g、CuSO4 · 5Η208· 4mg、KIL lmg、 MnSO4H2CM. 2mg、NaMoO4 · 2Η200· 3mg、H3BO30.0 3mg、CoCl2 · 6Η200· 7mg、ZnSO4 · 7H2028mg、 FeSO4 ·7Η2091π^、生物素0. 28mg、甲醇5mL及四环素10mg。）IOOmL中在30°C下进行需氧培 养。进行培养直到培养液的0D600达到1.8,通过离心分离回收培养上清。利用GC/MS分析 培养上清。
[0177] 其结果，在ME-ME-BDO株中检测到1，4-BD0,其浓度为llmM(10D600为6. 2mM)。另 一方面，在ME-CM80株中没有检测到1，4-BD0。
[0178] 由以上的情况显示：通过向具有丝氨酸途径的甲基营养菌导入1，4_BD0生物合成 相关酶基因簇（序列编号10)，可以由甲醇有效地生产1，4-BD0。
[0179] 实施例4
[0180] 向具有RuMP途径的甲基营养菌中导入I，4-BD0生物合成相关酶基因、和使用重组 体由甲醇生产1，4-BD0
[0181] 本实施例中，作为具有RuMP途径的甲基营养菌，使用了甲基营养性嗜甲基菌 (Methylophilus methylotrophus)(ATCC 53528)〇
[0182] 利用电穿孔法将实施例3中制备的pC80BD0导入甲基营养性嗜甲基菌 (M. methylotrophus)，得到MM-BDO株。作为对照，利用电穿孔法将pCM80导入甲基营养性 嗜甲基菌（M. methy lotrophus)，得到 MM-CM80 株。
[0183] 将MM-BDO株或MM-CM80株在实施例3中使用的以甲醇为唯一的碳源的合成B培 养基（其中，利用甲醇浓度1 % (v/v))的IOOmL中，在37°C下需氧地进行培养。在培养液 的0D600为1. 8-2. 0的时刻，通过离心分离回收上清。利用LC/MS分析培养上清。其结果， 在MM-BDO株中检测出1，4-BD0,但在MM-80株中没有检测到。由MM-BDO生产的1，4-BD0的 存储浓度为15mM(10D600为8. 3mM)。
[0184] 由以上的情况显示：通过向具有RuMP途径的甲基营养菌导入1，4-BD0生物合成相 关酶基因簇（序列编号10)，可以由甲醇有效地生产1，4-丁二醇。
[0185] 实施例5
[0186] 向大肠杆菌导入甲醇脱氢酶（MDH)基因、HPS基因、PHI基因及1，4-BD0生物合成 相关酶基因、和利用重组体由甲醇生产1，4-BD0
[0187] 构建作为1，4- 丁二醇生物合成相关酶基因簇的序列编号11的人工合成基因 (9123bp)。该基因族包含以下各基因 ：mdh (序列编号7 :甲醇脱氢酶）、HPS (序列编号8 : 3-己酮糖-6-磷酸合成酶）、PHI (序列编号9 :3_己酮糖-6-磷酸合成酶异构酶）、SucD (序 列编号2 :C〇A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶）、4HBd(序列编号3 :4_羟基丁酸脱氢酶）、 abfT(序列编号4 :4_羟基丁酸CoA转移酶）、以及adhE2 (序列编号5 :醛/醇脱氢酶2)。
[0188] 将序列编号11的人工合成基因克隆至pTrc99A载体的Ncol/Hindlll酶切部位， 制备pTrcMeBDO。pTrcMeBDO表达以下各基因 ：mdh (序列编号7 :甲醇脱氢酶）、HPS (序列 编号8 :3-己酮糖-6-磷酸合成酶）、PHI (序列编号9 :3_己酮糖-6-磷酸合成酶异构酶）、 SucD(序列编号2 :C〇A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶）、4HBd(序列编号3 :4_羟基丁酸脱氢 酶）、abfT(序列编号4 :4_羟基丁酸CoA转移酶）、以及adhE2 (序列编号5 :醛/醇脱氢酶 2) 〇
[0189] 作为对照载体，构建了从pTrcMeBDO编码的上述7种酶群中除去MDH而得到的表 达载体pTrcMDH(-)。并且，制备从pTrcMeBDO编码的上述7种酶群中除去作为1，4- 丁二醇 生物合成相关酶基因的SucD、4HBd、abfT、以及adhE2而得到的表达载体pTrcBDO(-)。
[0190] 将表达载体pTrcMeBDO、pTrcMDH(-)或pTrcBDO(-)导入大肠菌K12株，分别得到 EKMeBDO 株、EKMDH (-)株、以及 EKBDO (-)株。
