专利名称：一种用磁性微球固定化米糠谷氨酸脱羧酶制备γ-氨基丁酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种用磁性微球固定化米糠谷氨酸脱羧酶制备Y-氨基丁酸的方法，属于米糠深加工技术领域。。
背景技术：
米糠作为稻谷的副产物，在中国来源十分丰富，可通过加工利用以实现其很高的附加值。米糠中的谷氨酸脱羧酶的酶活力很高，可以作为一种很好的催化剂，催化谷氨酸钠通过脱羧反应转化为GABA。GABA具有抗衰老、治疗癫痫、改善失眠等生理作用。目前世界上已经研究出GABA茶叶、高GABA粮食等，有良好的发展前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种用磁性微球固定化米糠谷氨酸脱羧酶制备Y-氨基丁酸的方法，用磁性壳聚糖微球固定从米糠中提取的谷氨酸脱羧酶，得到的GABA制备液中成分简单，且固定化酶易分离、可重复利用，从而实现GABA的制备与分离的同步进行，可扩大其应用范围。 本发明的技术方案一种用磁性微球固定化米糠中谷氨酸脱羧酶制备Y -氨基丁酸的方法，先将米糠用酶提取液提取出谷氨酸脱羧酶，与制备好的磁性壳聚糖微球进行微粒反应，得到磁性固定化谷氨酸脱羧酶；将此固定化酶与反应液混合，加入O. 01-0. 05mol/L的谷氨酸钠作为底物，摇床反应得到GABA制备液；(I)提取谷氨酸脱羧酶将新鲜米糠加入酶提取液中，提取谷氨酸脱羧酶。其中酶提取液为 pH5. 6,0. 05mol/LPBS 缓冲液，2mmol/L2_ 巯基乙醇，2mmol/LEDTA- 二钠，Immol/LPLP, ImmoI/L PMSF 和 10%甘油。(2)磁性壳聚糖微球的制备0. 5g磁性纳米微粒与20mL2. 5%的壳聚糖乙酸溶液混合，在搅拌下缓慢加入到80mL液体石腊和4mL Span-80混合溶液中，常温搅拌30min,加入10mL8%的戊二醛，40°C搅拌lh，用lmol/L NaOH溶液调pH至9-10，70°C搅拌2h，用磁铁吸出微球，并先后用石油醚、丙酮、蒸馏水反复洗涤，于60°C下真空干燥。磁性纳米微粒应粒径分布均匀，以保证固定后的磁性壳聚糖微球粒径分布均匀。(3)固定谷氨酸脱羧酶将制备好的磁性壳聚糖微球在pH4. 8-6. 4、0. 05mol/LPBS缓冲液中浸泡12h，加入I % -3%戊二醛交联2-6h，用PBS缓冲液反复洗涤磁性微球，再加入一定浓度的谷氨酸脱羧酶酶液固定l_5h，用PBS缓冲液反复洗涤磁性微球。(4)制备GABA :将固定化酶与ρΗ5· 6,0. 01-0. 05mol/L HAc-NaAc缓冲液混合，加入O. 01-0. 05mol/L的谷氨酸钠作为底物，在45°C下摇床反应6_14h得到GABA制备液。本发明的有益效果采用本发明方法制备的固定化谷氨酸脱羧酶，与游离酶相比，由于其具有磁性，可以利用磁铁直接从反应体系中完全分离，操作方便简单。本发明方法制备的GABA，与传统的直接富集法相比，成分相对简单，蛋白含量和糖含量基本为零。并且在过程中实现了 GABA的制备与分离同步进行，简化了操作，扩大了其应用范围。
图1为一种用磁性微球固定化米糠谷氨酸脱羧酶制备Y -氨基丁酸的方法的工艺流程图。
具体实施例方式实施例1称取IOg磁性壳聚糖微球，在pH5. 6,0. 05mol/LPBS缓冲液中浸泡12h，使其充分溶胀。加入浓度为1. 5%的戊二醛溶液，常温下避光交联4h。用磁铁吸出磁性微球，并用PBS缓冲液充分洗涤至检测不到戊二醛。称取冷冻干燥的谷氨酸脱羧酶，配制成蛋白质含量为lmg/mL的溶液进行复溶，离心取上清液IOOmL,加入上述磁性微球，4°C下固定3h。用磁铁吸出磁性微球，并用PBS缓冲液充分洗涤至无游离酶存在。将该磁性微球加入IOOmL pH5. 