一种快速检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种快速检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒及其应用，属于微生物检测技术领域。

背景技术：

阪崎克罗诺杆菌属克罗诺杆菌属，是一种重要的食源性致病菌，能够引起严重的新生儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血病等。尽管由阪崎克罗诺杆菌引发的发病率非常低，但它的致死率可达80％，并且幸存的患者经常会留下严重的神经系统损伤后遗症以及发育障碍。在多起阪崎克罗诺引起的疾病事件中调查发现，阪崎克罗诺感染与婴幼儿配方奶粉存在密切的关系。因此建立一种快速高效检测乳粉中阪崎克罗诺杆菌的方法尤为重要。

目前常用的传统分离检测方法，需要经过前增菌、选择性培养、生理生化鉴定等，需5-7天才能确定目标菌种，耗时长、劳动量大。因此需要发展一种简单快速、灵敏特异的方法来进行致病菌的检测，迅速发展起来的pcr、lamp、elsa、生物传感器、电化学等检测方法，虽然具有较好的灵敏度和特异性，但是要求具有专业技能、程序繁琐、还需要利用昂贵的实验仪器，而且无法实现现场检测。

近年来快速发展的胶体金免疫层析试纸条操作简便、检测快速、结果可直接肉眼判读、不需大型仪器、便于携带，可用于现场检测，已成为基层筛选的有效工具。然而由于传统的胶体金试纸条存在灵敏度低的问题，导致其广泛应用受到了限制。现在提高胶体金试纸条灵敏度的方法多采用金增强、银增强等，检测完成后需引入额外的检测程序，且用到的还原剂盐酸羟胺、对苯二酚属有毒试剂；使用双重胶体金进行信号放大相对简便，但是目前常用的两者结合方式有生物素/链酶亲和素方大，需要在同一胶体金上标记两种物质，标记方式复杂，且存在不确定因素，影响检测的稳定性；dna分子杂交的方式，耗时长，易造成自组装折叠，而且多采用将两种金标抗体直接分别喷在两个结合垫上的方式，使得两种胶体金不能够很好地结合形成稳定的结合体。因此迫切需要提供一种简便有效提高传统试纸条检测灵敏度的方法，实现简便、快速检测阪崎克罗诺杆菌。

技术实现要素：

为解决现有传统试纸条灵敏度低，现有的提高灵敏度的方式标记方式复杂、稳定性差、需要引入有毒试剂安全性低、耗时长的问题，本发明提供了一种快速检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒及应用，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种快速检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括酶标孔a、信号增强型试纸条b、第一金标抗体c和第二金标抗体d；所述信号增强型试纸条b包括样品垫1、结合垫2、nc膜3、吸水垫4和底板5，所述nc膜3上设有检测线6和控制线7，所述检测线6上包被有抗阪崎克罗诺杆菌捕获抗体，所述控制线7上包被有羊抗鼠二抗；所述第一金标抗体c上包被有抗阪崎克罗诺杆菌检测抗体，且由bsa封闭结合位点；所述第二金标抗体d上包被有抗bsa抗体；所述第一金标抗体c和第二金标抗体d结合形成双金标抗体，结构原理图如图1所示。

优选地，所述第一金标抗体(c)和第二金标抗体(d)的体积均为6ul-9ul，第一金标抗体(c)和第二金标抗体(d)按照体积比为1：1结合形成双金标抗体。

更优选地，所述第一金标抗体c和第二金标抗体d是按照8ul第一金标抗体c与8ul第二金标抗体d结合形成双金标抗体。

优选地，所述第一金标抗体c中胶体金粒径为26nm-42nm；所述第二金标抗体d中胶体金粒径为26nm-54nm。

更优选地，所述第一金标抗体c中胶体金粒径为26nm；所述第二金标抗体d中胶体金粒径为42nm。

优选地，本发明所述第一金标抗体c的制备方法为：每1ml胶体金溶液加入碳酸钾调节溶液ph值后加入抗阪崎克罗诺单克隆检测抗体8ug，混匀，室温静置反应1h以上后，加入封闭剂10％bsa100ul，混匀，室温静置反应1h以上；离心后去掉上清，加150ul复溶液复溶沉淀并混匀即得第一金标抗体。

