微生物及其用途的制作方法

专利名称：微生物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，本发明涉及微生物及其用途。更具体的，本发明涉及微生物，用于转化为生物的系统，用于生产脂肪酸酯的方法，脂肪酸酯产品以及用于生产脂肪酸酯的系统。
背景技术：
为缓解能源危机的压力，各国正积极地寻代可再生的替代能源。并先后开发出水能、风能、潮汐能、太阳能和生物质能等诸多的可再生能源。但由于受环境、气候、地理因素以及前期开发投入巨大等因素的限制，水能、风能、潮汐能、太阳能等均只能在特定的区域内利用，难以推广普及。生物质能是一类以生物质为原料，通过相应生物技术加工而成的一类清洁、环保、可再生的能源的总称。主要包括生物乙醇、生物柴油、生物制氢以及沼气等形式。开发生物质能不受环境、地理因素等条件是的限制，适于工厂化生产、易于普及等特点。因此对生物能的开发正成为能源研究的热点领域，竞争日趋激烈。然而，目前对于生物质能的研究仍有待深入。

发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的目的在于提出一种能够有效用于生产脂肪酸酯的微生物及其用途。在本发明的第一方面，本发明提出了一种微生物。根据本发明的实施例，该微生物包括第一核酸序列，其中，所述第一核酸序列编码下列:酰基转移酶Jr基因或其功能等同体。本发明的发明人发现，当采用该微生物时，通过表达该微生物的基因组中所包含的外源基因，可以使该微生物过表达酰基转移酶xr，从而可以利用所表达的酶催化脂酰辅酶a和外加醇类化合物两个底物合成脂肪酸酯，例如脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。根据本发明的实施例，该微生物还可以具有下列附加技术特征:
在本发明的一个实施例，进一步包括第二核酸序列，其中，所述第二核酸序列编码下列的至少之一:2_酮酸脱羧酶基因或其功能等同体；乙醇脱氢酶或其功能等同体；以及脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因。由此，可以有效地将在相应基因表达产物的作用下，将单糖转化为醇类化合物，从而可以实现将单糖例如葡萄糖作为碳源，微生物依靠自身产生的醇类化合物和脂肪酰辅酶A合成脂肪酸酯，例如脂肪酸乙酯、脂肪酸丁酯、脂肪酸异戍酷和腊酷。 在本发明的一个实施 例，进一步包括第三核酸序列以及任选的第四核酸序列，其中，所述第三核酸序列编码下列:内切葡聚糖酶基因万67/或其功能等同体；以及β-葡糖苷酶基因或其功能等同体，所述第四核酸序列编码脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因或其功能等同体。由此，可以能够有效地利用基因所编码的产物，将多糖转化为醇类化合物，从而可以实现将多糖例如纤维素作为碳源，微生物依靠自身产生的醇类化合物可以合成脂肪酸酯，例如脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯、脂肪酸丁酯、脂肪酸异戊酯和蜡酯。在本发明的一个实施例，所述酰基转移酶基因编码SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提闻酸基转移酶J/1基因表达广物的酶活性，从而进一步提闻利用该微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述酰基转移酶基因具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提闻酸基转移酶J/1基因编码表达广物的效率，从而进一步提闻利用该微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述2-酮酸脱羧酶基因编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提高2-酮酸脱羧酶基因表达产物的酶活性，从而进一步提高利用该微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述2-酮酸脱羧酶基因具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高2-酮酸脱羧酶基因编码表达产物的效率，从而进一步提高利用该微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述乙醇脱氢酶4/ 编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提高乙醇脱氢酶4^/￡ 基因编码产物的酶活性，从而进一步提高利用该微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述乙醇脱氢酶4/ 具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提闻乙醇脱氣酶基因编码表达广物的效率，从而进一步提闻利用该微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述内切葡聚糖酶基因從编码SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提闻内切匍聚糖酶基因编码广物的酶活性，从而进一步提高利用该微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述内切葡聚糖酶基因從具有SEQ ID NO:10所示的核昔酸序列。由此，可以进一步提闻内切匍聚糖酶基因EGII表达广物的效率，从而进一步提高利用该微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述β -葡糖苷酶基因沒-ffi编码SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提高葡糖苷酶基因编码产物的酶活性，从而进一步提高利用该微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述β -葡糖苷酶基因B-GL具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高葡糖苷酶基因编码产物的效率，从而进一步提高利用该微生物制备脂肪酸酯的效率。
在本发明的一个实施例，所述脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因编码SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提高脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因编码产物的酶活性，从而进一步提高利用该微生物制备脂肪酸酯的效率。

在本发明的一个实施例，所述脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因编码产物的效率从而进一步提高利用该微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一种。由此，可以进一步提高利用该微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述微生物为选自细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母的至少一种。由此，可以进一步提高利用该微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述微生物为酵母。由此，可以进一步提高利用该微生物制备脂肪酸酯的效率，降低生产成本。在本发明的一个实施例，所述微生物为毕赤酵母。由此，可以进一步提高利用该微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个 实施例，所述微生物为大肠杆菌。由此，可以进一步提高利用该微生物制备脂肪酸酯的效率，降低生产成本。在本发明的第二方面，本发明提出了一种适于转化微生物的系统。根据本发明的实施例，该适于转化微生物的系统包括第一核酸序列，其中，所述第一核酸序列编码下列:酰基转移酶Jr基因或其功能等同体。由此，利用该系统可以有效地将外源基因酰基转移酶Jr基因或其功能等同体引入微生物细胞中，从而获得前面所述的微生物，进而可以利用该系统获得的微生物，通过表达该微生物的基因组中所包含的外源基因，可以使该微生物过表达酰基转移酶Jr基因，利用所表达的酶催化脂酰辅酶A和外加醇类化合物两个底物合成脂肪酸酯，例如脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。根据本发明的实施例，该系统还可以具有下列附加技术特征:
在本发明的一个实施例，进一步包括第二核酸序列，其中，所述第二核酸序列编码下列的至少之一:2_酮酸脱羧酶基因或其功能等同体；乙醇脱氢酶或其功能等同体；以及脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因。由此，可以有效地将在相应基因表达产物的作用下，将单糖转化为醇类化合物，从而可以实现将单糖例如葡萄糖作为碳源，微生物依靠自身产生的醇类化合物可以合成脂肪酸酯，例如脂肪酸乙酯、脂肪酸丁酯、脂肪酸异戊酯和蜡酯。在本发明的一个实施例，进一步包括第三核酸序列以及任选的第四核酸序列，其中，所述第三核酸序列编码下列:内切葡聚糖酶基因万67/或其功能等同体；以及葡糖苷酶基因或其功能等同体，所述第四核酸序列编码脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因或其功能等同体。由此，可以能够有效地利用基因所编码的产物，将多糖转化为醇类化合物，从而可以实现将多糖例如纤维素作为碳源，微生物依靠自身产生的醇类化合物可以合成脂肪酸酯，例如脂肪酸甲酯脂肪酸乙酯、脂肪酸丁酯、脂肪酸异戊酯和蜡酯。在本发明的一个实施例，所述酰基转移酶基因编码SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提闻酸基转移酶J/1基因表达广物的酶活性，从而进一步提闻利用该系统获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述酰基转移酶基因具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提闻酸基转移酶J/1基因编码表达广物的效率，从而进一步提闻利用该系统获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述2-酮酸脱羧酶基因编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提高2-酮酸脱羧酶基因表达产物的酶活性，从而进一步提高利用该系统获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述2-酮酸脱羧酶基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高2-酮酸脱羧酶基因编码表达产物的效率，从而进一步提高利用该系统获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述乙醇脱氢酶4/ 编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提高乙醇脱氢酶4^/￡ 基因编码产物的酶活性，从而进一步提高利用该系统获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述乙醇脱氢酶4/ 具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提闻乙醇脱氣酶基因编码表达广物的效率，从而进一步提闻利用该系统获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述内切葡聚糖酶基因從’JJ编码SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提闻内切匍聚糖酶基因编码广物的酶活性，从而进一步提高利用该系统获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述内切葡聚糖酶基因從具有SEQ ID NO:10所示的核昔酸序列。由此，可以进一步提闻内切匍聚糖酶基因EGII表达广物的效率，从而进一步提高利用该系统获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述β -葡糖苷酶基因沒编码SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提高葡糖苷酶基因编码产物的酶活性，从而进一步提高利用该系统获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述β -葡糖苷酶基因沒-ffi具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高葡糖苷酶基因编码产物的效率，从而进一步提高利用该系统获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。
