf)和 46mg Lys-OMe,于 50°C 反应 72h,得到 Boc-Arg (pbf)-Lys-OMe 二妝；产率为 66.93% ；标样的Boc-Arg(pbf)-Lys-OMe的总离子流图与质谱图见图3, PA催化合成的Boc-Arg (pbf) -Lys-OMe的总离子流图与质谱图见图4 ;从总离子流图与质谱图可以看出PA成功合成了 Boc-Arg (pbf )-Lys-OMe 二肽，其分子量为669.2，与标样的分子量669.3几乎一致；(3) Boc-Arg (pbf) -Lys-Asp-OMe 三妝的合成:将 0.3mol/L pH7.0 的 Tris-HCl缓冲液0.1ml加入0.9ml乙酸乙酯中，搅拌均勻，然后依次加入3mg木瓜蛋白酶(PA)、7mgBoc-Arg (pbf) -Lys 和 6mg Asp-OMe,于 40°C 反应 48h,得到 Boc-Arg (pbf)-Lys-Asp-OMe 三肽，产率为26.9%；标样的Boc-Arg (pbf)-Lys-Asp-OMe总离子流图与质谱图见图5, PA催化合成的Boc-Arg (pbf)-Lys-Asp-OMe的总离子流图与质谱图见图6。从总离子流图与质谱图可以看出PA成功合成了 Boc-Arg (pbf)-Lys-Asp-OMe三肽,其分子量为784.3,与标样的分子量784.2几乎一致；(4) Arg-Lys-Asp-Val-Tyr 五妝的合成:将 0.3mol/L pH7.0 的 Tris-HCl 缓冲液0.1ml加入0.9ml乙酸乙酯中，搅拌均勻，然后依次加入2mg木瓜蛋白酶(PA)、8mgBoc-Arg (pbf)-Lys-Asp和8mg Val-Tyr-OMe,于40°C反应72h,得到混合物；将混合物加入95%的三氟乙酸0.2ml中，避光条件下，室温反应lh，得到反应液；将反应液加入甲醇0.3ml中，加入LiOH，调pH至13，室温反应lh，得至IJ Arg-Lys-Asp-Val-Tyr五肽；产率为17.8% ；标样的Arg-Lys-Asp-Val-Tyr总离子流图与质谱图见图7, PA催化合成的Arg-Lys-Asp-Val-Tyr总离子流图与质谱图见图8 ;从总离子流图与质谱图可以看出PA成功合成了 Arg-Lys-Asp-Val-Tyr五肽,其分子量为679.8,与标样的分子量680.4几乎一致。
实施例2(I)Boc-Val-Tyr-OMe 二肽的合成:将 0.6mol/L ρΗ5.0 的 Tris-HCl 缓冲液 0.5ml加入0.5ml乙酸乙酯中，搅拌均勻，然后依次加入8mg木瓜蛋白酶、44mgBoc_Val和23mgTyr-OMe,于 50°C反应 36h，得到 Boc-Val-Tyr-OMe 二肽；产率为 52.8% ；(2) Boc-Arg (pbf) -Lys-OMe 二妝的合成:将 1.0mol/L pH4.0 的 Tris-HCl 缓冲液0.1ml加入0.9ml乙酸乙酯中，搅拌均勻，然后依次加入8mg木瓜蛋白酶、53mgBoc-Arg (pbf)和 46mg Lys-OMe,于 50°C 反应 60h,得到 Boc-Arg (pbf)-Lys-OMe 二妝；产率为 65.01% ；(3) Boc-Arg(pbf)-Lys-Asp-OMe 三妝的合成:将 0.4mol/L pH6.0 的 Tris-HCl缓冲液0.1ml加入0.9ml乙酸乙酯中，搅拌均勻，然后依次加入6mg木瓜蛋白酶、7mgBoc-Arg (pbf) -Lys 和 6mg Asp-OMe,于 50°C 反应 36h, Boc-Arg (pbf)-Lys-Asp-OMe 三妝，产率为21.1% ；(4) Arg-Lys-Asp-Val-Tyr 五妝的合成:将 0.2mol/L ρΗ6.0 的 Tris-HCl缓冲液0.1ml加入0.9ml乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后依次加入6mg木瓜蛋白酶、8mgBoc-Arg (pbf) -Lys-Asp 和 8mg Val-Tyr-OMe,于 50°C反应 36h,得到混合物；将混合物加入95%的三氟乙酸0.2ml中，避光条件下，室温反应1.5h，得到反应液；将反应液加入甲醇
0.3ml中，加入LiOH，调pH至13，室温反应L 5h得到Arg-Lys-Asp-Val-Tyr五肽；产率为