优选地，本发明所述第二金标抗体d的制备方法为：每1ml胶体金溶液加入碳酸钾调节溶液ph值后加入抗bsa抗体8ug，混匀，室温静置反应1h以上后，加入封闭剂10％100ul的人血清白蛋白，混匀，室温静置反应1h以上；离心后去掉上清，加150ul复溶液复溶沉淀并混匀即得第二金标抗体。

优选地，所述检测线6上包被的抗阪崎克罗诺杆菌捕获抗体的浓度为1.8mg/ml；所述控制线7上包被的羊抗鼠二抗的浓度为0.6mg/ml。

本发明所述试剂盒的检测方法包括如下步骤：

1)在酶标孔a中加入100ul样品液和8ul第一金标抗体c，室温下孵育4min；

2)再加入8ul第二金标抗体d，混匀；

3)将试纸条插入酶标孔a中进行检测，10min后观察检测结果；

4)判定方法：若信号增强型试纸条b的检测线(6)、控制线(7)都出现红色条带，表明样品中含有阪崎克罗诺杆菌，阳性结果；若检测线(6)未出现红色条带，控制线(7)出现红色条带，表明样品中不含有阪崎克罗诺杆菌，阴性结果；若控制线(7)未出现红色条带，表明试纸条失效；其中检测线6颜色越深，表明样品中含有的阪崎克罗诺杆菌浓度越高。

本发明还提供了一种所述的试剂盒在检测阪崎克罗诺杆菌中的应用。

本发明的一种具体实施方式，一种利用所述的试剂盒检测乳粉中阪崎克罗诺杆菌的方法，包括以下步骤：

1)100g奶粉和900ml预热的nb培养基混合后，前增菌5h，取10ml离心后，去除干净上清及奶皮，将沉淀用1ml生理盐水复溶；

2)取步骤1)所得样品溶液100ul及第一金标抗体c8ul于酶标孔a中孵育4min后加入第二金标抗体d8ul，混匀；

3)将信号增强型试纸条b插入步骤2中的酶标孔a中，10min后观察检测结果；

4)判定方法：若信号增强型试纸条b的检测线(6)出现红色条带，控制线(7)出现红色条带，表明乳样中含有阪崎克罗诺杆菌，阳性结果；若检测线(6)未出现红色条带，控制线(7)出现红色条带，表明乳样中未含有阪崎克罗诺杆菌，阴性结果；若控制线(7)未出现红色条带，表明试纸条失效；其中检测线6颜色越深，表明乳样中含有的阪崎克罗诺杆菌浓度越高。

优选地，所述复溶液的配方组成如下：5％蔗糖、12％海藻糖、1％bsa和0.3％吐温-20,且ph值为8.5的tris缓冲溶液。

本发明所述信号增强型试纸条b的组装方法为：样品垫及结合垫先经过稀释液处理，后置于65℃鼓风干燥箱中干燥1h取出备用。将样品垫、结合垫、nc膜、吸收垫分别黏贴在pvc板上，每两个垫之间有2mm-3mm的交叠，在nc膜上分别喷抗阪崎克罗诺捕获抗体、羊抗鼠二抗分别作为检测线6和控制线7，控制划膜仪的喷速为0.8ul/cm，后置于37℃鼓风干燥箱中干燥1h取出，切成3mm宽的试纸条，装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用

优选地，所述稀释液的配方组成如下：2％吐温-20、0.1％氯化钠、1％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、0.5％酪蛋白，且ph值为8.5的tris缓冲溶液。

优选地，检测线浓度为1.8mg/ml、控制线浓度为0.6mg/ml。

本发明采用了试纸条双抗夹心的原理进行检测大分子物质阪崎克罗诺杆菌。

本发明试剂盒利用抗bsa抗体为连接体制备双胶体金，来增强显色信号，提高检测灵敏度，并借助酶标孔进行两种金标抗体及样品的预孵育，使得金标抗体与样品以及两种金标抗体充分结合作用，并省去了制作金标垫的过程，提高了试纸条的检测性能。

