重组微生物和其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及重组微生物和用于通过微生物发酵包含CO的底物来生产MEK和/或 2_ 丁醇的方法。
【背景技术】
[0002] 2- 丁醇是大规模生产的有机化合物，主要作为工业溶剂甲基乙基酮（MEK或丁酮） 的前体。其通常通过利用硫酸催化剂的水合作用从石油化学产品（丁烯）生产。
[0003] MEK是油漆和墨水中的重要成分，具有正在以每年1.9 %增长的20亿美元的全球 市场。作为其合成中的中间体，对2-丁醇的需求与对丁酮的需求紧密相关。重要的是，2-丁 醇也可被转化成在合成橡胶、树脂和粘着剂中使用的1，3-丁二烯。1，3-丁二烯的全球市场 超过190亿美元，并且正在以每年2. 7%增长。比乙醇更能量密集的2-丁醇也具有作为燃 料以及作为丁二烯生产前体的潜在用途。
[0004] 本发明的一个目的是提供重组微生物和一种用于通过微生物发酵来生产MEK和/ 或2- 丁醇的方法，这可以提供优于已知方法的一种或多种优势，或至少提供公众以有用的 选择。
【发明内容】
[0005] 本发明在广义上尤其提供了用于通过微生物发酵包含CO和/或CO2的底物来生 产MEK和/或2- 丁醇的方法以及用于所述方法的重组微生物。
[0006] 在第一方面中，本发明提供了一氧化碳营养型产乙酸重组微生物，其能够通过发 酵包含CO的底物来产生MEK和/或2- 丁醇以及任选地一种或多种其它产物。
[0007] 在一个具体实施方案中，微生物被改造以用于表达在重组微生物所来源的亲本微 生物中不存在的MEK和/或2-丁醇生物合成途径中的一种或多种酶（或其一个或多个亚 基）。
[0008] 在另一个实施方案中，微生物被改造以用于过表达在重组微生物所来源的亲本微 生物中存在的MEK和/或2- 丁醇生物合成途径中的一种或多种酶（或其一个或多个亚基）。
[0009] 在一个实施方案中，微生物被改造以用于表达在亲本微生物中不存在的MEK和/ 或2- 丁醇生物合成途径中的一种或多种酶（或其一个或多个亚基），且过表达在亲本微生 物中存在的MEK和/或2- 丁醇生物合成途径中的一种或多种酶（或其一个或多个亚基）。
[0010] 在一个实施方案中，微生物被改造以用于表达以下酶中的一种或多种：
[0011] 催化（R)-乙偶姻转化成（R，S)-2, 3- 丁二醇的酶；
[0012] 催化（R，S) -2, 3- 丁二醇转化成MEK的酶；以及
[0013] 催化MEK转化成2- 丁醇的酶。
[0014] 在一个实施方案中，微生物被改造以用于降低或基本上消除在亲本微生物中存在 的一或多种酶的活性。在一个实施方案中，所述一种或多种酶是MEK和/或2-丁醇生物合 成途径的一部分。
[0015] 在一个实施方案中，所述微生物能够通过发酵包含CO的底物来产生2- 丁醇，并且 被改造用于表达或过表达2- 丁醇生物合成途径中的选自以下的一种或多种酶：
[0016] (S) -2, 3- 丁二醇脱氢酶；
[0017] 二醇/甘油脱水酶；
[0018] 醇脱氢酶；以及，
[0019] 其中任何一种或多种的功能上等效的变体。
[0020] 在一个实施方案中，所述亲本微生物缺乏（S)-2, 3-丁二醇脱氢酶和二醇/甘油脱 水酶或其中任何一种或多种的功能上等效的变体，并且所述重组微生物被改造用于表达这 两种酶。
[0021] 在一个实施方案中，所述亲本微生物包含（R)-2, 3-丁二醇脱氢酶或其功能上等 效的变体，并且所述重组微生物被改造用于降低或基本上消除这种酶的活性。
[0022] 在一个实施方案中，所述微生物能够通过发酵包含CO的底物来产生MEK并且被改 造用于表达或过表达MEK生物合成途径中的选自以下的一种或多种酶：
[0023] (S) -2, 3- 丁二醇脱氢酶；
[0024] 二醇/甘油脱水酶；以及，
[0025] 其中任何一种或多种的功能上等效的变体。
[0026] 在一个实施方案中，所述亲本微生物缺乏（S)-2, 3-丁二醇脱氢酶和二醇/甘油脱 水酶或其中任何一种或多种的功能上等效的变体，并且所述重组微生物被改造用于表达这 两种酶。