15.1%。实施例3 (I)Boc-Val-Tyr-OMe 二肽的合成:将 0.4mol/L ρΗ7.0 的 Tris-HCl 缓冲液 0.5ml加入0.5ml乙酸乙酯中，搅拌均勻，然后依次加入8mg木瓜蛋白酶、44mgBoc_Val和23mgTyr-OMe,于 60°C反应 12h，得到 Boc-Val-Tyr-OMe 二肽；产率为 48.4% ；(2) Boc-Arg (pbf) -Lys-OMe 二妝的合成:将 1.0mol/L pH4.0 的 Tris-HCl 缓冲液0.1ml加入0.9ml乙酸乙酯中，搅拌均勻，然后依次加入4mg木瓜蛋白酶、53mgBoc-Arg (pbf)和 46mg Lys-OMe,于 60°C 反应 48h,得到 Boc-Arg (pbf)-Lys-OMe 二妝；产率为 52.6% ；(3) Boc-Arg(pbf)-Lys-Asp-OMe 三妝的合成:将 0.6mol/L pH7.0 的 Tris-HCl缓冲液0.1ml加入0.9ml乙酸乙酯中，搅拌均勻，然后依次加入4mg木瓜蛋白酶、7mgBoc-Arg (pbf)-Lys 和 6mg Asp-OMe,于 40°C反应 48h, Boc-Arg (pbf)-Lys-Asp-OMe 三妝,产率为17.3% ；(4) Arg-Lys-Asp-Val-Tyr 五妝的合成:将 0.6mol/L pH5.0 的 Tris-HCl 缓冲液
0.1ml加入0.9ml乙酸乙酯中，搅拌均勻，然后依次加入4mg木瓜蛋白酶(papain, PA)、8mgBoc-Arg (pbf)-Lys-Asp和8mg Va1-Tyr-OMe,于40°C反应48h,得到混合物；将混合物加入95%的三氟乙酸0.2ml中，避光条件下，室温反应2h，得到反应液；将反应液加入甲醇0.3ml中，加入LiOH，调pH至13，室温反应2h，得到Arg-Lys-Asp-Val-Tyr五肽；产率为11.9%。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种酶合成胸腺五肽的方法，其特征在于包括如下步骤: (I)叔丁氧羰基-缴氨酸-酪氨酸-甲酯二肽的合成:将0.2 0.8mol/L pH5.0 8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比4 10:40 55:20 35依次加入木瓜蛋白酶、叔丁氧羰基-缴氨酸和酪氨酸-甲酯，于30 60V反应12 48h，得到叔丁氧羰基-缬氨酸-酪氨酸-甲酯二肽； (2 )[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)-赖氨酸-甲酯]二肽的合成:将0.6 1.2mol/L pH4.0 7.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均勻，然后按质量比4 10:45 55:40 55依次加入木瓜蛋白酶、[叔丁氧羰基_精氨酸(2，2, 4, 6, 7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)]和赖氨酸-甲酯，于30 60°C反应36 72h，得到[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)-赖氨酸-甲酉旨]二肽； (3)[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)-赖氨酸-天冬氨酸-甲酯]三肽的合成:将0.2 0.8mol/L pH5.0 8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比3 10:2 7:4 10依次加入木瓜蛋白酶、[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)-赖氨酸]和天冬氨酸-甲酯，于30 60°C反应36 72h，得到[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)-赖氨酸-天冬氨酸-甲酯]三肽； (4)精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-酪氨酸五肽的合成:将0.2 0.Smol/LpH5.0 8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比2 6:4 10:4 10依次加入木瓜蛋白酶、[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)-赖氨酸-天冬氨酸]和缬氨酸-酪氨酸-甲酯，于30 60°C反应36 72h，得到混合物；`将混合物处理后，得到精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-酪氨酸五肽。
2.根据权利要求1所述的酶合成胸腺五肽的方法，其特征在于:步骤(I)中所述的0.2 0.8mol/L pH5.0 8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液与乙酸乙酯体积比为0.5 2:1。
3.根据权利要求1所述的酶合成胸腺五肽的方法，其特征在于:步骤(2)中所述的0.6 1.2mol/L pH4.0 7.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液与乙酸乙酯的体积比为0.05 0.2:1。