本发明有益效果：

1、本发明提供了一种检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，发明一种新型的试剂盒，其中包括信号增强型试纸条，然后结合样品预孵育过程，即先在酶标孔中加入两种金标抗体和样品液，后上条检测。相比于传统试纸条将金标抗体喷涂在结合垫上，此种方式省去了将金标抗体喷涂在结合垫上及干燥的过程，使得试纸条的制作过程更加简单；传统的方法样品和金标抗体是瞬时反应，没有充分的时间使两者结合，通过预孵育方法可控制样品与金标抗体结合的时间，使得两者可以完全相互作用，增加了样品与金标抗体的结合量，同时，预孵育过程使得两种金标抗体可以有效结合形成稳定的混合体，从而提高了试纸条的检测检测灵敏度和稳定性，产生了预料不到的技术效果。

2、现有技术中利用生物素/链霉亲和素标记在同一种胶体金的标记方式复杂，且存在不确定因素，影响检测的稳定性，以及dna分子杂交的方式耗时长，易造成自组装折叠，相比于上述两种方式，本发明通过两种金标抗体，利用抗bsa抗体为连接体连接两种金标抗体进而获得双重胶体金，能够克服上述问题，该标记方式简单，易制备，检测的稳定性好，时间短，极大降低自组装折叠现象的产生。

3、该试剂盒结合双重胶体金以及预孵育进行检测乳粉中阪崎克罗诺杆菌，增强了试纸条的检测线处的显色效果，提高了检测的灵敏度，解决了试纸条灵敏低的问题，本发明试剂盒对纯阪崎克罗诺杆菌的检测限可达10³cfu/ml，对奶粉的检测限可达10⁴cfu/ml，传统型试纸条对纯阪崎克罗诺杆菌的检测限为10⁵cfu/ml，对奶粉的检测限为10⁶cfu/ml，本发明试剂盒相比于传统型试纸条灵敏度提高了100倍，降低了检测限；同时本发明试剂盒所需前增菌时间仅为5h，相比较传统型前增菌需7h，此种方法使检测时间缩短了2h。

4、本发明提供了一种简单方便的提高灵敏度的方式，无需额外的繁琐操作步骤。所获得的信号增强型试纸条稳定性好，特异性强，检测时间短，制作简便且成本低，方便携带，可用于现场检测。

附图说明

图1为试剂盒组成及原理图；

(a，酶标孔；1，样品垫；2，结合垫；3，nc膜；4，吸水垫；5，底板；6，检测线；7，控制线，c，第一金标抗体；d，第二金标抗体)。

图2为试剂盒检测阪崎克罗诺杆菌灵敏度结果图。

图3为试剂盒检测乳粉中阪崎克罗诺杆菌灵敏度结果图。

图4为传统试纸条检测灵乳粉中阪崎克罗诺杆菌灵敏度结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中使用的菌株名称及来源如表1所示。

表1所使用的菌株名称及来源

实施案例1：试剂盒制备条件优化

1、两种金标抗体的胶体金粒径优化

1.1两种金标抗体的制备

第一金标抗体c的制备即胶体金上标记抗阪崎克罗诺单克隆检测抗体：取1ml4中不同粒径(16nm,26nm,42nm,54nm)的胶体金溶液，分别加入0.2m碳酸钾4ul调节溶液ph值，加入抗阪崎克罗诺单克隆检测抗体8ug，混匀，室温静置反应1h以上后，加入封闭剂10％bsa100ul，混匀，室温静置反应1h以上；16nm胶体金溶液10℃，12000rpm，离心20min，去掉上清(上清一定要尽量吸取干净)；26nm胶体金溶液10℃，7000rpm，离心20min，去掉上清；42nm胶体金溶液10℃，6500rpm，离心20min，去掉上清；54nm胶体金溶液10℃，5200rpm，离心20min，去掉上清；加150ul复溶液(5％蔗糖、12％海藻糖、1％bsa和0.3％吐温-20,且ph值为8.5的tris缓冲溶液)复溶沉淀并混匀。