6、O. 05mol/LHAc-NaAc缓冲液中，再加入O. 04mol/L谷氨酸钠底物，在45°C水浴摇床上反应8h，用磁铁吸出磁性微球，溶液即为GABA制备液。实施例2称取IOg磁性壳聚糖微球，在pH5. 2、0.05mol/LPBS缓冲液中浸泡12h，使其充分溶胀。加入浓度为2%的戊二醛溶液，常温下避光交联5h。用磁铁吸出磁性微球，并用PBS缓冲液充分洗涤至检测不到戊二醛。称取冷冻干燥的谷氨酸脱羧酶，配制成蛋白质含量为lmg/mL的溶液进行复溶，离心 取上清液IOOmL,加入上述磁性微球，4°C下固定2h。用磁铁吸出磁性微球，并用PBS缓冲液充分洗涤至无游离酶存在。将该磁性微球加入IOOmL pH5. 6、O. 05mol/L HAc-NaAc缓冲液中，再加入O. 03mol/L谷氨酸钠底物，在45°C水浴摇床上反应10h，用磁铁吸出磁性微球，溶液即为GABA制备液。
权利要求
1.一种用磁性微球固定化米糠谷氨酸脱羧酶制备Y-氨基丁酸的方法，其特征是将米糠用酶提取液提取出谷氨酸脱羧酶，与制备好的磁性壳聚糖微球进行微粒反应，得到磁性固定化谷氨酸脱羧酶；将此固定化酶与反应液混合，加入O. 01-0. 05mol/L的谷氨酸钠作为底物，摇床反应得到Y-氨基丁酸制备液，具体工艺如下(1)提取谷氨酸脱羧酶新鲜米糠加入酶提取液，提取谷氨酸脱羧酶；(2)磁性壳聚糖微球的制备0.5g磁性纳米微粒与20mL2. 5%的壳聚糖乙酸溶液混合，在搅拌下缓慢加入到80mL液体石腊和4mL Span-80混合溶液中，常温搅拌30min,加入 10mL8%的戊二醛，40°C搅拌lh，再用Imol/LNaOH溶液调pH至9_10，70°C搅拌2h，用磁铁吸出微球，并先后用石油醚、丙酮、蒸馏水反复洗涤，于60°C下真空干燥；(3)固定谷氨酸脱羧酶0.05mol/LPBS缓冲液浸泡磁性壳聚糖微球12h，使其充分溶胀；加入戊二醛进行交联，用PBS缓冲液反复洗涤磁性微球；再加入一定浓度的酶液进行固定，用PBS缓冲液反复洗涤磁性微球；(4)制备Y-氨基丁酸将固定化酶与反应液混合，加入O.01-0. 05mol/L的谷氨酸钠作为底物，摇床反应得到Y-氨基丁酸制备液。
2.根据权利要求1所述的一种磁性微球固定化米糠中谷氨酸脱羧酶制备Y-氨基丁酸的方法，其特征在于所述的磁性纳米微粒指的是具有生物活性的磁性纳米微粒，其粒径分布均匀，平均粒径为20nm。
3.根据权利要求1所述的一种磁性微球固定化米糠中谷氨酸脱羧酶制备Y-氨基丁酸的方法，其特征在于所述的磁性壳聚糖微球固定谷氨酸脱羧酶的反应的PBS缓冲液的pH 值在4. 8-6. 4之间，戊二醛浓度为1% -3%，交联2-6h，固定l_5h。
4.根据权利要求1所述的一种磁性微球固定化米糠中谷氨酸脱羧酶制备Y-氨基丁酸的方法，其特征在于所述的固定化酶制备Y-氨基丁酸反应的反应液为PH5. 6、O.01-0. 05mo/LHAc-NaAc 缓冲液，反应时间 6_14h，底物浓度为 O. 01-0. 05mol/L。
全文摘要
一种用磁性微球固定化米糠谷氨酸脱羧酶制备γ-氨基丁酸的方法，属于米糠深加工技术领域。在传统制备γ-氨基丁酸(GABA)的方法中，所得产品蛋白、糖等杂质含量高，GABA纯度低，因此需要一种方法来提高GABA产品的纯度。本发明以稻谷加工后的副产物——新鲜米糠为原料，提取谷氨酸脱羧酶，以磁性壳聚糖微球作为固定化材料，来固定谷氨酸脱羧酶，并用此固定化酶来转化底物谷氨酸钠为GABA。该方法具有固定化酶易分离、可反复回收利用、反应过程温和，且GABA制备液成分相对简单等优点，对实现米糠的综合利用价值和提高其经济效益有重要的意义。
文档编号C12N9/88GK103045666SQ20131002389
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月23日 优先权日2013年1月23日
发明者张晖, 张媛媛, 齐希光, 钱海峰, 王立 申请人:江南大学