[0027] 在一个实施方案中，所述亲本微生物包含醇脱氢酶或其功能上等效的变体，并且 所述重组微生物被改造用于减小或基本上消除这种酶的活性。
[0028] 在一个实施方案中，所述亲本微生物包含（R)_2, 3-丁二醇脱氢酶或其功能上等 效的变体，并且所述重组微生物被改造用于降低或基本上消除这种酶的活性。
[0029] 在一个实施方案中，所述微生物包含被改造以用于增加亲本微生物中存在的一 种或多种核酸的表达的一种或多种外源性核酸，并且所述一种或多种核酸编码之前本文 中提及的一种或多种酶（或其一个或多个亚基）。在一个实施方案中，一种或多种被改 造用于增加表达的外源性核酸是调控元件。在一个实施方案中，所述调控元件是启动子。 在一个实施方案中，所述启动子是组成型启动子。在一个实施方案中，所述启动子是选自 Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。
[0030] 在一个实施方案中，所述微生物包含被改造以用于表达亲本微生物中不存在的之 前本文中提及的一种或多种酶（或其一个或多个亚基）的一种或多种外源性核酸。在一个 实施方案中，所述微生物包含一种或多种外源性核酸，其编码且被改造以用于表达所述酶 中的至少两种或三种（或其一个或多个亚基）。
[0031] 在一个实施方案中，所述一种或多种外源性核酸是核酸构建体或载体，在一个具 体实施方案中是质粒，其编码呈任何组合形式的上文提及的一种或多种酶。在一个实施方 案中，所述外源性核酸是表达质粒。
[0032] 在一个实施方案中，所述微生物包含被改造以用于增加亲本微生物中存在的一种 或多种核酸的表达的一种或多种外源性核酸，以及被改造以用于表达亲本微生物中不存在 的一种或多种酶的一种或多种外源性核酸。在另一个实施方案中，所述微生物包含被改造 以用于降低或基本上消除亲本微生物中存在的酶的活性的一种或多种核酸。
[0033] 在一个具体实施方案中，亲本微生物选自包含以下的一氧化碳营养 型产乙酸细菌：自产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)、扬氏梭菌 (Clostridium Ijungdahlii)、拉氏梭菌（Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭 菌（Clostridium carboxidivorans)、德氏梭菌（Clostridium drakei)、奠味梭菌 (Clostridium scatologenes)、乙酸梭菌（Clostridium aceticum)、甲酸乙酸梭菌 (Clostridium formicoaceticum)、大梭菌（Clostridium magnum)、甲基营养丁酸杆 菌（Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏乙酸杆菌（Acetobacterium woodii)、 巴氏嗜喊菌（Alkalibaculum bacchii)、Blautia producta、派泥真杆菌（Eubacterium Iimosum)、热醋穆尔氏菌（Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌（Moorella thermautotrophica)、卵形鼠抱菌（Sporomusa ovata)、Sporomusa silvacetica、类球鼠抱 菌（Sporomusa sphaeroides)、普氏产醋酸杆菌（Oxobacter pfennigii)以及凯伍热厌氧菌 (Thermoanaerobacter kiuvi)〇
[0034] 在一个实施方案中，所述亲本微生物是自产乙醇梭菌或扬氏梭菌。在一个具体实 施方案中，所述微生物是自产乙醇梭菌DSM23693。在另一个具体实施方案中，所述微生物是 扬氏梭菌 DSM13528 (或 ATCC55383)。