第二金标抗体d的制备即胶体金上标记抗阪崎克罗诺单克隆检测抗体：取1ml4中不同粒径(16nm,26nm,42nm,54nm)的胶体金溶液，分别加入0.2m碳酸钾4ul调节溶液ph值，加入抗阪崎克罗诺单克隆检测抗体8ug，混匀，室温静置反应1h以上后，加入封闭剂10％人血清白蛋白100ul，混匀，室温静置反应1h以上；16nm胶体金溶液10℃，12000rpm，离心20min，去掉上清(上清一定要尽量吸取干净)；26nm胶体金溶液10℃，7000rpm，离心20min，去掉上清；42nm胶体金溶液10℃，6500rpm，离心20min，去掉上清；54nm胶体金溶液10℃，5200rpm，离心20min，去掉上清；加150ul复溶液(5％蔗糖、12％海藻糖、1％bsa和0.3％吐温-20,且ph值为8.5的tris缓冲溶液)复溶沉淀并混匀。

1.2组装信号增强型试纸条

样品垫1及结合垫2先经过稀释液(2％吐温-20、0.1％氯化钠、1％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、0.5％酪蛋白，且ph值为8.5的tris缓冲溶液)处理，后置于65℃鼓风干燥箱中干燥1h取出备用。将结合垫2、nc膜3、吸水垫4分别黏贴在pvc板上，每两个垫之间有2-3mm的交叠，在nc(3)膜上分别喷抗阪崎克罗诺捕获抗体1.8mg/ml、羊抗鼠二抗0.6mg/ml分别作为检测线6和控制线7，控制划膜仪的喷速为0.8ul/cm，后置于37℃鼓风干燥箱中干燥1h取出，切成3mm宽的试纸条，装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用。

1.3奶粉样品处理

100g奶粉和900ml预热的nb培养基混合后，接种1ml10³cfu/ml的阪崎克罗诺杆菌，在37℃，200r/min条件下震荡培养1-8h，将菌液浓度调整为10³cfu/ml，10⁴cfu/ml，10⁵cfu/ml，10⁶cfu/ml。分别取上述6种浓度的染菌乳样10ml于4℃、12000r/min条件下离心10min后,尽量去除干净上清及奶皮，以降低奶粉中蛋白质基质的干扰，将沉淀用1ml生理盐水复溶。

1.4样品预孵育

1)在酶标抗中分别加入100ul步骤4中所获得6种浓度染菌样品液和8ul第一金标抗体，室温下孵育4min。

2)再加入8ul第二金标抗体，混匀。

1.5样品上条检测

将试纸条插入酶标孔中进行检测，10min后观察检测结果。若信号增强型试纸条b的检测线6、控制线7都出现红色条带，表明可检出此浓度的阪崎克罗诺杆菌，阳性结果；若检测线6未出现红色条带，控制线7出现红色条带，不可检出此浓度的阪崎克罗诺杆菌，阴性结果；若控制线7未出现红色条带，表明试纸条失效。

1.6检测结果

进行两种粒径大小的双因素交叉实验，根据表2中数据可以知第一金标抗体的粒径在26nm-42nm范围内时，第二金标抗体的粒径在26nm-54nm范围内时，检测限较低，检测效果较好，其中当第一金标抗体粒径为26nm，第二金标抗体粒径为42nm时灵敏度提高效果最好，可检测到10⁴cfu/ml,且检测线颜色较深，可明显观察到结果，且无假阳性存在。