4.根据权利要求1所述的酶合成胸腺五肽的方法，其特征在于:步骤(3)中所述的0.2 0.8mol/L pH5.0 8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液与乙酸乙酯的体积比为0.05 0.2:1。
5.根据权利要求1所述的酶合成胸腺五肽的方法，其特征在于:步骤(4)中所述的0.2 0.8mol/L pH5.0 8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液与乙酸乙酯的体积比为0.05 0.2:1。
6.根据权利要求1所述的酶合成胸腺五肽的方法，其特征在于:步骤(I)中所述的叔丁氧羰基-缬氨酸-酪氨酸-甲酯二肽的合成采用以下方法进行:将0.2 0.6mol/LpH5.0 7.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比8:44:23依次加入木瓜蛋白酶、叔丁氧羰基-缬氨酸和酪氨酸-甲酯，于40 60V反应12 48h，得到叔丁氧羰基-缬氨酸-酪氨酸-甲酯二肽。
7.根据权利要求1所述的酶合成胸腺五肽的方法，其特征在于:步骤(2)中所述的[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)_赖氨酸-甲酯]二肽采用以下方法进行合成:将0.8 1.0mol/L pH4.0 7.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比4 8:53:46依次加入木瓜蛋白酶、[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2, 4, 6, 7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)]和赖氨酸-甲酯，于50 60V反应48 72h，得到[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃_5_磺酰基)-赖氨酸-甲酯]二肽。
8.根据权利要求1所述的酶合成胸腺五肽的方法，其特征在于:步骤(3)中所述的[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)_赖氨酸-天冬氨酸-甲酯]三肽采用以下方法进行合 成:将0.3 0.6mol/L pH6.0 7.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比3 6:7:6依次加入木瓜蛋白酶、[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)-赖氨酸]和天冬氨酸-甲酯，于40 50°C反应36 48h，得到[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃_5_磺酰基)-赖氨酸-天冬氨酸-甲酯]三肽。
9.根据权利要求1所述的酶合成胸腺五肽的方法，其特征在于:步骤(4)中所述的精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-酪氨酸五肽采用以下方法进行合成:将0.2 0.6mol/L pH5.0 7.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比2 6:8:8依次加入木瓜蛋白酶、[叔丁氧羰基-精氨酸(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)-赖氨酸-天冬氨酸]和缬氨酸-酪氨酸-甲酯，于40 50°C反应36 72h，得到混合物；将混合物处理后，得到精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-酪氨酸五肽。
全文摘要
本发明公开了一种酶合成胸腺五肽的方法。本发明以木瓜蛋白酶为催化剂、在乙酸乙酯-水中合成胸腺五肽，工艺简单，提高了胸腺五肽的合成效率，酶的利用率高，生产成本低；产品容易回收，不会造成化学污染，具有重要的社会意义和巨大的市场前景。在乙酸乙酯-水中合成胸腺五肽，反应条件温和；立体专一性强，避免了在化学法合成中存在的产物消旋问题；不用侧链保护基，无副反应；有机底物在有机溶剂中比在水中溶解性好，而酶不溶于有机介质，因此酶易于回收；酶在有机溶剂中比在水中更稳定，不存在由于微生物污染而使酶失活的问题。
文档编号C12P21/02GK103103239SQ201310024160
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者何平, 邹倩儒 申请人:华南农业大学