[0035] 在一个实施方案中，所述亲本微生物缺乏以下一种或多种酶的活性：
[0036] 催化（R)-乙偶姻转化成（R，S) -2, 3- 丁二醇的酶；
[0037] 催化（R，S) -2, 3- 丁二醇转化成MEK的酶；以及
[0038] 催化MEK转化成2- 丁醇的酶。
[0039] 在一个实施方案中，所述亲本微生物缺乏编码以下一种或多种酶的一种或多种基 因：
[0040] 催化（R)-乙偶姻转化成（R，S) -2, 3- 丁二醇的酶；
[0041] 催化（R，S) -2, 3- 丁二醇转化成MEK的酶；以及
[0042] 催化MEK转化成2- 丁醇的酶。
[0043] 在一个实施方案中，所述亲本微生物缺乏编码（S)-2, 3- 丁二醇脱氢酶、二醇/甘 油脱水酶和醇脱氢酶和/或其中任何一种或多种的功能上等效的变体的一种或多种基因。
[0044] 在一个实施方案中，所述亲本微生物包含编码（R)_2, 3-丁二醇脱氢酶、醇脱氢酶 和/或其任何一种或多种的功能上等效的变体的一种或多种基因。
[0045] 在一个实施方案中，所述亲本微生物包含编码（R)_2, 3-丁二醇脱氢酶、醇脱氢酶 或其任何一种或多种的功能上等效的变体的一种或多种基因，并且缺乏编码（S)-2, 3-丁 二醇脱氢酶、二醇/甘油脱水酶和/或其任何一种或多种的功能上等效的变体的一种或多 种基因。
[0046] 在第二方面中，本发明提供编码一种或多种酶（或其一个或多个亚基）的核酸，所 述一种或多种酶（或其一或多个亚基）当在微生物中表达时允许所述微生物通过发酵包含 CO的底物来产生MEK和/或2- 丁醇。
[0047] 在一个实施方案中，所述核酸编码两种或更多种酶（或其一个或多个亚基），所述 两种或更多种酶（或其一个或多个亚基）当在微生物中表达时允许所述微生物通过发酵包 含CO的底物来产生MEK和/或2- 丁醇。
[0048] 在一个实施方案中，核酸编码一种或多种选自如下的酶：
[0049] 催化（R)-乙偶姻转化成（R，S) -2, 3- 丁二醇的酶；
[0050] 催化（R，S) -2, 3- 丁二醇转化成MEK的酶；以及
[0051] 催化MEK转化成2- 丁醇的酶。
[0052] 在一个实施方案中，所述酶是选自（S) -2, 3- 丁二醇脱氢酶、二醇/甘油脱水酶、醇 脱氢酶和/或其中任何一种或多种的功能上等效的变体。
[0053] 在一个实施方案中，所述核酸包含以任何次序编码（S) -2, 3- 丁二醇脱氢酶、二醇 /甘油脱水酶和/或其中任何一种或多种的功能上等效的变体的核酸序列。
[0054] 在一个实施方案中，本发明的核酸还包含启动子。在一个实施方案中，所述启动子 允许所述基因在其控制下的组成型表达。在一个具体实施方案中，使用Wood-Ljungdahl簇 启动子。在另一个具体实施方案中，使用磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。在一个 具体实施方案中，所述启动子是来自自产乙醇梭菌。
[0055] 在另一方面中，本发明提供被改造以用于降低或消除亲本微生物中（R)_2, 3-丁 二醇脱氢酶、醇脱氢酶和/或其中任何一种或多种的功能上等效的变体的表达的核酸。
[0056] 在另一方面中，本发明提供被改造以用于当存在于亲本微生物中时增加 (S)_2, 3-丁二醇脱氢酶、二醇/甘油脱水酶、醇脱氢酶和/或其中任何一种或多种的功能上 等效的变体中一种或多种的表达的核酸。
[0057] 在第三方面中，本发明提供包含一种或多种第二方面的核酸的核酸构建体或载 体。
[0058] 在一个具体实施方案中，所述核酸构建体或载体是表达构建体或载体。在一个具 体实施方案中，所述表达构建体或载体是质粒。
[0059] 在第四方面中，本发明提供宿主生物，其包含第二方面的核酸或第三方面的载体 或构建体中的任何一种或多种。
[0060] 在第五方面中，本发明提供一种组合物，其包含本发明的第三方面提及的表达构 建体或载体以及甲基化构建体或载体。
[0061] 优选地，所述组合物能够产生本发明的第一方面的重组微生物。