表2两种金标抗体粒径优化结果

注：“－”阴性，“+”和“±”表示t线显色的强度，“±”比“+”显色弱，越多“+”表示显色越强。

2、两种金标抗体的加入量优化

2.1两种金标抗体的制备

第一金标抗体c的制备即胶体金上标记抗阪崎克罗诺单克隆检测抗体：取1ml26nm的胶体金溶液，加入0.2m碳酸钾4ul调节溶液ph值，加入抗阪崎克罗诺单克隆检测抗体8ug，混匀，室温静置反应1h以上后，加入封闭剂10％bsa100ul，混匀，室温静置反应1h以上；后在10℃，7000rpm条件下，离心20min，去掉上清。加150ul复溶液(5％蔗糖、12％海藻糖、1％bsa和0.3％吐温-20,且ph值为8.5的tris缓冲溶液)复溶沉淀并混匀。

第二金标抗体d的制备即胶体金上标记抗阪崎克罗诺单克隆检测抗体：取1ml42nm的胶体金溶液，加入0.2m碳酸钾4ul调节溶液ph值，加入抗阪崎克罗诺单克隆检测抗体8ug，混匀，室温静置反应1h以上后，加入封闭剂10％人血清白蛋白100ul，混匀，室温静置反应1h以上；后在10℃，6500rpm条件下，离心20min，去掉上清。加150ul复溶液(5％蔗糖、12％海藻糖、1％bsa和0.3％吐温-20,且ph值为8.5的tris缓冲溶液)复溶沉淀并混匀。

2.2组装信号增强型试纸条

样品垫1及结合垫2先经过稀释液(2％吐温-20、0.1％氯化钠、1％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、0.5％酪蛋白，且ph值为8.5的tris缓冲溶液)处理，后置于65℃鼓风干燥箱中干燥1h取出备用。将结合垫2、nc膜3、吸水垫4分别黏贴在pvc板上，每两个垫之间有2-3mm的交叠，在nc(3)膜上分别喷抗阪崎克罗诺捕获抗体1.8mg/ml、羊抗鼠二抗0.6mg/ml分别作为检测线6和控制线7，控制划膜仪的喷速为0.8ul/cm，后置于37℃鼓风干燥箱中干燥1h取出，切成3mm宽的试纸条，装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用。

2.3奶粉样品处理

100g奶粉和900ml预热的nb培养基混合后，接种1ml10³cfu/ml的阪崎克罗诺杆菌，在37℃，200r/min条件下震荡培养1-8h，将菌液浓度调整为10³cfu/ml，10⁴cfu/ml，10⁵cfu/ml，10⁶cfu/ml。分别取上述6种浓度的染菌乳样10ml于4℃、12000r/min条件下离心10min后,尽量去除干净上清及奶皮，以降低奶粉中蛋白质基质的干扰，将沉淀用1ml生理盐水复溶。

2.4样品预孵育

1)在酶标抗中分别加入100ul步骤4中所获得6种浓度染菌样品液和第一金标抗体(6ul，7ul，8ul，9ul)，室温下孵育4min。

3)再加入第二金标抗体(6ul，7ul，8ul，9ul)，混匀。

2.5样品上条检测

将试纸条插入酶标孔中进行检测，10min后观察检测结果。

若信号增强型试纸条b的检测线6、控制线7都出现红色条带，表明可检出此浓度的阪崎克罗诺杆菌，阳性结果；若检测线6未出现红色条带，控制线7出现红色条带，表明不可检出此浓度的阪崎克罗诺杆菌，阴性结果；若控制线7未出现红色条带，表明试纸条失效。

本发明试剂盒可以用于检测检测阪崎克罗诺杆菌。

2.6检测结果

进行两种金标抗体加入量的双因素交叉实验，结果如表3所示，第一金标抗体和第二金标抗体的加入量均在6ul-9ul的范围内，检测效果均较好，并且相较与其他结果当第一金标抗体与第二金标抗体加入量为1:1时灵敏度结果较好，且第一金标抗体与第二金标抗体加入量都为8ul是灵敏度提高效果最好，可检测到10⁴cfu/ml,且检测线颜色较深，可明显观察到结果，且无假阳性存在。

