一种悬浮型活性固定化酶催化剂的制备方法
【技术领域】
[0001]—种悬浮型活性固定化酶催化剂的制备方法，属于酶生物催化有机合成领域。
【背景技术】
[0002]酶催化具有高效性、多样性、区域选择性、化学选择性以及反应条件温和等特点，可缩短合成路线，使生产过程更加简单，能耗小，对环境友好，业已成为当今精细化学品绿色合成催化剂应用领域的研究热点。而目前食用香精脂肪酸酯类多以化学法合成为主，一般通过强酸类物质等催化酯化制备得到，还使用有机溶剂等物质，对环境污染大，同时存在产品副反应多、色泽深、能耗高、有毒成分残留等问题，因而在当今食品安全及环境保护日趋严格的形势下，生物酶法催化酯化技术被认为是取代化学法生产脂肪酸酯的绿色工艺，应用前景广阔。同时，生物酶也存在价格高、易失活、游离酶在反应过程中易结块、不易回收、重复使用率低等缺点。因此，研究采用各种技术手段将生物酶固定在某种载体上，以维持更高的酶活性，提高酶的稳定性和重复使用率，是当前常用的技术思路。生物酶固定化的方法是指将酶通过吸附法或共价结合法负载到载体上。其中，吸附法存在着酶易脱落、酶活性低、重复使用率低、分离难等问题;共价结合法是指利用载体表面的活性基团与酶分子的功能活性基团形成共价键牢固连接而固定的一种方法，其需要寻找尽可能温和的共价键合反应物，在反应时避免酶的失活，另外需要寻找适宜的易分离负载材料，尽可能提高负载率和催化活性，具有较大技术难度。本发明旨在通过选择天然无毒、高负载率材料制备固定化酶催化剂，并同时实现合成反应后固定化酶催化剂的易分离，以提高酶的重复使用率。凹凸棒土为一种晶质水合镁铝硅酸盐矿物，具有独特的层链状结构特征，晶体呈针状、纤维状或纤维集合状，具有优异的吸附、脱色、耐高温等性能，其在我国蕴藏量丰富，价廉易得。基于凹凸棒土内部有多种孔道，外比表面积和内比表面积都非常大，具有优异的吸附性等特性，本发明选用其作为酶固定载体，当某种酶寄附于凹凸棒土晶体内部的大孔穴表面上时，可以产生协同催化效应，使反应速度加快，而反应生成物又可以从坡缕石粘土内部扩散释放出来，凹凸棒土晶体格架不被破坏；同时考虑到固定化酶存在的在合成后分离困难、不易回收等问题，本发明设计采用在反应液中可悬浮的颗粒材料，与凹凸棒土复合，制成悬浮型活性固定化酶催化剂，以解决催化剂在反应过程中及合成结束后的聚结、难分离问题，进一步提高酶催化效能和重复利用率。漂珠是粉煤灰中的一种能浮于水面的空心微珠，化学成分以S12和Al 203为主，具有壁薄中空、质量轻、吸附性能好、无毒价廉等特点。本发明将漂珠作为悬浮载体，负载凹凸棒土，制备悬浮型活性固定化酶催化剂，其具有高效催化、易分离回收再利用的特性，对开拓酶催化酯化技术应用领域，开发凹凸棒土、漂珠资源的高附加值产品市场具有现实意义。
【发明内容】
[0003]本发明选取一定粒径的漂珠及高比表面积多孔天然材料凹凸棒土，将经活化处理的凹凸棒土微粒以一定配比附接在漂珠表面，制成复合载体;再通过在复合载体表面引入的能够与酶发生特异性共价反应的活性基团，可在温和条件下实现与酶的键合固定，并发挥协同催化效应，提高酶的活性和反应转化率，并提高其稳定性。此制备技术可以应用于脂肪酸酯类酶催化合成，特别适于食用香精类如戊酸乙酯、己酸乙酯等的合成，其转化率高，后处理简单，易回收，重复利用率高，环保无污染，生产成本低，应有较好的应用前景。
[0004]本发明的技术方案:一种悬浮型活性固定化酶催化剂的制备方法，具体步骤为:
[0005]一、漂珠的活化处理
[0006]选取粒径范围为100-200μπι的漂珠，将Ig漂珠浸泡在10-20g 5_10%的稀硝酸中5_6h，50-60°C搅拌30min-lh，再超声分散20-30min，静置。滤出颗粒物，用去离子水洗涤，至洗液PH值为中性;将处理后的漂珠在200-300°C下加热l_2h，冷却，即制得活化漂珠，密闭干燥保存，备用(记为A)。
[0007]二、活性凹凸棒土的制备
[0008]1、凹凸棒土的活化处理
[0009]步骤:将1g凹凸棒土加至150-200g 5_10%的盐酸或硫酸溶液中，于40_60°C搅拌30min-lh，超声分散30min-lh，静置;离心沉淀分离后用去离子水洗涤，至洗液pH值为中性；将处理后的凹凸棒土在200-300°C下加热l_2h，冷却，即制得活性凹凸棒土，密闭干燥保存，备用。
[0010]2、功能化凹凸棒土的制备
[0011]步骤:将上述所得活性凹凸棒土加至pH为2的盐酸溶液中，于30-40°C搅拌20-30min，超声分散30-45min;再将上述分散液加到过量的2_( 3，4-二羟基苯基)乙胺水溶液中，剧烈搅拌1-1.5h，使2-(3，4-二羟基苯基)乙胺与活化凹凸棒土表面充分螯合;将试液离心分离，所得固体粉粒用去离子水洗涤，至洗液PH值为中性;再在80-95°C下真空干燥24h，得到表面活性基团修饰的功能化凹凸棒土(记为B)。
[0012]三、复合载体的制备
[0013]步骤:将IgA加入到装有固体含量为2-3%的10mL水性树脂的烧杯中，室温下搅拌10-20min，滤出颗粒物，平铺在洁净的搪瓷盘中，50_60°C下真空干燥2h;取5_8g B慢慢加至上述搪瓷盘中与A混合，不断筛动、翻匀，直至颗粒物呈滚动状;再在130-150°C下真空干燥lh，取出冷却，筛分去除多余B，即得复合载体(记为C)，密闭干燥保存，备用。
[0014]四、悬浮型活性固定化酶催化剂的制备
[0015]步骤:将0.5gC加入到200mL Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH 7.0)中，超声分散20-30min后，向上述溶液中加入10mL 50 %的戊二醛溶液，室温下搅拌，活化3_5h后，分离，所得固体产物用去离子水洗涤;再将上述产物加到含0.5g脂肪酶的300mL Tris-HCl缓冲液(0.05moI/L，pH 7.0)中，在4°C下反应15-24h后，分离，洗涤，得到悬浮型活性固定化酶催化剂颗粒，冷冻干燥后储存于_20°C下备用。
[0016]本发明的有益效果:通过应用本发明制备所得的悬浮型活性固定