在本发明的一个实施例，所述脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因编码SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。由此，可以进一步提高脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因编码产物的酶活性，从而进一步提高利用该系统获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因编码产物的效率从而进一步提高利用该系统获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一种。由此，可以进一步提高利用该系统获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述微生物为选自细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母的至少一种。由此，可以进一步提高利用该系统获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述微生物为酵母。由此，可以进一步提高利用该系统获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率，降低生产成本。在本发明的一个实 施例，所述微生物为毕赤酵母。由此，可以进一步提高利用该系统获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述微生物为大肠杆菌。由此，可以进一步提高利用该系统获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率，降低生产成本。
根据本发明的实施例，所述第一、第二、第三和第四核酸序列被设置在同一个载体或相互不同的载体上。由此，可以进一步提高采用该系统转化微生物的效率。在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备重组微生物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括使用前面所述的系统转化微生物，以便获得所述重组微生物。由此，通过该方法能够有效获得重组微生物，进而可以利用该方法获得的微生物，通过表达该微生物的基因组中所包含的外源基因，可以使该微生物过表达酰基转移酶Jr基因，利用所表达的Jr酶催化脂酰辅酶A和醇类化合物两个底物合成脂肪酸酯，例如脂肪酸甲酯脂肪酸乙酯、脂肪酸丁酯、脂肪酸异戊酯和蜡酯。根据本发明的实施例，该方法还可以具有下列附加技术特征:
在本发明的一个所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一种。在本发明的一个实施例，所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一种。由此，可以进一步提高利用该方法获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述微生物为选自细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母的至少一种。由此，可以进一步提高利用该方法获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的一个实施例，所述微生物为酵母。由此，可以进一步提高利用该方法获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率，降低生产成本。在本发明的一个实施例，所述微生物为毕赤酵母。由此，可以进一步提高利用该方法获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率。在本发明的 一个实施例，所述微生物为大肠杆菌。由此，可以进一步提高利用该方法获得的重组微生物制备脂肪酸酯的效率，降低生产成本。在本发明的第四方面，本发明提出了一种生产脂肪酸酯的方法。根据本发明的实施例，该方法包括下列步骤:培养前面所述的微生物，以便使所述微生物合成脂肪酸酯；以及分离所述脂肪酸酯。由此，利用该方法可以借助本发明实施例的微生物合成脂肪酸酯。根据本发明的实施例，该方法还可以具有下例附加技术特征:
在本发明的一个实施例，所述微生物包含编码酰基转移酶Jr基因的核酸序列，可催化脂肪酰辅酶A和醇类化合物生产脂肪酸酯。在本发明的一个实施例，所述醇类化合物为碳源子数目不超过24的一元醇，优选为选自甲醇、乙醇、异丁醇、异戊醇、二甲基丁醇、脂肪醇的至少一种由此可以有效地利用醇类化合物作为原材料获得脂肪酸酯。在本发明的一个实施例，所述微生物包含编码2-酮酸脱羧酶基因、乙醇脱氢酶4/ 基因以及酰基转移酶基因的核酸序列，并且采用单糖作为碳源培养所述微生物。在本发明的一个实施例，所述单糖为葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油。由此可以有效地利用单糖作为原材料获得脂肪酸酯。在本发明的一个实施例，所述微生物包含编码2-酮酸脱羧酶基因、乙醇脱氢酶基因、内切葡聚糖酶基因八β -葡糖苷酶基因以及酰基转移酶基因的核酸序列，并且采用纤维素作为碳源培养所述微生物。由此可以有效地利用纤维素作为原材料获得脂肪酸酯。在本发明的一个实施例，所述微生物包含编码脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因以及酰基转移酶Jr基因的核酸序列，并且采用单糖作为碳源培养所述微生物。在本发明的一个实施例，所述单糖为葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油。由此，可以有效地利用单糖作为原材料制备腊酷O在本发明的一个实施例，所述微生物包含编码酰基辅酶A还原酶/ / 基因、内切葡聚糖酶基因A67八β -葡糖苷酶基因以及酰基转移酶Jr基因的核酸序列，并且采用纤维素作为碳源培养所述微生物。由此，可以有效地利用纤维素作为原材料制备蜡酯。在本发明的第五方面，本发明提出了一种脂肪酸酯产品，其是通过前面所述的方法制备的。由此，生产方式绿色环保，摆脱对石油资源的依赖，不“与民争粮、争地”，得到的产品纯度高，有害废物少，对环境友好。在本发明的第六方面，本发明提出了一种用于生产脂肪酸酯的系统。根据本发明的实施例，该系统包括:生物反应器，所述生物反应器中设置有前面所述的微生物以及培养基，用于培养所述微生物，以便使所述微生物合成脂肪酸酯；以及分离装置，所述分离装置与所述生物反应器相连，用于分离所述脂肪酸酯。由此，利用本发明的实施例的生产脂肪酸酯的系统，可以有效地实施前面所述的生产脂肪酸酯的方法，从而可以有效地用于制备脂肪酸酯。根据本发明的实施例，该系统还可以具有下列附加技术特征:
在本发明的一个实施例，所述微生物包含编码酰基转移酶Jr基因的核酸序列，可催化脂肪酰辅酶A和醇类化合物生产脂肪酸酯。在本发明的一个实施例，所述醇类化合物为碳原子数目不超过24的一元醇，优选为选自甲醇、乙醇、异丁醇、异戊醇、2-甲基丁醇、脂肪醇的至少一种由此可以有效地利用醇类化合物作为原材料获得脂肪酸酯。在本发明的一个实施例，所述微生物包含编码2-酮酸脱羧酶基因、乙醇脱氢酶4/ 基因以及酰基转移酶基因的核酸序列，并且采用单糖作为碳源培养所述微生物。在本发明的一个实施例，所述单糖为葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油，由此可以有效地利用单糖作为原材料获得脂肪酸酯。在本发明的一个实施例，所述微生物包含编码2-酮酸脱羧酶基因、乙醇脱氢酶基因、内切葡聚糖酶基因八β -葡糖苷酶基因以及酰基转移酶基因的核酸序列，并且采用纤维素作为碳源培养所述微生物。由此可以有效地利用纤维素作为原材料获得脂肪酸酯。在本发明的一个实施例，所述微生物包含编码脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因以及酰基转移酶Jr基因的核酸序列，并且采用单糖作为碳源培养所述微生物。在本发明的一个实施例，所述单糖为葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油。由此，可以有效地利用单糖作为原材料制备腊酷O在本发明的一个实施例，所述微生物包含编码酰基辅酶A还原酶/ / 基因、内切葡聚糖酶基因A67八β -葡糖苷酶基因以及酰基转移酶Jr基因的核酸序列，并且采用纤维素作为碳源培养所述微生物。由此，可以有效地利用纤维素作为原材料制备蜡酯。本发明的优点是在微生物中引入外源基因构建一条合成肪酸酯的代谢途径，最终实现以单糖或纤维素为原料合成脂肪酸酯的目的，不需要通过过多的化学合成反应，减少了环境的污染，也减少了对石油储量的消耗。 同时，由于微生物生长速度快，便于进行遗传操作，其抗污染性能优异，且人工可以调节其生长速度和防止其肆意生长破坏环境，种种因素表明改造微生物进行工业生产脂肪酸酯是切实可行的。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。


本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
图1.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的PDG整合载体。图2.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的PDGlOl整合载体示意图，将基因克隆到PDG整合载体上。图3.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的PDG104整合载体示意图，将AROlO和灿似基因克隆到pDG整合载体上。图4.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的PDG105整合载体示意图，将AT,AROlO和也》似基因克隆到pDG整合载体上。图5.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的PDG108整合载体示意图，将EGII和及X基因克隆到pDG整合载体上。图6.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的PDG109整合载体示意图，将EG,BGL,AT,AROlO和灿似基因克隆到pDG整合载体上。图7.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的PDGllO整合载体示意图，将/ / 基因克隆到pDG整合载体上。图8.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的pDGlll整合载体示意图，将FAR和基因克隆到pDG整合载体上。图9.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的PDG112整合载体示意图，将EGI1、BGUFAR和基因克隆到pDG整合载体上。图10.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的PDG113整合载体示意图，将AT, AROlO和灿似基因克隆到pET28a ( + )载体上。图11.显示了根据本发明的一个实施例DGl工程菌在外加甲醇发酵条件下，合成脂肪酸甲酯的GC-MS检测结果图。I号峰内标碳十五脂肪酸甲酯(Pentadecanoicacid methyl ester), 2 号峰碳十六脂肪酸甲酯(Hexadecanoic acid methyl ester),3号峰Δ 9_碳十六稀脂肪酸甲酷(9-Hexadecenoic acid methyl ester), 4号峰碳十八脂肪酸甲酯(Octadecanoic acid methyl ester), 5号峰Δ 9_碳十八烯脂肪酸甲酯(9-Octadecenoic acid methyl ester)。图12.显示了根据本发明的一个实施例DGl工程菌在与产乙醇酵母共发酵条件下，合成脂肪酸乙酯的GC-MS检测结果图。I号峰内标碳十五脂肪酸甲酯(Pentadecanoicacid methyl ester), 2 号峰碳十六脂肪酸乙酯(Hexadecanoic acid ethyl ester), 3 号峰Δ 9-碳十六烯脂肪酸乙酯(9-Hexadecenoic acid ethyl ester), 4号峰碳十八脂肪酸乙酯(Octadecanoic acid ethyl ester), 5 号峰 Δ 9_ 碳十八烯脂肪酸乙酯(9_ Octadecenoicacid ethyl ester)。
图13.显示了根据本发明的一个实施例DG2工程菌以葡萄糖为碳源合成短链醇的GC-MS检测结果图。I号峰乙醇(ethanol), 2号峰异丁醇(isobutnol), 3号峰异戍醇(isopentanol)。图14.显示了根据本发明的一个实施例DG3工程菌以葡萄糖为碳源合成脂肪酸短链酯的GC-MS检测结果图。I号峰内标碳十五脂肪酸乙酯(Pentadecanoic acid ethylester) , 2号峰碳十六脂肪酸乙酷(Hexadecanoic acid ethyl ester), 3号峰碳十六脂肪酸异丁酯(Hexadecanoic acid 2-methylpropyl ester), 4号峰碳十八脂肪酸乙酯(Octadecanoic acid ethyl ester), 5 号峰碳十六脂肪酸异戍酯(Hexadecanoic acid2-methylbutyl ester),6 号峰碳十八脂肪酸异丁酯(Octadecanoic acid 2-methypropylester), 7 号峰碳十八脂肪酸异戍酯(Octadecanoic acid 2-methybutyl ester)。图15.显示了根据本发明的一个实施例DG4工程菌以纤维素为碳源合成脂肪酸短链酯的GC-MS检测结果图。I号峰内标碳十五脂肪酸甲酯(Pentadecanoic acid methylester), 2 号峰碳十六脂肪酸异丁酯(Hexadecanoic acid 2-methylpropyl ester), 3 号峰碳十六脂肪酸异戍酯(Hexadecanoic acid 2-methylbutyl ester),4号峰碳十八脂肪酸异丁酯(Octadecanoic acid 2-methypropyl ester), 5号峰碳十八脂肪酸异戍酯(Octadecanoic acid 2-methybutyl ester)。图16.显示了根据本发明的一个实施例DG5工程菌以葡萄糖为碳源合成脂肪醇的GC-MS检测结果图。I号峰内标碳十五脂肪醇(pentadecanol), 2号峰碳十六脂肪醇(hexadecanol), 3 号峰碳十八脂肪醇(Octadecanol )。图17.显示了根据本发明的一个实施例DG6工程菌以葡萄糖为碳源合成蜡酯的GC-MS检测结果图。I号峰碳十八脂肪酸碳十六酯(C18:C16), 2号峰碳十八脂肪酸碳十八酯(C18:C18)。图18.显示了根据本发明的一个实施例DG7工程菌以纤维素为碳源合成蜡酯的GC-MS检测结果图。I号峰碳十八脂肪酸碳十六酯(C18:C16), 2号峰碳十八脂肪酸碳十八酯(C18:C18)。图19.显示了根据本发明的一个实施例DG8工程菌以葡萄糖为碳源合成脂肪酸短链酯的GC-MS检测结果图。I号峰代表内标碳十五脂肪酸乙酯(Pentadecanoicacid ethyl ester), 2 号峰代表碳十四脂肪酸异丁酯(Myristic acid isobutylester), 3号峰代表碳十六脂肪酸乙酯(Hexadecanoic acid ethyl ester), 4号峰代表碳十六脂肪酸 _3_ 甲基-丁酯(Hexadecanoic acid 3-methybutyl ester), 5 号峰代表碳十六脂肪酸异丁酯(Hexadecanoic acid isobutyl ester), 6号峰代表Δ 9_碳十六烯脂肪酸丁酯(Butyl 9-hexadecenoaie), 7号峰代表碳十八脂肪酸_3_甲基-丁酯(Octadecanoic acid 3-methybutyl ester), 8号峰代表Δ 9_碳十六烯脂肪酸丙酯(propyl 9-hexadecenoaie)，9 号峰代表 Δ9-碳十八烯脂肪酸丙酯(9_ Octadecanoicacid (Z) - propyl ester), 10 号峰代表碳十八脂肪酸异丁酯(9_ Octadecanoic acid (Z)-1sobutyl ester)。