[0062] 在一个具体实施方案中，所述表达构建体/载体和/或甲基化构建体/载体是质 粒。
[0063] 在第六方面中，本发明提供一种用于通过微生物发酵来产生MEK和/或2- 丁醇和 任选的一种或多种其它产物的方法，所述方法包含使用本发明第一方面的重组微生物发酵 包含CO的底物。
[0064] 在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
[0065] (a)向含有本发明第一方面的一种或多种微生物的培养物的生物反应器提供包含 CO的底物；并且
[0066] (b)在所述生物反应器中厌氧发酵所述培养物以至少产生MEK和/或2- 丁醇。
[0067] 在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
[0068] a.在由于工业过程产生的含CO的气体被释放到大气中之前捕获所述气体，
[0069] b.利用含有本发明的第一方面的一种或多种微生物的培养物厌氧发酵所述含CO 的气体以至少产生MEK和/或2- 丁醇。
[0070] 在该方法方面的具体实施方案中，所述微生物被维持在水性培养基中。
[0071] 在该方法方面的具体实施方案中，所述底物的发酵在生物反应器中进行。
[0072] 优选地，所述包含CO的底物是包含CO的气态底物。在一个实施方案中，所述底物 包含工业废气。在某些实施方案中，所述气体是钢厂废气或合成气。
[0073] 在一个实施方案中，所述底物通常将含有较大比例的C0,如至少约20体积％至约 100体积％ C0, 20体积％至70体积％ C0, 30体积％至60体积％ C0,以及40体积％至55 体积％ C0。在具体的实施方案中，所述底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35体 积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％ C0,或约55体积％⑶，或约60体积％ CO0
[0074] 在某些实施方案中，所述方法还包括从发酵液中回收MEK和/或2- 丁醇和任选的 一种或多种其它产物的步骤。
[0075] 在第七方面中，本发明提供通过第六方面的方法产生时的MEK和/或2- 丁醇。
[0076] 在另一方面中，本发明提供一种用于产生本发明的第一方面的微生物的方法，其 包括用一种或多种外源性核酸转化亲本微生物使得所述微生物能够通过发酵包含CO的底 物来产生MEK和/或2- 丁醇和任选的一种或多种其它产物，其中所述亲本微生物不能通过 发酵包含CO的底物来产生MEK和/或2- 丁醇。
[0077] 在一个具体实施方案中，用被改造以用于表达亲本微生物中不存在的MEK和/或 2-丁醇生物合成途径中的一种或多种酶的一种或多种外源性核酸来转化所述亲本微生物。 在另一个实施方案中，用被改造以用于过表达亲本微生物中存在的MEK和/或2- 丁醇生物 合成途径中的一种或多种酶的一种或多种核酸来转化所述亲本微生物。在另一个实施方案 中，用一种或多种外源性核酸转化亲本微生物，所述一种或多种核酸被改造用于表达所述 亲本微生物中不存在的MEK和/或2- 丁醇生物合成途径中的一种或多种酶并且过表达所 述亲本微生物中天然存在的MEK和/或2- 丁醇生物合成途径中的一种或多种酶。在另一 个实施方案中，亲本微生物被转化以降低或基本上消除可将2- 丁酮转化成2- 丁醇的一种 或多种酶和/或可将（R)-乙偶姻转化成（R，R)-2, 3-丁二醇的一种或多种酶的活性。在一 个实施方案中，亲本微生物被转化以表达或过表达一种或多种酶并且降低或基本上消除一 种或多种其它酶的活性。
[0078] 在某些实施方案中，所述一种或多种酶是如的。
[0079] 在某些实施方案中，亲本微生物是如上文所述的。