[0191] 将各个的重组大肠杆菌在含有0. 05mM浓度的IPTG的甲醇营养合成C培养基（1L 含有 H3P0418g、K2SO4H. 28g、KOH 3. 9g、CaSO4 · 2H20 0· 9g、MgSO4 · 7H20 11. 7g、CuSO4 · 5H20 8. 4mg、KI I. lmg、MnSO4H2O 4. 2mg、NaMoO4 · 2H20 0. 3mg、H3BO30.0 3mg、CoCl2 · 6H20 0. 7mg、 ZnS04.7H20 28mg、FeS04.7H20 91mg、生物素 0.28mg、甲醇 5mL、氯霉素 34mg 及氨必西林 lOOmg。）IOOmL中，在37°C下需氧地进行培养。在培养液的0D600为I. 0-1. 6的时刻，通过 离心部分离，回收培养上清。
[0192] 通过LC/MS对回收的培养上清进行分析，EKMeBDO株中生成了 IlmM的 1，4-BD0(10D600为6. 9mM)，但EKBDO(-)株中几乎没有检测出。另外，EKMDH(-)株完全不 能生长。
[0193] 由上述可知：通过向非甲基营养菌的大肠杆菌中导入MDH基因、HPS基因、以及PHI 基因，在将甲醇作为主要碳源的培养基中能够使其高效地生长，且通过导入1，4-B0D生物 合成相关酶基因族（序列编号11)，有效地生成1，4-B0D。
【主权项】
1. 一种重组细胞，其通过将编码选自琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰CoA合成酶、CoA依赖 型琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原 酶、4-羟基丁醛脱氢酶、以及醇脱氢酶中的至少1种酶的基因导入宿主细胞中而得到，所述 宿主细胞为甲基营养菌，其中， 该基因在所述宿主细胞内表达， 所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种Cl化合 物生产1，4_ 丁二醇。2. -种重组细胞，其通过将下列基因导入宿主细胞而得到：编码选自2-酮戊二酸脱羧 酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁醛脱氢 酶、以及醇脱氢酶中的至少1种酶的基因，所述宿主细胞为甲基营养菌，其中， 该基因在所述宿主细胞内表达， 所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种Cl化合 物生产1，4_ 丁二醇。3. 如权利要求1或2所述的重组细胞，其具有选自丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径及木 酮糖单磷酸途径中的至少1种Cl碳同化途径作为甲醛的固定化途径。4. 如权利要求1~3中任一项所述的重组细胞，其进一步导入编码3-己酮糖-6-磷酸 合成酶的基因和编码6-磷酸-3-己酮糖异构酶的基因，该基因在宿主细胞内表达。5. 如权利要求1~4中任一项所述的重组细胞，其中，宿主细胞为甲醇利用性酵母， 并进一步导入编码将甲醇通过脱氢反应转变为甲醛的酶的基因，且该基因在宿主细胞内表 达。6. -种重组细胞，其通过将下列基因导入宿主细胞中而得到：赋予将甲醇和/或甲酸 转变为甲醛的功能的基因、赋予甲醛固定化能力的基因和编码选自琥珀酸半醛脱氢酶、琥 珀酰CoA合成酶、CoA依赖型琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移 酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁醛脱氢酶以及醇脱氢酶中的至少1种酶的基因， 该基因在所述宿主细胞内表达， 所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种Cl化合 物生产1，4_ 丁二醇。7. -种重组细胞，其通过将下列基因导入宿主细胞中而得到：赋予将甲醇和/或甲酸 转变为甲醛的功能的基因、赋予甲醛固定化能力的基因和编码选自2-酮戊二酸脱羧酶、 4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁醛脱氢酶 以及醇脱氢酶中的至少1种酶的基因， 该基因在所述宿主细胞内表达， 所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种Cl化合 物生产1，4_ 丁二醇。8. 如权利要求6或7所述的重组细胞，其中，赋予甲醛固定化能力的基因是编码3-己 酮糖-6-磷酸合成酶的基因和编码6-磷酸-3-己酮糖异构酶的基因。9. 