具体实施例方式下面详细描 述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。缩写及术语
提供下列关于术语和方法的解释一遍更好的描述本发明，并指导本领域普通技术人员实施本发明。本文使用的“包括”表示“包含”，单数形式的“一个”，除非上下明确的另外指出。例如，“包括一个细胞”指包含一个或者多个这类细胞，“包括硫酯酶”指包含一种或者多种硫酯酶肽以及本领域普通技术人员已知的其同等物，等等。术语“或者”是指陈述的可选择要素或者两个或更多个要素组合中的单个要素，除非上下文明确的另外指出。例如短语“生物燃料或者其中间体”是指生物燃料、生物燃料中间体或者生物燃料和生物燃料中间体两者的组合。除非另外解释，所有本文使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常的理解具有相同的含义。尽管与本文描述的类似或者等同的方法和材料可用于本发明的实施或者实验，但下文描述了适合的方法和材料。所述材料、方法和实施例子只是说明性的，而不是用于限制。根据下面的详细说明和权利要求，本发明的其他特征将是明显。登录号:贯穿本说明书的登录号来源于美国国立卫生研究院维护的NCBI数据库(国立生物技术信息中心)。所述登录号是2011年3月I日由该数据库提供的。酶分类号(EC):贯穿本说明书提供的EC编号来自京都基因与基因百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics)维护的 KEGG Ligand 数据库，这由东京大学部分资助。所述EC编号是2011年3月I日由该数据库提供的。碳源:通常指适合作为原核生物或者简单真核生物细胞生长的碳源的底物或者化合物。碳源可以是各种形式，包括但不限于聚合物，糖、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽，等等。这些包括，例如，各种单糖诸如葡萄糖、低聚糖、多糖、纤维素质、木糖和阿拉伯糖，二糖，诸如蔗糖、饱和或者不饱和的脂肪酸、琥珀酸盐、乳酸盐、乙酸盐、乙醇，等等，或者其混合物。此夕卜，碳源还可以是光合作用产物，包括但不限于葡萄糖。

可检测的:能够确定出现或者存在。例如，使用下面实施例子提供的方法，从发酵液中产物是可检测的。:脱氧核糖核酸。DNA是长链聚合物，其包括大部分的有机体(一些病毒具有包括核糖核酸RNA的基因)的遗传物质。DNA聚合物中的重复单位是4种不同的核苷酸，其包括4中碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一种，所述碱基上结合有脱氧核糖，而磷酸基与所述脱氧核糖连接。DNA分子中被称为密码子的是核苷酸三联体编码肽的氨基酸。术语密码子还指mRNA中3核苷酸的对应(和互补)序列，所述DNA序列被转录成所述mRNA。内源的:当在本文中对核酸分子和特定的细胞或者微生物使用时，是指位于细胞内的核酸序列或者肽，其不是利用重组工程技术导入细胞的。例如，当细胞最初从自然界分离时，已经存在于所述细胞中的基因。即使调控序列诸如激活转录或者翻译的启动子或者增强子序列已经通过重组技术被改变，基因仍被认为是内源的。外源的:本文中对核酸分子和特定的细胞使用时，是指不是来源于自然界发现的特定细胞的任意核酸分子。因此，一旦非天然存在的核酸分子被引入细胞，则其被认为是外源的。对特定细胞来说，天然存在的核酸分子也可以是外源的。例如，一旦从细胞X分离的完整编码序列被引入细胞Y，则该编码序列对细胞Y来说是外源核酸，即使X和Y是相同的细胞类型。
表达:基因的编码信息被转变为细胞的结构与功能诸如蛋白、转移RNA或者核糖体RNA的过程。表达的基因包括那些被转录为mRNA然后被翻译为蛋白的基因，以及那些被转录为RNA但不被翻译为蛋白的基因(例如，转移和核糖体RNAs)。
发酵肉汤:包括任意支持微生物生命(即主动代谢碳的微生物)的培养基。发酵培养基通常包含碳源。碳源是可以被微生物用作(利用或者不利用其他的酶)能量的任何物。分离的:“分离的”生物学组分(诸如核酸分子、蛋白或者细胞)已经基本上从该组分天然存在的其他生物学组分中分离或者纯化，诸如其他染色体的和染色体外的DNA和RNA,以及蛋白。已经被“分离的”核酸分子和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白。该术语还包括在宿主细胞中利用重组表达制备的核酸分子和蛋白，以及化学合成的核酸分子和蛋白。微生物:包括来自古细菌域、真细菌域和真核生物域的原核和真核微生物种，后者包括酵母和丝状酵母、原生动物、藻类或者更高等的原生生物。术语“微生物细胞”可以与“微生物”互换使用。核酸分子:包括RNA和DNA分子，其包括但不限于，cDNA、基因组DNA和mRNA。包括合成的核酸分子，例如那些化学合成或者重组产生的核酸分子。核酸分子可以是双链或者单链的。单链时，核酸分子可以是正义链或者反义链。此外，核酸分子可以是环状或者线性的。可操作的连接:当第一核酸序列与第二核酸序列具有功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作的连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或者表达，则所述启动子与所述编码序列为可操作的连接。通常，可操作连接的DNA序列是连接的，并且必要时在相同阅读框内连接两个蛋白编码区域。作为单个信使RNA串联转录的分离基因的结构被称为操纵子。因此将基因紧密相邻置于单个启动子的转录调节下，例如在质粒载体中，则构成合成操纵子。(开放阅读框):不含任何终止密码子的一系列编码氨基酸的核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可以被翻译为肽。过表达:当基因的转录速率与其内源转录速率相比提高的时候。在一些实例中，过表达还包括基因的翻译速率高于该基因的内源翻译速率。检测过表达的方法是本领域公知的。例如可以利用RT-PCR评价转录的RNA水平，以及利用SDS-PAGE凝胶分析评价蛋白水平。纯化的:术语“纯化的”并不需要绝对的纯度；它只是一个相对术语。因此，例如，纯化的生物燃料或其中间体是指比位于其细胞环境内的产物浓度更高的产物。重组:重组核酸分子或者蛋白，其具有非天然存在的序列，具有由人工组合序列的两个另外分离的序列片段制备的序列，或者以上两者。例如可以通过化学合成或者人工操作核酸分子或者蛋白的分离片段，诸如遗传工程技术，实现这种人工组合。重组还用于描述以下核酸分子，它们已经被人工处理，但包含的调控序列和编码区与分离所述核酸的生物体中发现的相同。重组细胞或者微生物是包含外源核酸分子诸如重组核酸分子的细胞或者微生物。转化或者重组细胞:例如通过分子生物学技术，已经被引入核酸分子(诸如编码酰基辅酶A合酶的核酸分子)的细胞。转化包括能够将核酸分子引入这类细胞的所有技术，包括但不限于，利用病毒载体转染、接合作用、利用质粒载体转化、通过电穿孔的裸DNA引入、脂质体转染和颗粒枪加速。在允许产物生成的条件下:任何允许微生物产生所需产物(诸如烷烃、烯烃等)的发酵条件。发酵条件通常包括温度范围、通气水平和培养基选择，将上述条件组合时允许微生物生长。示例性培养基包括肉汤或者凝胶。通常，培养基包括碳源诸如葡萄糖、果糖、纤维素或者可以被微生物直接代谢的类似物，或者可以在培养基中使用促进代谢碳源的酶。为了确定培养条件是否允许产物生成，将微生物培养8、16或者24小时，收集并分析样品。例如，可以检测样品或者培养基(细胞在其中生长)的细胞中所需产物存在。当分析产物的存在时，可以使用下面实例提供的那些方法。载体:作为引入细胞从而产生转化细胞的核酸分子。载体可以包括允许其在细胞中复制的核酸序列，诸如复制原点。载体还可以包括一种或者多种选择性标志物基因和本领域已知的其他遗传成分。单糖:单糖应做广义理解，可以包括葡萄糖、果糖、半乳糖，还可以包括甘油。纤维素:文章中“纤维素”做广义理解，经处理可产生可被微生物作为碳源利用的纤维素物质都被称为纤维素。术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接””等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。微生物
根据本发明的第一方面，本发明提出了一种微生物。根据本发明的一个实施例，该微生物包括第一核酸序列，该第一核酸序列编码酰基转移酶Jr基因或其功能等同体。本发明的发明人发现，当采用该微生物时，通过表达该微生物的基因组中所包含的外源基因，可以使该微生物过表达酰基转移酶xr，从而可以利用所表达的酶催化脂酰辅酶A和外加醇类化合物两个底物合成脂肪酸酯，例如脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。利用该微生物，可以通过在微生物细胞内过表达酰基转移酶Jr基因或其功能等同体，从而发挥酰基转移酶的生物活性，进而酰基转移酶可以与宿主微生物体内的固有基因相互作用，从可再生碳源产生脂肪酸酯类化合物。发明人发现，利用该微生物所得到的脂肪酸酯类化合物可以作为生物燃料或者其中间体。在本文中所使用的术语“功能等同体”是指这样的一种基因，其能够在宿主细胞内发挥例如与^相同的功能，但在序列上与例如^有所区别的基因，从而利用该功能等同体也能够有效地生产脂肪酸酯类化合物。根据本发明的具体实施例dr基因的功能等同体可絮^Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798^Rhodococcus opacus PD630^Mus musculus QSH/Psychrobacter ar cticus 273-4 的至少一种。上述 JT1 基因的功能等同体与AT基因同样具有合成WS/DGAT的功能。通过在微生物中弓丨入外源DNA序列，可以在微生物细胞内表达具有生物活性的蛋白，这些蛋白能够代谢可再生碳源以产生脂肪酸酯类化合物作为生物燃料或其中间体。因此，可以将这些微生物用于生产脂肪酸酯类化合物，以便得到可以作为生物燃料或者生物燃料中间体的脂肪酸酯类化合物。根据本发明的具体实施例，该微生物包括的第一核酸序列能够编码酰基转移酶Jr基因，在外加甲醇的条件下，酰基转移酶基因表达催化脂酰辅酶A和甲醇两个底物合成脂肪酸甲酯。在与酿酒酵母共培养的条件下，酰基转移酶基因表达催化脂酰辅酶A和酿酒酵母产生的乙醇两个底物合成脂肪酸乙酯。根据本发明的实施例，酰基转移酶基因优选具有下列所示的核苷酸序列:
ATGAGACCATTACACCCTATTGATTTCATTTTCTTGTCTTTGGAAAAGAGACAACAACCAATGCATGTTGGT
GGTTTGTTTTTATTCCAAATCCCAGATAATGCACCTGACACTTTTATTCAAGATTTGGTCAACGACATAAGAATCTC
AAAGTCCATTCCTGTTCCACCTTTCAATAACAAGTTGAACGGTTTATTTTGGGATGAAGACGAAGAATTTGATTTGG
ACCATCACTTTAGACATATAGCTTTACCACACCCTGGTAGAATCAGAGAATTGTTGATCTATATCTCCCAAGAACAT
AGTACTTTGTTGGATAGAGCAAAGCCATTGTGGACATGTAACATCATCGAAGGTATCGAGGGTAACAGATTTGCCAT
GTACTTCAAGATACATCACGCAATGGTAGATGGTGTCGCCGGTATGAGATTGATCGAAAAATCTTTGTCTCACGACG
TTACCGAAAAGTCTATTGTCCCACCTTGGTGCGTTGAAGGTAAAAGAGCTAAGAGATTAAGAGAACCAAAGACTGGT
AAAATTAAGAAAATTATGT CTGGTATCAAATCACAATTGCAAGCAACTCCTACAGTAATTCAAGAATTGTCACAAAC
AGTCTTCAAGGATATAGGTAGAAATCCAGACCATGTTTCTTCATTTCAAGCACCTTGTTCTATTTTGAACCAAAGAG
TATCCAGTTCTAGAAGATTTGCTGCACAATCCTTCGATTTGGACAGATTCAGAAACATCGCCAAGAGTTTGAACGTT
ACCATAAACGATGTTGTATTAGCTGTATGCTCTGGTGCCTTGAGAGCTTATTTGATGTCACATAATTCCTTGCCTAG