[0080] 提供了分离的遗传工程改造的一氧化碳营养型产乙酸细菌，其包含编码内消 旋-2, 3- 丁二醇脱氢酶的外源性核酸和编码二醇/甘油脱水酶的外源性核酸。细菌从这些 核酸表达所述酶。所述两种酶可以在同一细菌中表达或其可以分别存在于不同细菌中。一 般来说，所述细菌在天然状态下不表达所述酶。在一些情况下，所述细菌在D-(_) 2, 3-丁二 醇脱氢酶基因中具有敲除突变。在其它情况下，所述细菌还可包含编码二醇/甘油脱水酶 的再活化蛋白的外源性核酸。这些可延长脱水酶的活性寿命，所述脱水酶会在与其底物和 /或产物长期接触之后失去活性。所述细菌通常可以在厌氧条件下表达所述酶。
[0081] 在一些实施方案中，所述细菌还可在其醇脱氢酶基因中包含敲除突变。这可以减 少或防止所编码的醇脱氢酶的表达。这种突变将减少或防止2- 丁醇的形成，导致MEK的积 聚。MEK可以是发酵的所需产物，因此这种突变可以是高度合乎需要的。在一些实施方案 中，所述细菌还可在其D-(-) 2, 3- 丁二醇脱氢酶中包含敲除突变。这将减少或防止MEK或 2_ 丁醇的产生所不需要的丁二醇异构体的形成。任选地，所述细菌还可包含编码二醇/甘 油脱水酶的再活化蛋白的外源性核酸。这将有助于保持以所需水平从内消旋-2, 3-丁二醇 产生MEK。
[0082] 还提供了质粒，其可用于转化本文所述的发酵和转化过程中使用的一氧化碳营养 型产乙酸细菌。所述质粒可以在一氧化碳营养型产乙酸细菌中复制，即其具有适合的复制 起点。在一些情况下，所述质粒将包含编码内消旋-2, 3-丁二醇脱氢酶的核酸和编码二醇/ 甘油脱水酶的核酸，但是任一者可以单独存在于质粒中。当所述质粒被转化到所述细菌中 时，合乎需要地是所述细菌表达所述酶。或者，如果使用诱导型启动子用于表达，那么它们 可以仅在被诱导时表达。
[0083] 这类细菌和质粒可用于实施将CO和/或CO2转化成2- 丁醇的方法。含CO和/ 或含CO2的气态底物被传送到含有上述一氧化碳营养型产乙酸细菌的培养物的生物反应器 中。在使得所述细菌能够将CO和/或CO 2转化成2- 丁醇的条件下在培养基中培养所述细 菌。可以以连续或间断（episodic)方式从所述生物反应器回收丁醇。
[0084] 一些上文所讨论的细菌被很好地改造为适用于在将CO和/或CO2转化成甲基乙 基酮（MEK)的方法中使用。如上文所讨论的，所述细菌将合乎需要地具有降低或减少醇脱 氢酶的活性或产生的突变。在所述方法中，含CO和/或含CO 2的气态底物被传送到含有 适当的一氧化碳营养型产乙酸细菌的培养物的生物反应器中。在使得所述细菌将CO和/ 或CO 2转化成MEK的条件下在培养基中培养细菌。可以使用任何已知方法连续地或间断地 (saltitorily)从生物反应器中回收MEK。在一些情况下，所用的细菌将在D- (-) -2, 3- 丁二 醇脱氢酶基因中具有敲除突变以减少副产物的产生。在其它情况下，所述细菌还可包含编 码二醇/甘油脱水酶的再活化蛋白的外源性核酸。这将使内消旋-2, 3- 丁二醇转化为MEK 的步骤保持稳健。在一些情况下，所述细菌将同时具有D-(-)-2, 3-丁二醇脱氢酶基因中的 敲除突变和编码二醇/甘油脱水酶的再活化蛋白的外源性核酸。
[0085] 还提供可用于转化在所选细菌中并在其中表达的核酸。一种可用的核酸编码针 对自产乙醇梭菌进行密码子优化的内消旋-2, 3-丁二醇脱氢酶。另一可用的核酸编码针 对自产乙醇梭菌进行密码子优化的二醇/甘油脱水酶。在一个具体实施方案中，所述内消 旋-2, 3-丁二醇脱氢酶是肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)内消旋-2, 3-丁二醇 脱氢酶。在另一个具体实施方案中，所述核酸编码产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca) 二醇/甘油脱水酶。在另一个具体实施方案中，所述核酸编码产酸克雷伯氏菌二醇/甘油 脱水酶。这些各种编码序列可以在一个或多个分子（如一个或多个质粒）上。如果欲使用 多个质粒，那么其复制起点将合乎需要地是相容的。还可在适当的噬菌体上携带所述核酸。 [0086] 本发明还可以在广义上被说成单独地或共同地包含在本申请的说明书中提及或 指示的部分、要素和特