如权利要求6或7所述的重组细胞，其具有选自丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径及木 酮糖单磷酸途径中的至少1种Cl碳同化途径作为甲醛的固定化途径。10. -种重组细胞，其通过将下列基因导入宿主细胞中而得到：赋予将甲醇和/或甲 酸转变为甲醛的功能的基因和编码选自琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰CoA合成酶、CoA依赖型 琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、 4-羟基丁醛脱氢酶以及醇脱氢酶中的至少1种酶的基因，所述宿主细胞具有核酮糖单磷酸 途径， 该基因在所述宿主细胞内表达， 所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种Cl化合 物生产1，4_ 丁二醇。11. 一种重组细胞，其通过将下列基因导入宿主细胞中而得到：赋予将甲醇和/或甲酸 转变为甲醛的功能的基因和编码选自2-酮戊二酸脱羧酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸 CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁醛脱氢酶以及醇脱氢酶中的至少1种酶的基 因，所述宿主细胞具有核酮糖单磷酸途径， 该基因在所述宿主细胞内表达， 所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种Cl化合 物生产1，4_ 丁二醇。12. 如权利要求6、7、9和10所述的重组细胞，其进一步导入编码3-己酮糖-6-磷酸合 成酶的基因和编码6-磷酸-3-己酮糖异构酶的基因，该基因在宿主细胞内表达。13. 如权利要求6~12中任一项所述的重组细胞，其中，赋予将甲醇转变为甲醛的功能 的基因为编码甲醇脱氢酶或醇氧化酶的基因，赋予将甲酸转变为甲醛的功能的基因为编码 甲醛脱氢酶的基因.14. 如权利要求6~13中任一项所述的重组细胞，其进一步导入赋予将甲烷转变为甲 醇的功能的基因，该基因在宿主细胞内表达。15. 如权利要求14所述的重组细胞，其中，赋予将甲烷转变为甲醇的功能的基因为编 码甲烷单加氧酶的基因。16. 如权利要求1~15中任一项所述的重组细胞，其中，导入的基因整合至宿主细胞的 基因组中。17. 如权利要求1~15中任一项所述的重组细胞，其中，导入的基因整合至质粒中。18. 如权利要求1~17中任一项所述的重组细胞，其至少具有对400mM的1，4- 丁二醇 的抗性。19. 如权利要求1~18中任一项所述的重组细胞，其至少具有对2% (v/v)的甲醇的 抗性。20. -种1，4- 丁二醇的生产方法，该方法包括：使用选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛 及甲酰胺中的至少1种Cl化合物作为碳源，对权利要求1~19中任一项所述的重组细胞 进行培养，使该重组细胞生产1，4- 丁二醇。21. -种1，4- 丁二醇的生产方法，该方法包括：使选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及 甲酰胺中的至少1种Cl化合物与权利要求1~19中任一项所述的重组细胞接触，使该重 组细胞由所述Cl化合物生产1，4- 丁二醇。
【专利摘要】本发明要解决的问题在于，提供一种用于由甲醇等生产1,4-丁二醇的一系列的技术。提供一种重组细胞，其通过将下列基因导入作为甲基营养菌的宿主细胞中而得到：编码选自琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰CoA合成酶、CoA依赖型琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁醛脱氢酶、以及醇脱氢酶中的至少1种酶的基因，该基因在所述宿主细胞内表达，所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产1,4-丁二醇。
【IPC分类】C12P7/18, C12N1/19, C12N1/21, C12N15/09
【公开号】CN104919040
【申请号】CN201480004784
【发明人】古谷昌弘, 上西章太, 岩佐航一郎
【申请人】积水化学工业株式会社
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2014年1月20日
【公告号】EP2947143A1, WO2014112627A1