TAAGCCTTTAATCGCTATGGTACCAGCATCAATTAGAAATGATGACTCTGATGTCTCAAACAGAATCACAATGATCT
TGGCAAATTTGGCCACCCACAAAGATGACCCTTTGCAAAGATTAGAAATCATCAGAAGATCCGTTCAAAACAGTAAG
CAAAGATTCAAGAGAATGACTTCTGATCAAATATTGAACTACTCAGCTGTCGTTTACGGTCCAGCAGGTTTAAACAT
AATCTCTGGTATGATGCCTAAGAGACAAGCCTTTAATTTGGTTATTTCAAACGTACCAGGTCCTAGAGAACCATTAT
ATTGGAATGGTGCCAAGTTGGATGCTTTATACCCTGCATCCATAGTTTTGGACGGTCAAGCTTTAAACATCACCATG
ACTTCTTACTTGGATAAGTTAGAAGTTGGTTTGATTGCCTGTAGAAATGCTTTACCA
AGAATGCAAAACTTGTTAACACATTTGGAAGAAGAAATCCAATTGTTTGAAGGTGTTATCGCCAAGCAAGAAGACATTAAGACTGCCAACTAA (SEQ ID NO:8),
其编码的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
MRPLHPIDFIFLSLEKRQQPMHVGGLFLFQIPDNAPDTFIQDLVNDIRISKSIPVPPFNNKLNGLFWDEDEEFDLDHHFRHIALPHPGRIRELLIYISQEHSTLLDRAKPLWTCNIIEGIEGNRFAMYFKIHHAMVDGVAGMRLIEKSLS-HDVTEKSIVPPWCVEGKRAKRLREPKTGKIKKIMSGIKSQLQATPTVIQELSQTVFKDIGRNPDHVSSFQAPCSILNQRVSSSRRFAAQSFDLDRFRNIAKSLNVTINDVVLAVCSGALRAYLMSHNSLPSKPLIAMVPASIRNDDSDVSNRITMILANLATHKDDPLQRLEIIRRSVQNSKQRFKRMTSDQILNYSAVVYGPAGLNIISGMMPKRQAFNLVISNVPGPREPLYWNGAKLDALYPASIVLDGQALNITMTSYLDKLEVGLIACRNALPRMQNLLTHLEEEIQLFEGVIAKQEDIKTAN(SEQ ID NO:7),
发明人惊奇地发现，当采用该核苷酸序列时，酰基转移酶Jr基因在微生物细胞尤其是在酵母细胞中的表达效率可以得到显著地提高，进而可以进一步提高生产脂肪酸酯类化合物的效率。根据本发明的一个实施例，在微生物中，还可以进一步包含编码其他基因的核酸序列，从而赋予微生物额外的功能。根据本发明的实施例，在微生物中进一步包括第二核酸序列，该第二核酸序列可以编码2-酮酸脱羧酶基因或其功能等同体、乙醇脱氢酶^^^基因或其功能等同体。根据本发明的具体实施例，第二核酸序列可以编码2-酮酸脱羧酶基因，2-酮酸脱羧酶基因表达翻译得到酶，AROlO酶能够催化氨基酸代谢中间产物2-酮酸进行脱羧转化为醛，同时第二核酸序列还可以编码乙醇脱氢酶4/ 基因或其功能等同体，乙醇脱氢酶4/ 基因表达翻译得到4/ 酶，4/ 酶可以催化醛还原为短链醇，因此，根据本发明的具体实施例，该微生物包括的第二核酸序列可以间接的制备得到醇。进一步地，该微生物包括的第一核酸序列编码酰基转移酶Jr基因或其功能等同体，该基因经过翻译表达得到Jr酶，酶进一步催化脂酰基辅酶A和经过酶和酶催化得到的短链醇两个底物最终形成脂肪酸短链酯。由此，该微生物能够实现利用单糖直接得到脂肪酸酯，进一步提高了微生物制备脂肪酸酯的效率。根据本发明的具体实施例，基因的功能等同体可以为来自SeiccheiromycGS cerevisiae的 pyruvate decarboxylase 6 (PDC6) IMM Lactococcus lactis 的 a—ketoisovaleratedecarboxylase (Kivd)的至少一种；乙醇脱氢酶ADH2或其功能等同体可以为来自Saccharomyces cerevisiae 白勺 alcohol dehydrogenase I (ADHl) 、Lachancea kluyveri的 alcohol dehydrogenase 2 (ADH2)、以及LacAaflcea kluyveri ^ alcohol dehydrogenaseI (ADHl);脂酰辅酶A还原酶FAR基因的功能等同体可以为来自Acinetobactercalcoaceticus 的 Acr1、Crjza saiira 的 DPW、以及可以为来自elongates
PCC 7942的AAR的至少一种。由此利用上述基因的功能等同体同样可以达到相同的功能，因此能够实现利用单糖直接得到脂肪酸酯，进一步提高了微生物制备脂肪酸酯的效率。根据本发明的具体实施例，2-酮酸脱羧酶 基因具有下列所示的核苷酸序列:
ATGGCACCTGTTACAATTGAAAAGTTCGTAAATCAAGAAGAACGACACCTTGTTTCCAACCGATCAGCAACA
ATTCCGTTTGGTGAATACATATTTAAAAGATTGTTGTCCATCGATACGAAATCAGTTTTCGGTGTTCCTGGTGACTT
CAACTTATCTCTATTAGAATATCTCTATTCACCTAGTGTTGAATCAGCTGGCCTAAGATGGGTCGGCACGTGTAATG
AACTGAACGCCGCTTATGCGGCCGACGGATATTCCCGTTACTCTAATAAGATTGGCTGTTTAATAACCACGTATGGC
GTTGGTGAATTAAGCGCCTTGAACGGTATAGCCGGTTCGTTCGCTGAAAATGTCAAAGTTTTGCACATTGTTGGTGT
GGCCAAGTCCATAGATTCGCGTTCAAGTAACTTTAGTGATCGGAACCTACATCATTTGGTCCCACAGCTACATGATT
CAAATTTTAAAGGGCCAAATCATAAAGTATATCATGATATGGTAAAAGATAGAGTCGCTTGCTCGGTAGCCTACTTG
GAGGATATTGAAACTGCATGTGACCAAGTCGATAATGTTATCCGCGATATTTACAAGTATTCTAAACCTGGTTATAT
TTTTGTTCCTGCAGATTTTGCGGATATGTCTGTTACATGTGATAATTTGGTTAATGTTCCACGTATATCTCAACAAG
ATTGTATAGTATACCCTTCTGAAAACCAATTGTCTGACATAATCAACAAGATTACTAGTTGGATATATTCCAGTAAA
ACACCTGCGATCCTTGGAGACGTACTGACTGATAGGTATGGTGTGAGTAACTTTTTGAACAAGCTTATCTGCAAAAC
TGGGATTTGGAATTTTTCCACTGTTATGGGAAAATCTGTAATTGATGAGTCAAACCCAACTTATATGGGTCAATATA
ATGGTAAAGAAGGTTTAAAACAAGTCTATGAACATTTTGAACTGTGCGACTTGGTCTTGCATTTTGGAGTCGACATC
AATGAAATTAATAATGGGCATTATACTTTTACTTATAAACCAAATGCTAAAATCATTCAATTTCATCCGAATTATAT
TCGCCTTGTGGACACTAGGCAGGGCAATGAGCAAATGTTCAAAGGAATCAATTTTGCCCCTATTTTAAAAGAACTAT
ACAAGCGCATTGACGTTTCTAAACTTTCTTTGCAATATGATTCAAATGTAACTCAATATACGAACGAAACAATGCGG
TTAGAAGATCCTACCAATGGACAATCAAGCATTATTACACAAGTTCACTTACAAAAGACGATGCCTAAATTTTTGAA
CCCTGGTGATGTTGTCGTTTGTGAAACAGGCTCTTTTCAATTCTCTGTTCGTGATTTCGCGTTTCCTTCGCAATTAA
AATATATATCGCAAGGATTTTTCCTTTCCATTGGCATGGCCCTTCCTGCCGCCCTAGGTGTTGGAATTGCCATGCAAGACCACTCAAACGCTCACATCAATGGTGGCAACGTAAAAGAGGACTATAAGCCAAGATTAATTTTGTTTGAAGGTGACGGTGCAGCACAGATGACAATCCAAGAACTGAGCACCATTCTGAAGTGCAATATTCCACTAGAAGTTATCATTTGGAACAATAACGGCTACACTATTGAAAGAGCCATCATGGGCCCTACCAGGTCGTATAACGACGTTATGTCTTGGAAATGGACCAAACTATTTGAAGCATTCGGAGACTTCGACGGAAAGTATACTAATAGCACTCTCATTCAATGTCCCTCTAAATTAGCACTGAAATTGGAGGAGCTTAAGAATTCAAACAAAAGAAGCGGGATAGAACTTTTAGAAGTCAAATTAGGCGAATTGGATTTCCCCGAACAGCTAAAGTGCATGGTTGAAGCAGCGGCACTTAAAAGAAATAAAAAATAG (SEQ ID NO:1),
其编码的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
MAPVTIEKFVNQEERHLVSNRSATIPFGEYIFKRLLSIDTKSVFGVP⑶FNLSLLEYLYSPSVESAGLRWVGTCNELNAAYAADGYSRYSNKIGCLITTYGVGELSALNGIAGSFAENVKVLHIVGVAKSIDSRSSNFSDRNLHHLVPQLHDSNFKGPNHKVYHDMVKDRVACSVAYLEDIETACDQVDNVIRDIYKYSKPGYIFVPADFADMSVTCDNLVNVPRISQQDCIVYPSENQLSDIINKITSWIYSSKTPAILGDVLTDRYGVSNFLNKLICKTGIWNFSTVMGKSVIDESNPTYMGQYNGKEGLKQVYEHFELC DLVLHFGVDINEINNGHYTFTYKPNAKIIQFHPNYIRLVDTRQGNEQMFKGINFAPILKELYKRIDVSKLSLQYDSNVTQYTNETMRLEDPTNGQSSIITQVHLQKTMPKFLNP⑶VVVCETGSFQFSVRDFAFPSQLKYISQGFFLSIGMALPAALGVGIAMQDHSNAHINGGNVKEDYKPRLILFE⑶GAAQMTIQELSTILKCNIPLEVIIWNNNGYTIERAMGPTRSYNDVMSWKWTKLFEAFOTFDGKYTNSTLIQCPSKLALKLEELKNSNKRSGIELLEVKLGELDFPEQLKCMVEAAALKRNKK (SEQ ID NO:2)。根据本发明的具体实施例，2-酮酸脱羧酶基因具有如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列，发明人惊奇地发现，当采用该核苷酸序列时，2-酮酸脱羧酶基因在微生物细胞尤其是在酵母细胞中的表达效率可以得到显著地提高，进而可以进一步提高生产脂肪酸酯类化合物的效率。根据本发明的具体实施例，乙醇脱氢酶4/ 能够编码下列所示的氨基酸序列: MSIPETQKAIIFYESNGKLEHKDIPVPKPKPNELLINVKYSGVCHTDLHAWHGDWPLPTKLPLVGGHEGAGV
WGMGENVKGWKI⑶YAGIKWLNGSCMACEYCELGNESNCPHADLSGYTHDGSFQEYATADAVQAAHIPQGTDLAEVAPILCAGITVYKALKSANLRAGHffAAISGAAGGLGSLAVQYAKAMGYRVLGIDGGPGKEELFTSLGGEVFIDFTKEKDIVSAVVKATNGGAHGIINVSVSEAAIEASTRYCRANGTVVLVGLPAGAKCSSDVFNHVVKSISIVGSYVGNRADTREALDFFARGLVKSPIKVVGLSSLPEIYEKMEKGQIAGRYVVDTSKCSEQ ID NO:3),以及乙醇脱氢酶也1/ 具有下列所示的核苷酸序列:
ATGTCTATTCCAGAAACTCAAAAAGCCATTATCTTCTACGAATCCAACGGCAAGTTGGAGCATAAGGATATC
CCAGTTCCAAAGCCAAAGCCCAACGAATTGTTAATCAACGTCAAGTACTCTGGTGTCTGCCACACCGATTTGCACGC
TTGGCATGGTGACTGGCCATTGCCAACTAAGTTACCATTAGTTGGTGGTCACGAAGGTGCCGGTGTCGTTGTCGGCA
TGGGTGAAAACGTTAAGGGCTGGAAGATCGGTGACTACGCCGGTATCAAATGGTTGAACGGTTCTTGTATGGCCTGT
GAATACTGTGAATTGGGTAACGAATCCAACTGTCCTCACGCTGACTTGTCTGGTTACACCCACGACGGTTCTTTCCA
AGAATACGCTACCGCTGACGCTGTTCAAGCCGCTCACATTCCTCAAGGTACTGACTTGGCTGAAGTCGCGCCAATCT
TGTGTGCTGGTATCACCGTATACAAGGCTTTGAAGTCTGCCAACTTGAGAGCAGGCCACTGGGCGGCCATTTCTGGT
GCTGCTGGTGGTCTAGGTTCTTTGGCTGTTCAATATGCTAAGGCGATGGGTTACAGAGTCTTAGGTATTGATGGTGG
TCCAGGAAAGGAAGAATTGTTTACCTCGCTCGGTGGTGAAGTATTCATCGACTTCACCAAAGAGAAGGACATTGTTA
GCGCAGTCGTTAAGGCTACCAACGGCGGTGCCCACGGTATCATCAATGTTTCCGTTTCCGAAGCCGCTATCGAAGCT
TCTACCAGATACTGTAGGGCGAACGGTACTGTTGTCTTGGTTGGTTTGCCAGCCGGTGCAAAGTGCTCCTCTGATGTCTTCAACCACGTTGTCAAGTCTATCTCCATTGTCGGCTCTTACGTGGGGAACAGAGCTGATACCAGAGAAGCCTTAGATTTCTTTGCCAGAGGTCTAGTCAAGTCTCCAATAAAGGTAGTTGGCTTATCCAGTTTACCAGAAATTTACGAAAAGATGGAGAAGGGCCAAATTGCTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAA (SEQ ID NO:4)。由此可以进
一步提高微生物合成脂肪酸酯类化合物的效率。根据本发明的一个实施例，在该微生物中，可以进一步包含第三核酸序列以及任选的第四核酸序列，其中，第三核酸序列编码内切葡聚糖酶基因万67/或其功能等同体；以及葡糖苷酶基因或其功能等同体，第四核酸序列编码脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因或其功能等同体。由此，该可以进一步提高微生物合成脂肪酸酯效率。根据本发明的具体实施例，该微生物合成脂肪酸酯的是通过下列反应路径完成的:第三核酸序列编码的内切葡聚糖酶基因M7/或其功能等同体和β -葡糖苷酶基因或其功能等同体能够翻译表达得到纤维素酶，该纤维素酶可以水解纤维素产生单糖，最终实现了在微生物中直接从纤维素合成脂肪酸酯，由此可以将微生物体内自身的代谢途径合并两条或者多条代谢途径生产脂肪酸酯，以便进一步提高利用微生物合成脂肪酸酯的效率。根据本发明的具体实施例，第三核酸序列并不受特别限制，具有下列所述的核苷酸序列即可:
ATGCAACTGTTCAATTTGCCATTGAAAGTTTCATTCTTTCTCGTCCTCTCTTACTTTTCTTTGCTCGTTTCTGCTCAACAAACTGTATGGGGTCAATGTGGTGGTATCGGTTGGTCTGGTCCTACTAACTGTGCCCCTGGTTCTGCCTGCTCTACCTTAAATCCATATTACGCTCAATGTATACCTGGTGCAACTACAATCACCACTTCTACTAGACCACCTTCAGGTCCAACAACCACTACAAGAGCAACCTCTACTTCTTCATCCACTCCTCCAACTTCTTCTGGTGTTAGATTTGCCGGTGTAAATATTGCTGGTTTTGATTTCG GTTGTACCACTGACGGTACATGCGTAACCTCTAAAGTTTATCCACCTTTGAAGAACTTCACTGGTTCAAATAACTACCCAGATGGTATAGGTCAAATGCAACATTTCGTTAACGAAGACGGTATGACAATATTCAGATTGCCTGTAGGTTGGCAATATTTGGTTAACAACAATTTGGGTGGTAATTTGGATTCAACATCCATTAGTAAGTACGACCAATTAGTTCAAGGTTGTTTGTCATTAGGTGCCTATTGCATCGTCGATATTCATAACTACGCTAGATGGAATGGTGGTATTATAGGTCAAGGTGGTCCAACCAACGCACAATTCACTTCTTTGTGGAGTCAATTAGCTTCTAAGTATGCATCTCAATCAAGAGTTTGGTTCGGTATCATGAATGAACCTCACGATGTCAACATTAATACTTGGGCTGCAACAGTACAAGAAGTTGTCACAGCTATAAGAAACGCCGGTGCTACCTCCCAATTCATTTCTTTGCCAGGTAATGATTGGCAATCTGCAGGTGCCTTCATATCTGACGGTTCAGCCGCTGCATTATCCCAAGTAACTAACCCTGATGGTAGTACAACCAATTTGATATTCGACGTTCATAAGTACTTAGATTCCGACAACAGTGGTACTCACGCAGAATGTACTACAAACAATATCGATGGTGCATTCTCACCATTGGCCACATGGTTAAGACAAAACAATAGACAAGCCATTTTGACAGAAACCGGTGGTGGTAATGTCCAATCCTGTATACAAGATATGTGCCAACAAATCCAATATTTGAACCAAAATTCTGACGTTTATTTGGGTTACGTCGGTTGGGGTGCTGGTTCTTTTGATTCAACATACGTTTTGACTGAAACACCTACTGGTTCCGGTAACTCCTGGACTGACACTTCCTTAGTATCATCCTGTTTAGCAAGAAAATAA (SEQ ID NO: 10)和
ATGCAACTGTTCAATTTGCCATTGAAAGTTTCATTCTTTCTCGTCCTCTCTTACTTTTCTTTGCTCGTTTCT
GCTGATGAATTAGCCTTCTCCCCTCCATTTTATCCTAGTCCTTGGGCCAACGGTCAAGGTGAATGGGCCGAAGCCTA
TCAAAGAGCCGTCGCTATAGTATCACAAATGACTTTGGATGAAAAGGTTAACTTAACTACAGGTACAGGTTGGGAAT
TGGAAAAATGTGTCGGTCAAACCGGTGGTGTACCAAGATTAAATATAGGTGGCATGTGCTTGCAAGATTCTCCTTTA
GGTATCAGAGATTCTGACTATAATTCAGCCTTTCCAGCTGGTGTTAACGTCGCTGCAACATGGGATAAAAATTTGGC
ATACTTAAGAGGTCAAGCCATGGGTCAAGAATTTTCTGATAAGGGTATTGACGTTCAATTGGGTCCAGCCGCTGGTC
CTTTAGGTAGATCCCCTGACGGTGGTAGAAATTGGGAAGGTTTTAGTCCAGATCCTGCATTGACCGGTGTTTTATTCGCCGAAACTATTAAAGGTATACAAGATGCAGGTGTTGTCGCTACTGCAAAGCATTACATCTTGAACGAACAAGAACACTTCAGACAAGTTGCTGAAGCAGCCGGTTACGGTTTCAACATATCAGACACTATCTCTTCAAATGTTGATGACAAGACAATCCATGAAATGTATTTGTGGCCATTTGCCGATGCTGTAAGAGCTGGTGTTGGTGCAATCATGTGTTCTTACAACCAAATTAATAACTCTTATGGTTGCCAAAATTCATACACATTGAACAAATTGTTGAAGGCCGAATTAGGTTTTCAAGGTTTCGTCATGTCTGACTGGGGTGCTCATCACTCCGGTGTAGGTAGTGCATTGGCCGGTTTAGATATGTCAATGCCAGGTGACATTACTTTTGACTCTGCCACATCATTCTGGGGTACTAATTTGACAATCGCTGTCTTAAACGGTACAGTACCACAATGGAGAGTTGATGACATGGCTGTCAGAATTATGGCTGCATATTACAAAGTTGGTAGAGACAGATTGTATCAACCACCTAATTTTTCCAGTTGGACTAGAGATGAATACGGTTTTAAATACTTCTACCCACAAGAAGGTCCTTACGAAAAGGTTAACCATTTCGTAAACGTTCAAAGAAACCACTCTGAAGTAATCAGAAAATTAGGTGCAGATTCAACTGTTTTGTTAAAGAATAACAACGCCTTGCCATTAACTGGTAAAGAAAGAAAGGTTGCTATTTTGGGTGAAGATGCAGGTTCTAATTCATACGGTGCAAACGGTTGTTCCGATAGAGGTTGCGACAATGGTACATTAGCTATGGCATGGGGTAGTGGTACAGCTGAATTTCCATATTTGGTTACCCCTGAACAAGCAATCCAAGCCGAAGTCTTAAAACATAAGGGTTCTGTATACGCCATTACAGATAATTGGGCTTTGTCACAAGTCGAAACCTTAGCTAAACAAGCATCCGTAAGTTTGGTCTTTGTAAACTCTGATGCTGGTGAAGGTTATATTTCAGTTGATGGTAATGAAGGTGACAGAAACAATTTGACATTGTGGAAGAACGGTGACAATTTGATAAAGGCCGCTGCAAACAACTGTAACAACACCATCGTAGTTATTCATTCTGTTGGTCCAGTTTTAGTCGATGAATGGTATGACCACCCTAATGTCACTGCCATTTTGTGGGCTGGTTTACCAGGTCAAGAATCCGGTAACAGTTTGGCTGATGTATTATACGGTAGAGTTAATCCAGGTGCAAAATCTCCTTTTACCTGGGGTAAAACTAGAGAAGCCTATGGTGACTACTTGGTTAGAGAATTAAACAACGGTAACGGTGCTCCTCAAGATGACTTCTCTGAAGGTGTTTTCATTGATTATAGAGGTTTCGACAAGAGAAACGAAACACCAATATACGAATTTGGTCATGGTTTGTCCTATACCACTTTCAATTACAGTGGTTTGCACATTCAAGTTTTAAATGCATCTTCAAACGCCCAAGTCGCTACAGAAACCGGTGCCGCTCCAACTTTTGGTCAAGTTGGTAACGCTTCTGACTATGTCTACCCAGAAGGTTTGACCAGAATTTCCAAATTCATATATCCTTGGTTGAATAGTACTGATTTGAAGGCATCCAGTGGTGACCCATATTACGGTGTTGATACCGCTGAACATGTCCCTGAAGGTGCAACTGATGGTTCCCCACAACCTGTTTTACCAGCTGGTGGTGGTAGTGGTGGTAACCCTAGATTGTACGACGAATTAATCAGAGTATCCGTTACAGTCAAAAATACCGGTAGAGTCGCAGGTGACGCCGTACCTCAATTGTACGTTTCATTAGGTGGTCCAAACGAACCTAAGGTCGTATTAAGAAAGTTCGATAGATTGACATTGAAGCCATCTGAAGAAACCGTTTGGACAACCACTTTGACTAGAAGAGATTTGTCTAATTGGGACGTAGCAGCCCAAGATTGGGTTATAACTTCATATCCAAAGAAAGTTCACGTCGGTTCCTCATCCAGACAATTACCATTACACGCAGCATTACCTAAAGTCCAATAA (SEQ ID NO:12)， 其分别编码下列所示的氨基酸序列:MQLFNLPLKVSFFLVLSYFSLLVSAQQTVWGQCGGIGWSGPTNCAPGSACSTLNPYYAQCIPGATTITTSTRPPSGPTTTTRATSTSSSTPPTSSGVRFAGVNIAGFDFGCTTDGTCVTSKVYPPLKNFTGSNNYPDGIGQMQHFVNEDGMTIFRLPVGWQYLVNNNLGGNLDSTSISKYDQLVQGCLSLGAYCIVDIHNYARWNGGIIGQGGPTNAQFTSLWSQLASKYASQSRVffFGIMNEPHDVNINTWAATVQEVVTAIRNAGATSQFISLPGNDWQSAGAFISDGSAAALSQVTNPDGSTTNLIFDVHKYLDSDNSGTHAECTTNNIDGAFSPLATWLRQNNRQAILTETGGGNVQSCIQDMCQQIQYLNQNSDVYLGYVGWGAGSFDSTYVLTETPTGSGNSWTDTSLVSSCLARK (SEQ ID N0:9)和MQLFNLPLKVSFFLVLSYFSLLVSADELAFSPPFYPSPWANGQGEWAEAYQRAVAIVSQMTLDEKVNLTTGTGWELEKCVGQTGGVPRLNIGGMCLQDSPLGIRDSDYNSAFPAGVNVAATWDKNLAYLRGQAMGQEFSDKGIDVQLGPAAGPLGRSPDGGRNWEGFSPDPALTGVLFAETIKGIQDAGWATAKHYILNEQEHFRQVAEAAGYGFNISDTISSNVDDKTIHEMYLWPFADAVRAGVGAIMCSYNQINNSYGCQNSYTLNKLLKAELGFQGFVMSDWGAHHSGVGSALAGLDMSMP⑶ITFDSATSFWGTNLTIAVLNGTVPQWRVDDMAVRIMAAYYKVGRDRLYQPPNFSSWTRDEYGFKYFYPQEGPYEKVNHFVNVQRNHSEVIRKLGADSTVLLKNNNALPLTGKERKVAILGEDAGSNSYGANGCSDRGCDNGTLAMAWGSGTAEFPYLVTPEQAIQAEVLKHKGSVYAITDNWALSQVETLAKQASVSLVFVNSDAGEGYISVDGNE⑶RNNLTLWKNGDNLIKAAANNCNNTIVVIHSVGPVLVDEWYDHPNVTAILWAGLPGQESGNSLADVLYGRVNPGAKSPFTWGKTREAYGDYLVRELNNGNGAPQDDFSEGVFIDYRGFDKRNETPIYEFGHGLSYTTFNYSGLHIQVLNASSNAQVATETGAAPTFGQVGNASDYVYPEGLTRISKFIYPWLNSTDLKASS⑶PYYGVDTAEHVPEGATDGSPQPVLPAGGGSGGNPRLYDELIRVSVTVKNTGRVAGDAVPQLYVSLGGPNEPKVVLRKFDRLTLKPSEETVWTTTLTRRDLSNWDVAAQDWVITSYPKKVHVGSSSRQLPLHAALPKVQ (SEQ ID NO: 11)。
内切葡聚糖酶基因從’JJ能够编码SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，β -葡糖苷酶基因沒能够编码SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。根据本发明的具体示例，内切葡聚糖酶基因從’//具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，β-葡糖苷酶基因沒-ffi具有SEQ IDNO:12所示的核苷酸序列。由此可以进一步提高内切葡聚糖酶基因從和β-葡糖苷酶基因沒的表达效率，以便进一步提高在微生物中直接从纤维素合成脂肪酸酯的效率。
根据本发明的另一个具体实施例，第四核酸序列可以编码脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因或其功能等同体。因此可以利用脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因或其功能等同体表达得到FAR酶，/ / 酶能够催化脂酰基辅酶A还原为脂肪醇。根据本发明的具体实施例，该微生物包含的第一核酸序列编码酰基转移酶Jr基因或其功能等同体表达得到酶酶催化脂酰基辅酶A和脂肪醇两个底物形成蜡酯。
根据本发明的具体实施例，第四核酸序列并不受特别限制，只要能够编码下列所示的氨基酸序列即可:MEEMGSILEFLDNKAILVTGATGSLAKIFVEKVLRSQPNVKKLYLLLRATDDETAALRLQNEVFGKELFKVLKQNLGANFYSFVSEKVTWP ⑶ ITGEDLCLKDVNLKEEMWREIDWVNLAATINFIERYDVSLLINTYGAKYVLDFAKKCNKLKIFVHVSTAYVSGEKNGLILEKPYYMGESLNGRLGLDINVEKKLVEAKINELQAAGATEKSIKSTMKDMGIERARHWGffPNVYVFTKALGEMLLMQYKGDIPLTIIRPTIITSTFKEPFPGffVEGVRTIDNVPVYYGKGRLRCMLCGPSTIIDLIPADMVVNATIVAMVAHANQRYVEPVTYHVGSSAANPMKLSALPEMAHRYFTKNPWINPDRNPVHVGRAMVFSSFSTFHLYLTLNFLLPLKVLEIANTIFCQWFKGKYMDLKRKTRLLLRLVDIYKPYLFFQGIFDDMNTEKLRIAAKESIVEADMFYFDPRAINWEDYFLKTHFPGVVEHVLN (SEQ ID NO:5)。
根据本发明的具体示例，脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因具有下列所示的核苷酸序列:ATGGAAGAAATGGGTTCAATCTTGGAA`TTTTTGGATAATAAGGCTATCTTGGTTACCGGTGCCACTGGTTCCTTGGCTAAGATTTTTGTTGAAAAGGTATTGAGAAGTCAACCTAACGTTAAAAAGTTGTATTTGTTGTTGAGAGCTACAGATGACGAAACCGCTGCATTGAGATTGCAAAACGAAGTTTTCGGTAAAGAATTGTTTAAAGTATTGAAGCAAAATTTGGGTGCAAACTTTTACTCTTTCGTCTCAGAAAAGGTTACAGTTGTTCCAGGTGACATTACCGGTGAAGACTTGTGTTTGAAGGATGTTAATTTGAAGGAAGAAATGTGGAGAGAAATAGATGTCGTTGTAAACTTAGCCGCTACAATTAATTTCATCGAAAGATACGACGTCTCATTGTTGATTAACACCTACGGTGCTAAGTACGTTTTGGATTTCGCTAAGAAATGCAATAAGTTGAAGATATTTGTACATGTCTCTACTGCTTACGTTTCAGGTGAAAAGAATGGTTTGATCTTAGAAAAGCCTTATTACATGGGTGAATCTTTGAACGGTAGATTGGGTTTGGATATAAACGTAGAAAAGAAATTGGTTGAAGCAAAGATTAATGAATTGCAAGCAGCCGGTGCCACTGAAAAATCCATTAAGAGTACAATGAAGGATATGGGTATAGAAAGAGCTAGACACTGGGGTTGGCCAAACGTTTACGTTTTTACTAAGGCATTGGGTGAAATGTTGTTGATGCAATACAAGGGTGACATTCCTTTGACTATAATCAGACCAACAATCATAACTTCCACATTCAAAGAACCATTTCCTGGTTGGGTCGAAGGTGTTAGAACAATTGATAACGTCCCTGTTTATTACGGTAAAGGTAGATTGAGATGTATGTTATGCGGTCCTTCTACCATAATCGACTTAATCCCAGCTGATATGGTCGTTAACGCTACTATTGTAGCAATGGTCGCACATGCCAATCAAAGATATGTTGAACCAGTAACCTACCACGTTGGTTCTTCAGCTGCAAATCCTATGAAATTATCTGCATTGCCAGAAATGGCCCATAGATACTTCACAAAGAATCCATGGATAAACCCTGATAGAAATCCAGTACATGTCGGTAGAGCCATGGTATTTTCCAGTTTCTCAACCTTCCACTTGTATTTGACTTTGAACTTTTTATTGCCATTGAAGGTTTTGGAAATCGCAAACACTATTTTCTGTCAATGGTTCAAGGGTAAATACATGGACTTGAAGAGAAAGACAAGATTGTTGTTGAGATTGGTTGATATCTATAAACCTTACTTATTTTTCCAAGGTATCTTCGATGACATGAACACAGAAAAGTTGAGAATAGCCGCTAAGGAATCTATCGTTGAAGCCGACATGTTTTATTTCGATCCAAGAGCTATTAATTGGGAAGACTACTTTTTGAAGACTCATTTTCCTGGTGTCGTTGAACATGTATTGAACTAA (SEQ ID NO:6)。由此可以进一步提高脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因的表达效率，提1 / / 酶催化脂酸基辅酶A还原为脂肪醇的效率，以便进一步提闻在微生物中直接从纤维素合成脂肪酸酯的效率。
在本发明中，所使用的术语“微生物”可以为真核微生物，也可以为原核微生物。其类型并不受特别限制。例如，根据本发明的实施例，可以采用的微生物包括但不限于细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母，可以为上述微生物的至少一种。根据本发明的实施例，上述微生物优选采用酵母，根据本发明的具体示例，上述微生物优选毕赤酵母作为生产生物燃料的微生物。
根据本发明的具体实施例，上述核酸序列可以来自微生物自身，也可以是外源核苷酸，由此可以利用该微生物体内自身代谢途径完成脂肪酸酯的合成。根据本发明的具体实施例，上述乙醇可以通过外加也可以是微生物自身产生的，例如采用的微生物为产乙醇酵母。由此可以进一步提高利用微生物直接从纤维素合成脂肪酸酯的效率。
适于转化微生物的系统、制备重组微生物的方法 根据本发明的实施例，可以通过常规的分子生物学方法获得上述微生物。由此，本发明还提出了一种适于转化微生物的系统。利用该系统可以通过常规的方法，将目的基因引入微生物细胞中，从而得到前面所述的适于制备脂肪酸酯化合物的微生物。根据本发明的实施例，该系统包括第一核酸序列，该第一核酸序列编码酰基转移酶Jr基因或其功能等同体。由此，可以通过常规的分子生物学手段，将第一核酸序列引入到微生物中，从而可以在微生物细胞中过表达酰基转移酶Jr基因或其功能等同体。进一步可以通过在微生物细胞内过表达酰基转移酶Jr基因或其功能等同体，从而发挥酶的生物活性，进而酶催化脂酰辅酶A和甲醇两个底物 合成脂肪酸甲酯。
另外，为了在微生物细胞中引入其他的核酸序列，从而为所得到的重组微生物赋予额外的生物学功能。根据本发明的实施例，在该适于转化微生物的系统中，还可以具有其他的核酸序列。根据本发明的实施例，在该适于转化微生物的系统中可以进一步包括第二核酸序列，该第二核酸序列编码2-酮酸脱羧酶基因或其功能等同体；乙醇脱氢酶4/ 或其功能等同体；以及脂酰辅酶A还原酶/ / 基因或其功能等同体。从而可以借助该适于转化微生物的系统，在微生物中引入2-酮酸脱羧酶基因或其功能等同体、乙醇脱氢酶4/ 或其功能等同体以及脂酰辅酶A还原酶/ / 基因或其功能等同体。由此，通过2-酮酸脱羧酶基因或其功能等同体、乙醇脱氢酶其功能等同体以及脂酰辅酶A还原酶/ / 基因或其功能等同体的生物学功能，可以便于所合成的脂肪酸酯成为游离状态，从而便于最终分离回收脂肪酸酯，从而可以显著地提高将这些微生物应用于制备脂肪酸酯时的生产效率。根据本发明的一个实施例，在该适于转化微生物的系统中，可以进一步包含第三核酸序列，该第三核酸序列编码内切葡聚糖酶基因EGII或其功能等同体、β -葡糖苷酶基因沒-ffi或其功能等同体。由此，可以通过借助该适于转化微生物的系统，在微生物细胞中引入内切葡聚糖酶基因M7/或其功能等同体；以及葡糖苷酶基因或其功能等同体，从而借助内切葡聚糖酶基因万67/或其功能等同体以及β-葡糖苷酶基因或其功能等同体的生物学功能，可以显著提高利用该微生物生产脂肪酸酯的生产效率。根据本发明的一个实施例，在该适于转化微生物的系统中，还可以进一步包括第四核酸序列，该第四核酸序列编码脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因或其功能等同体。借助该适于转化微生物的系统，能够有效地将适于转化微生物的系统引入到微生物细胞中。通过在该微生物的细胞中过表达脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因或其功能等同体，产生/ / 酶，/ / 酶催化脂酰基辅酶A还原为脂肪醇，由此，脂酰基辅酶A和脂肪醇反应得到蜡酯，以便进一步提高合成脂肪酸酯的效率。
借助上述适于转化微生物的系统转化微生物的方法，并不受特别限制，可以为诸如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、接合作用、转导等等，可以将异源DNA序列(即前面所述的第一、第二、第三和第四核酸序列)稳定地或者瞬时引入宿主细胞，所述异源DNA序列参与产生生物燃料或其中间物。根据本发明的实施例，对于稳定转化，异源DNA序列还包括选择性标志物，诸如，抗生素抗性，例如新霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素的抗性，弥补营养缺陷型的基因等等。由此，根据本发明的实施例，本发明还提供了一种获得重组微生物的方法，该方法包括使用前面适于转化微生物的系统转化微生物，以便获得所述重组微生物。由此，根据本发明实施例，所得到的重组微生物中可以包含异源核酸序列，例如第一、第二、第三和第四核酸序列。关于这些核酸序列，前面已经进行了详细描述，在此不再赘述。
根据本发明的实施例，将上述异源DNA序列(即前面所述的第一、第二、第三和第四核酸序列)引入宿主细胞的顺序并不受特别限制。既可以是同时引入到微生物细胞中，也可以是依次引入到微生物细胞中。根据本发明的实施例，可以将各个异源DNA序列设置在同一个载体上，也可以设置在不同的载体上，例如各个核酸序列包含在不同的载体上。这些载体可以是本领域中任何已知的表达载体。合适的表达载体包括，但不限于，病毒载体，诸如杆状病毒载体，噬菌体载体，诸如噬菌体载体，质粒，噬菌体，粘粒，cosmids，细菌人工染色体，病毒载体(例如，基于以下病毒的病毒载体:牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒，等等)，基于Pl的人工染色体，酵母质粒，酵母人工染色体，和任意对目的特定宿主具有特异性的其他载体(诸如大肠杆菌、Pseudomonas pi sum和酿酒酵母)。根据本发明的实施例，表达载体上可以进一步包括一种或者多种选择标记基因，以提供用于选择转化宿主细胞的表型性状。所述选择标记基因编码在选择性培养基中生长的转化宿主细胞存活或者生长必需的蛋白。没有转化包含选择标记基因的载体的宿主细胞将不会在培养基中存活。通常的选择标记基因编码以下蛋白:(a)提供对抗生素或者其他毒素的抗性，例如，氨苄青霉素，新霉素，甲氨喋呤或者四环素，(b)弥补营养缺陷型缺陷，或者(c)提供复合培养基没 有的重要营养物，例如，编码杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。在可选的实施方式中，选择标记基因是提供氨苄青霉素或者卡那霉素抗性(用于原核宿主细胞，诸如大肠杆菌)的基因。
根据本发明的实施例，该适于转化微生物的系统可以进一步包括表达调控序列(启动子，增强子，等等)，以指导所编码基因产物的合成，优选启动子，更优选IPTG-诱导型启动子。所述第一、第二、第三或第四核酸序列的至少之一被设置在所述IPTG-诱导型启动子的控制之下。由此，可以通过在IPTG-诱导型启动子的控制下，由此容易通过启动子的调控，表达目的蛋白，从而实现脂肪酸酯的合成。根据本发明的实施例，可以用于本发明的启动子可以来源于微生物或者病毒，包括CMV和SV40。根据使用的宿主/载体系统，表达载体可以使用大量合适的转录和翻译控制元件中的任意一种，包括组成型和诱导型启动子，转录增强子元件，转录终止子，等等(参见例如，Bitter et al., Methods in Enzymology,153:156-544,1987，通过参照并入本文)。
根据本发明的实施例，用于原核宿主细胞的合适启动子包括，但不限于能够识别T4、T3、Sp6和T7聚合酶的启动子，噬菌体λ的PR和PL启动子，大肠杆菌的trp、recA、热休克和IacZ启动子，枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶和Σ特异性启动子，杆菌噬菌体启动子，链霉菌启动子，噬菌体λ的 int启动子，pBR322 β -内酰胺酶基因的bla启动子，和氯霉素乙酰转移酶基因的启动子。关于原核启动子的综述可参见Glick，J.1nd.Microbiol.1:277,1987 ；ffaison et al., Benjamin Cummins (1987);和 Sambrook et al.，上文，通过参照并入本文。
根据本发明的实施例，用于真核宿主内使用的合适真核启动子的非限制性实例来源于病毒，包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子；疱疹病毒的TK启动子；SV40早期启动子；Rous肉瘤病毒启动子；巨细胞病毒启动子；酵母gal4基因启动子；和IgG启动子。
根据本发明的实施例，合适的诱导型启动子包括不限于:受体蛋白、代谢物或者化学制品影响的启动子。具体地，包括:牛白血病病毒启动子、金属硫蛋白启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP pol III启动子、四环素诱导型CMV启动子以及来自trp和Iac操纵子的启动子。
根据本发明的一些实施例，前述的核酸序列可以被连接到组成型启动子上。因而利用该系统转化微生物所得到的重组微生物能够持续地表达外源基因，从而代谢合成脂肪酸酯。
根据本发明的实施例，上述适于转化微生物的系统，可以转化的微生物的类型并不受特别限制。可以为真核微生物，也可以为原核微生物。其类型并不受特别限制。例如，根据本发明的实施例，可以采用的微生物包括但不限于细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母。可以为上述微生物的至少一种。根据本发明的实施例，上述微生物优选采用酵母和大肠杆菌，根据本发明的具体示例，上述微生物优选毕赤酵母和大肠杆菌作为生产生物燃料的微生物。
脂肪酸酯及其生产方法和系统 在本发明的一个方面，本发明还提出了一种生产脂肪酸酯的方法。该方法包括下列步骤:培养微生物，以便生产该脂肪酸酯；以及分离该脂肪酸酯，其中，上述微生物包括第一核酸序列，其中，第一核酸序列编码酰基转移酶Jr基因的核酸序列。通过在合适的条件下对根据本发明实施例的微生物进行培养，在微生物细胞中表达Jr酶或其功能等同体的作用下，微生物细胞通过对底物的代谢，可以合成脂肪酸酯。本领域技术人员可以通过对微生物以及所采用的外源核酸的载体进行分析，能够获得最适合的培养条件。
另外，根据本发明的实施例，微生物中还可以包含额外的核酸序列，例如第一、第二、第三和第四核酸序列。关于这些核酸序列，前面已经进行了详细描述，在此不再赘述。
根据本发明的实施例，所采用的微生物的类型不受特别限制。可以为真核微生物，也可以为原核微生物。例如，根据本发明的实施例，可以采用的微生物包括但不限于细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母。可以为上述微生物的至少一种。根据本发明的实施例，优选采用毕赤酵母，以便用于生产生物燃料。这是因为对于酵母而言，易于遗传修饰，易于控制生长、产生以及减少或者消除降低生物合成途径效率的副反应。此外，这种修饰的微生物可以直接利用可再生能源以生产可直接用做生物燃料的燃料，不需要专门的储存或运输方法。
根据本发明的一个实施例，醇类化合物并不受特别限制，可以为碳数目不超过24的一元醇，优选为选自甲醇、乙醇、异丁醇、异戊醇、2-甲基丁醇和脂肪醇的至少一种，由此利用该醇作为底物与脂酰辅酶A合成反应得到脂肪酸酯。根据本发明的具体实施例，上述碳源可以是外加的，也可以是微生物自身生产的，例如采用产碳酵母自身生产的醇可以作为制备脂肪酸酯的底物。由此可以进一步提高利用微生物制备脂肪酸酯的效率。
根据本发明的实施例，上述微生物可以包含编码2-酮酸脱羧酶基因、乙醇脱氢酶4/ 基因以及酰基转移酶Jr基因的核酸序列，并且采用单糖作为碳源培养微生物。根据本发明的具体实施例，上述单糖可以为葡萄糖，半乳糖，果糖，甘油，根据本发明的具体实施例，利用上述包含编码2-酮酸脱羧酶基因、乙醇脱氢酶4/ 基因以及酰基转移酶Jr基因的核酸序列的微生物可以表达得到AWio酶、J服酶和酶。由此他wo酶催化氨基酸代谢中间产物2-酮酸进行脱羧转化为醛，^^^酶催化醛还原为短链醇dr酶催化脂酰辅酶A和短链醇合成脂肪酸酯，由此利用该方法可以有效地制备得到脂肪酸酯。
根据本发明的实施例，上述微生物可以包含编码2-酮酸脱羧酶基因、乙醇脱氢酶基因、内切葡聚糖酶基因没 /八β-葡糖苷酶基因以及酰基转移酶Jr基因的核酸序列，并且采用纤维素作为碳源培养所述微生物。根据本发明的具体实施例，由于该微生物中包含了内切葡聚糖酶基因從7八β -葡糖苷酶沒-ffi基因，因此该微生物可以翻译表达得到两种纤维素酶，该纤维素酶可以水解纤维素产生单糖，由此进一步利用酰基转移酶Jr基因表达的基因催化合成脂肪酸酯。由此利用该方法不仅能够有效地制备得到脂肪酸酯，并且可以直接利用纤维素制备脂肪酸酯。
根据本发明的实施例，上述微生物可以包含编码脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因以及酰基转移酶Jr基因的核酸序列，并且采用单糖作为碳源培养该微生物。根据本发明的具体实施例，上述包含编码脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因可以翻译表达得到FAR酶，/ / 酶可以催化脂酰基辅酶A还原为脂肪醇，由此，AT酶催化脂肪醇和脂酰辅酶A合成蜡酯，因此，利用该方法可以进一步提高制备脂肪酸酯的效率。
根据本发明的具体实施例，上述 单糖可以为葡萄糖，半乳糖，果糖，甘油。
根据本发明的实施例，上述微生物可以包含编码酰基辅酶A还原酶/ / 基因、内切葡聚糖酶基因A67八β -葡糖苷酶基因以及酰基转移酶Jr基因的核酸序列，并且采用纤维素作为碳源培养该微生物。由此利用该方法可以直接利用纤维素制备得到脂肪酸酯。
在本发明的另一个方面，本发明还提供了一种脂肪酸酯，该脂肪酸酯通过前述的制备脂肪酸酯的方法所得到。
在本发明的再一个方面，本发明还提供了一种用于生产脂肪酸酯的系统。根据本发明的实施例，该系统包括:生物反应器和分离装置。生物反应器中设置有上述的微生物以及培养基，培养基用于培养该微生物，以便使该微生物合成脂肪酸酯。分离装置与生物反应器相连，用于分离生产的脂肪酸酯。由此，利用本发明的实施例的生产脂肪酸酯的系统，可以有效地实施前面所述的生产脂肪酸酯的方法，从而可以有效地用于制备脂肪酸酯。
本发明的优点是在微生物中引入外源基因构建一条合成肪酸酯的代谢途径，最终实现以单糖或纤维素为原料合成脂肪酸酯的目的，不需要通过过多的化学合成反应，减少了环境的污染，也减少了对石油储量的消耗。同时，由于微生物生长速度快，便于进行遗传操作，其抗污染性能优异，且人工可以调节其生长速度和防止其肆意生长破坏环境，种种因素表明改造微生物进行工业生产脂肪酸酯是切实可行的。
根据本发明的实施例，利用上述微生物表达酰基转移酶基因，以多糖(纤维素等)或单糖(甘油或葡萄糖等)为原料将微生物体内来自脂肪酸合成路径的脂酰辅酶A与不同来源的醇类合成脂肪酸酯。根据本发明的实施例，发明人经过艰苦卓绝的努力完成了微生物体内自身的代谢途径合并两条或多条代谢途径生产脂肪酸酯的方法。例如，将来自氨基酸代谢途径短链醇和脂肪酸代谢途径共同催化合成了脂肪酸短链酯，如脂肪酸异戊酯。将来自脂肪酸代谢途径的脂肪酰辅酶A和脂肪醇共同催化合成了蜡酯。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
—般方法 下面对本发明实施例中所采用制备脂肪酸酯的一般方法进行描述，其中，图f 10中提供了实施例中所涉及的主要载体的示意图。
、毕赤酵母中合成脂肪酸酯 (O构建产脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯工程菌 构建了一个可分别以zesion和His为选择标记的毕赤酵母整合载体pDG。以pPIC3.5k载体为模板PCR扩增His选择标记表达框。在该片段两段分别引入了/^挪^和II酶切位点。将该片段通过和欲7 II克隆到经feMlI酶切的pGAPZa载体上得到载体pDG。将经密码子优化的JcifleioAacier baylyi菌JT1基因通过SfizI和AcoRI克隆到载体pDG上，得到重组载体PDG101。将重组载体pDGlOl导入毕赤酵母菌株GSl 15中，得到DGl工程菌。该工程菌实现了基因的高表达。
将30摄氏度过夜培养的酵母菌工程菌DGl，接种到50ml发酵培养基中(每升发酵培养基含:10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g葡萄糖，5g甲醇)。培养24小时后收集菌体，高压匀浆破细胞，利用乙酸乙酯萃取产物。利用旋转蒸发仪将溶剂乙酸乙酯旋干，再用正己烷溶解产物。GC-MS (气相色谱-质谱联用仪)检测经正己烷溶解的样品。实验结果如图11所示:酵母工程菌DGl可有效的利用葡萄糖和培养基中外加的甲醇合成C16和C18脂肪酸甲酯。
将30摄氏度过夜培养的酵母菌工程菌DGl和酿酒酵母YPH499，以4:1的比例接种到50ml发酵培养基中(每升发酵培养基含:10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g葡萄糖)。培养24小时后收集菌体，高压匀浆破细胞，利用乙酸乙酯萃取产物。利用旋转蒸发仪将溶剂乙酸乙酯旋干，再用正己烷溶解产物。GC-MS (气相色谱-质谱联用仪)检测经正己烷溶解的样品。实验结果如图12所示:在共发酵的条件下，酵母工程菌DGl可有效的利用葡萄糖合成C16和C18脂肪酸乙酯。
(2)构建产脂肪酸短链酯工程菌 ①将来自酿酒酵母的2-酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，重组到毕赤酵母整合载体PDG上，得到载体pDG104。将该载体线性化后整合到毕赤酵母染色体中，实现上述两个基因在酵母中的高量表达，得到毕赤酵母工程菌株DG2。表达基因用于催化2-酮酸脱羧形成醛，表达4/ 基因基因用于催化醛还原形成短链醇。上述构建的DG2工程菌可有效的将单糖转化为异丁醇、异戊醇、2-甲基丁醇等短链醇。
②进一步将经密码子优化的JcifleioAacier baylyi菌酰基转移酶JT1基因，重组到毕赤酵母整合载体PDG104上得到载体PDG105.将该载体线性化后整合到毕赤酵母染色体中，实现切，4/ 和基因在酵母中的高量表达，得到毕赤酵母工程菌株DG3。表达基因在于引入短链醇合成途径，可有效地合成异丁醇和异戊醇等短链醇。表达基因Jr用于催化脂酰辅酶A与上述合成的短链醇发生酯化反应，形成对应的脂肪酸短链酯。上述构建的DG3工程菌可有效的将单糖转化为脂肪酸短链酯。
③进一步将经密码子优化的Hypocrea Jecorina菌内切葡聚糖酶基因(endoglucanase II, EG II)和 Aspergillus aculeatus 舊的 β 葡糖苷酶基因(beta-glucosidase, B-GL),重组到载体pDG105上,得到载体pDG109.将该载体线性化后，整合到毕赤酵母染色体中，实现ADH2、AT、Y￡ II和B-GL基因在酵母中的高量表达，得到毕赤酵母工程菌株DG4。表达EG II和B-GL基因用于催化水解纤维素产生单糖。上述构建的DG4工程菌实现了以纤维素为唯一碳源合成脂肪短链酯。
(3)构建产蜡酯工程菌 ①将来自jojoba植物的脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因，重组到毕赤酵母整合载体pDG上得到载体PDG110.将该载体线性化后整合到毕赤酵母染色体中，实现/ / 基因在酵母中的高量表达，得到毕赤酵母 工程菌株DG5。表达/ / 基因用于催化脂酰辅酶A还原形成脂肪醇。上述构建的DG5工程菌可有效的将单糖转化为脂肪醇。
②进一步将经密码子优化的JcifleioAacier baylyi菌酰基转移酶JT1基因，重组到毕赤酵母整合载体PDGllO上得到载体pDGlll.将该载体线性化后整合到毕赤酵母染色体中，实现/ / 和基因在酵母中的高量表达，得到毕赤酵母工程菌株DG6。表达/ / 基因用于催化脂酰辅酶A还原形成脂肪醇。表达基因用于基因用于催化脂酰辅酶A与脂肪醇发生酯化反应，形成蜡酯。上述构建的DG6工程菌可有效的将单糖转化为蜡酯。
③进一步将经密码子优化的Hypocrea Jecorina菌内切葡聚糖酶基因(endoglucanase II, EG II)和 Aspergillus aculea tus 菌的 β 葡糖苷酶基因(beta-glucosidase, B -GL),重组到载体pDGlll,得到载体pDG112。将上述载体线性化后，整合到毕赤酵母染色体中，实现EG II和B-GL基因在酵母中的高量表达，得到毕赤酵母工程菌株DG7。表达EG II和B-GL基因用于催化水解纤维素产生单糖。上述构建的DG7工程菌实现了以纤维素为唯一碳源合成脂肪短链，DG7工程菌实现了以纤维素为唯一碳源合成蜡酯。
、在大肠杆菌内合成脂肪酸短链酯 将来自酿酒酵母的2-酮酸脱羧酶基因、乙醇脱氢酶4/ 基因和经密码子优化Acinetobacter baylyi菌酰基转移酶JT1基因重组到pET28a ( + )上,得到载体pDG113。将pDG113导入大肠杆菌中，得到工程菌DG8。織AROlO基因用于催化2-酮酸脱羧形成醛，表达基因基因用于催化醛还原形成短链醇。表达基因用于基因用于催化脂酰辅酶A与短链醇发生酯化反应，形成脂肪酸短链酯。上述构建的DG8工程菌可有效的将单糖转化为脂肪酸短链酯。
分别PCR扩增来自酿酒酵母的2-酮酸脱羧酶基因、乙醇脱氢酶4/ 基因、经密码子优化的^^/7￡^0&^(￡^ baylyi菌酰基转移酶基因和pET28a ( + )载体上。PCR扩增得到的4个片段之间，通过PCR引物引人了 40-50bp的重叠碱基。4个片段通过one-step isothermal protocol方案组装得到载体pDG113。将pDG113导入大肠杆菌中，得到工程菌DG8。表达基因用于催化2-酮酸脱羧形成醛，表达^^^基因用于催化醛还原形成短链醇。表达基因用于Jr基因用于催化脂酰辅酶A与短链醇发生酯化反应，形成脂肪酸短链酯。上述构建的DG8工程菌可有效的将单糖转化为脂肪酸短链酯。
将30摄氏度过夜培养的大肠杆菌工程菌DG8，接种到50ml M9发酵培养基中(包含0.5%酵母提取物、2%葡萄糖)。培养24小时后收集菌体，超声波破细胞，利用乙酸乙酯萃取产物。利用旋转蒸发仪将溶剂乙酸乙酯旋干，再用正己烷溶解产物。GC-MS (气相色谱-质谱联用仪)检测经正己烷溶解的样品。实验结果如图19所示:该大肠杆菌工程菌可有效的利用葡萄糖合成各种C16和C18脂肪酸异丁酯、异戊酯等脂肪酸短链酯。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、 修改、替换和变型。
权利要求
1.一种微生物，其特征在于，包括第一核酸序列， 其中， 所述第一核酸序列编码选自下列基因的至少一种: 酰基转移酶Jr基因、或其功能等同体， 任选地，所述Jr基因的功能等同体为来自 Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798> Rhodococcus opacus PD630 、 Mus musculus C57BL/6、以及 Psychrobac ter arc ti cus 273-4 的至少一种。
2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，进一步包括第二核酸序列，所述第二核酸序列编码下列基因的至少之一: 2-酮酸脱羧酶基因或其功能等同体； 乙醇脱氢酶4/ 或其功能等 同体；以及 脂酰辅酶A还原酶/ / 基因或其功能等同体， 其中， 任选地，所述2-酮酸脱羧酶基因的功能等同体为来自 Saccharomyces cerevisiae ^ pyruvate decarboxylase 6(PDC6)、以及 Lactococcus lactis 的 a—ketoisovalerate decarboxylase (Kivd)的至少一f中； 任选地，乙醇脱氢酶^^恐或其功能等同体为来自 Saccharomyces cerevisiae 的 alcohol dehydrogenase I (ADHl)、Lachancea kluyveri StJ alcohol dehydrogenase 2(ADH2)、以及Lachancea kluyveri 的 alcohol dehydrogenase I (ADHl)； 任选地，脂酰辅酶A还原酶/ / 基因的功能等同体为来自 Acinetobacter calcoaceticus 白勺 Acrl、 Oryza sa tiva 的 DPW、以及 来自 Synechococcus elongates PCC 7942 的 AAR 的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的微生物，其特征在于，进一步包括第三核酸序列以及任选的第四核酸序列， 其中， 所述第三核酸序列编码下列: 内切葡聚糖酶基因EGII或其功能等同体；以及 β -葡糖苷酶基因B-GL或其功能等同体， 所述第四核酸序列编码脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因或其功能等同体。
4.根据权利要求f3任一项所述的微生物，其特征在于， 任选地，所述酰基转移酶Jr基因编码SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述酰基转移酶Jr基因具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列； 任选地，所述2-酮酸脱羧酶基因编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述2-酮酸脱羧酶基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； 任选地，所述乙醇脱氢酶4/ 编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述乙醇脱氢酶ADH2具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列； 任选地，所述内切葡聚糖酶基因從’//编码SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述内切葡聚糖酶基因從7/具有SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列； 任选地，所述β-葡糖苷酶基因沒-ffi编码SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述β -葡糖苷酶基因B-GL具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列； 任选地，所述脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因编码SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列， 所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一种， 任选地，所述微生物为选自细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母的至少一种， 任选地，所述微生物为酵母或大肠杆菌， 任选地，所述微生物为毕赤酵母。
5.一种适于转化微生物的系统，其特征在于，包括第一核酸序列， 其中， 所述第一核酸序列编码下列: 酰基转移酶Jr基因或其功能等同体， 任选地，所述Jr基因的功能等同体为来自 Marinobacter hydrocarbonoclas ti cus DSM 8798、Rhodococcus opacus PD630 、Mus musculus C57BL/6、以及Psychrobac ter arc ti cus 273-4 的至少一种， 任选地，所述转化微生物的系统进一步包括第二核酸序列， 其中， 所述第二核酸序列编码下列的至少之一: 2-酮酸脱羧酶基因或其功能等同体； 乙醇脱氢酶4/ 或其功能等同体；以及 脂酰辅酶A还原酶/ / 基因或其功能等同体， 任选地，所述2-酮酸脱羧酶基因的功能等同体为来自 Saccharomyces cerevisiae ^ pyruvate decarboxylase 6(PDC6)、以及 Lactococcus lactis 的 a—ketoisovalerate decarboxylase (Kivd)的至少一f中； 任选地，乙醇脱氢酶^^恐或其功能等同体为来自 Saccharomyces cerevisiae 的 alcohol dehydrogenase I (ADHl)、Lachancea kluyveri StJ alcohol dehydrogenase 2(ADH2)、以及Lachancea kluyveri 的 alcohol dehydrogenase I (ADHl)； 任选地，脂酰辅酶A还原酶/ / 基因的功能等同体为来自 Acinetobacter calcoaceticus 白勺 Acrl、Oryza sa ti va 的 DPW、以及来自 Synechococcus elongates PCC 7942 的 AAR 的至少一种， 任选地，所述转化微生物的系统进一步包括第三核酸序列以及任选的第四核酸序列，其中， 所述第三核酸序列编码下列: 内切葡聚糖酶基因EGII或其功能等同体；以及 β -葡糖苷酶基因B-GL或其功能等同体， 任选地，所述第四核酸序列编码脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因或其功能等同体， 任选地，所述第一、第二、第三和第四核酸序列被设置在同一个载体或相互不同的载体上。
6.根据权利要求5任一项所述的系统,其特征在于， 任选地，所述酰基转移酶Jr基因编码SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述酰基转移酶Jr基因具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列； 任选地，所述2-酮酸脱羧酶基因编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述2-酮酸脱羧酶基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； 任选地，所述乙醇脱氢酶4/ 编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述乙醇脱氢酶ADH2具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列； 任选地，所述内切葡聚糖酶基因從’//编码SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述内切葡聚糖酶基因從7/具有SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列； 任选地，所述β-葡糖苷酶基因沒-ffi编码SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述β -葡糖苷酶基因B-GL具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列； 任选地，所述脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因编码SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列； 任选地，所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一种， 任选地，所述微生物为选自细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母的至少一种， 任选地，所述微生物为酵母或大肠杆菌， 任选地，所述微生物为毕赤酵母。
7.一种制备重组微生物的方法，其特征在于，包括使用权利要求5-6任一项所述的系统转化微生物，以便获得所述重组微生物， 其中，所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一种， 任选地，所述微生物为选自细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母的至少一种， 任选地，所述微生物为酵母或大肠杆菌， 任选地，所述微生物为毕赤酵母。
8.—种生产脂肪酸酯的方法，其特征在于，包括下列步骤: 培养广4任一项所述的微生物，以便使所述微生物合成脂肪酸酯；以及分离所述脂肪酸酯， 其中， 所述微生物包含编码酰基转移酶Jr基因的核酸序列， 任选地，所述编码酰基转移酶Jr基因的核酸序列可利用脂肪酰辅酶A和醇类化合物生成脂肪酸酯，任选地，所述醇类化合物为碳源子数目不超过24的一元醇，优选为选自甲醇、乙醇、异丁醇、异戊醇、二甲基丁醇、脂肪醇， 任选地，所述微生物包含编码2-酮酸脱羧酶基因、乙醇脱氢酶4/ 基因以及酰基转移酶Jr基因的核酸序列，并且采用单糖作为碳源培养所述微生物； 任选地，所述微生物包含编码2-酮酸脱羧酶基因、乙醇脱氢酶基因、内切葡聚糖酶基因A67八β -葡糖苷酶基因以及酰基转移酶Jr基因的核酸序列，并且采用纤维素作为碳源培养所述微生物， 任选地，所述微生物包含编码脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因以及酰基转移酶基因的核酸序列，并且采用单糖作为碳源培养所述微生物； 任选地，所述单糖为葡萄糖，果糖，半乳糖，甘油， 任选地，所述微生物包含编码酰基辅酶A还原酶/ / 基因、内切葡聚糖酶基因從八β-葡糖苷酶基因以及酰基转移酶Jr基因的核酸序列，并且采用纤维素作为碳源培养所述微生物。
9.一种脂肪酸酯产品，其是通过权利要求8任一项所述的方法制备的。
10.一种用于生产脂肪酸酯的系统，其特征在于，包括: 生物反应器，所述生物反应器中设置有权利要求广4任一项所述的微生物以及培养基，用于培养所述微生物，以便使所述微生物合成脂肪酸酯；以及 分离装置，所述分离装置与所述生物反应器相连，用于分离所述脂肪酸酯， 其中， 任选地，所述微生物包含编码酰基转移酶Jr基因的核酸序列， 任选地，所述编码酰基转移酶Jr基因的核酸序列可利用脂肪酰辅酶A和醇类化合物生成脂肪酸酯，所述醇类化合物为碳源子数目不超过24的一元醇，优选为选自甲醇、乙醇、异丁醇、异戊醇、二甲基丁醇、脂肪醇， 任选地，所述微生物包含编码2-酮酸脱羧酶基因、乙醇脱氢酶4/ 基因以及酰基转移酶Jr基因的核酸序列，并且采用单糖作为碳源培养所述微生物， 任选地，所述微生物包含编码2-酮酸脱羧酶基因、乙醇脱氢酶基因、内切葡聚糖酶基因A67八β -葡糖苷酶基因以及酰基转移酶Jr基因的核酸序列，并且采用纤维素作为碳源培养所述微生物； 任选地，所述微生物包含编码脂酰基辅酶A还原酶/ / 基因以及酰基转移酶基因的核酸序列，并且采用单糖作为碳源培养所述微生物； 任选地，所述单糖为葡萄糖，半乳糖，果糖或甘油， 任选地，所述微生物包含编码酰基辅酶A还原酶/ / 基因、内切葡聚糖酶基因從八β-葡糖苷酶基因以及酰基转移 酶Jr基因的核酸序列，并且采用纤维素作为碳源培养所述微生物。
全文摘要
本发明提供了微生物及用途，该微生物用于制备脂肪酸酯。该微生物包括第一、第二、第三和第四核酸序列，其中，第一核酸序列编码酰基转移酶AT基因或其功能等同体，第二核酸序列编码2-酮酸脱羧酶ARO10基因或其功能等同体；乙醇脱氢酶ADH2基因或其功能等同体；以及脂酰辅酶A还原酶FAR基因或其功能等同体，第三核酸序列编码内切葡聚糖酶基因EGII或其功能等同体；以及β-葡糖苷酶基因B-GL或其功能等同体，第四核酸序列编码脂酰基辅酶A还原酶FAR基因或其功能等同体。利用该微生物可以有效地提高制备脂肪酸酯的效率。
文档编号C12M1/00GK103194419SQ20131011592
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月3日 优先权日2013年4月3日
发明者刘天罡, 郭道义 申请人:武汉大学