表3两种金标抗体加入量优化结果

注：“－”阴性，“+”和“±”表示t线显色的强度，“±”比“+”显色弱，越多“+”表示显色越强。

实施例2：本发明试剂盒的制备及应用

1、试剂盒的制备

本实施例提供了一种快速检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，该试剂盒包括酶标孔a、信号增强型试纸条b、第一金标抗体c和第二金标抗体d；信号增强型试纸条b包括样品垫1、结合垫2、nc膜3、吸水垫4和底板5，nc膜3上设有检测线6和控制线7，检测线6上包被有抗阪崎克罗诺杆菌捕获抗体，控制线7上包被有羊抗鼠二抗；第一金标抗体c上包被有抗阪崎克罗诺杆菌检测抗体，且由bsa封闭结合位点；第二金标抗体d上包被有抗bsa抗体；第一金标抗体c和第二金标抗体d结合形成双金标抗体。

第一金标抗体c(粒径为26nm)的制备方法，即在胶体金上标记抗阪崎克罗诺单克隆检测抗体，具体步骤为：取1ml26nm胶体金溶液加入0.2m碳酸钾4ul调节溶液ph值，加入抗阪崎克罗诺单克隆检测抗体8ug，混匀，室温静置反应1h以上后，加入封闭剂10％bsa100ul，混匀，室温静置反应1h以上；10℃，7000rpm，离心20min，去掉上清(上清一定要尽量吸取干净)，加150ul复溶液(5％蔗糖、12％海藻糖、1％bsa和0.3％吐温-20,且ph值为8.5的tris缓冲溶液)复溶沉淀并混匀。

第二金标抗体d(粒径为42nm)的制备方法，即在胶体金上标记抗阪崎克罗诺单克隆检测抗体，具体步骤为：每1ml胶体金溶液加入碳酸钾调节溶液ph值后加入抗bsa抗体8ug，混匀，室温静置反应1h以上后，加入封闭剂10％100ul的人血清白蛋白，混匀，室温静置反应1h以上；10℃，6500rpm，离心20min后去掉上清，加150ul复溶液复溶沉淀并混匀即得第二金标抗体。

信号增强型试纸条b的组装方法为：

样品垫1及结合垫2先经过稀释液(2％吐温-20、0.1％氯化钠、1％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、0.5％酪蛋白，且ph值为8.5的tris缓冲溶液)处理，后置于65℃鼓风干燥箱中干燥1h取出备用。将结合垫2、nc膜3、吸水垫4分别黏贴在pvc板上，每两个垫之间有2-3mm的交叠，在nc3膜上分别喷抗阪崎克罗诺捕获抗体1.8mg/ml、羊抗鼠二抗0.6mg/ml分别作为检测线6和控制线7，控制划膜仪的喷速为0.8ul/cm，后置于37℃鼓风干燥箱中干燥1h取出，切成3mm宽的试纸条，装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用。

试剂盒的检测方法包括如下步骤：

1)在酶标孔a中加入100ul样品液和8ul第一金标抗体c，室温下孵育4min；

2)再加入8ul第二金标抗体d，混匀；

3)将试纸条插入酶标孔a中进行检测，10min后观察检测结果；

4)判定方法：若信号增强型试纸条b的检测线6、控制线7都出现红色条带，表明样品中含有阪崎克罗诺杆菌，阳性结果；若检测线6未出现红色条带，控制线7出现红色条带，表明样品中不含有阪崎克罗诺杆菌，阴性结果；若控制线7未出现红色条带，表明试纸条失效；其中检测线6颜色越深，表明样品中含有的阪崎克罗诺杆菌浓度越高。

本发明试剂盒可以用于检测阪崎克罗诺杆菌。

2、试剂盒的性能试验

利用1中制备的试剂盒进行如下性能试验。

2.1试剂盒灵敏度实验

2.1.1试剂盒检测纯菌(阪崎克罗诺杆菌)的检测限的测定

将培养好10⁸cfu/ml阪崎克罗诺杆菌液用生理盐水进行梯度稀释至10⁷cfu/ml，10⁶cfu/ml，10⁵cfu/ml，10⁴cfu/ml，10³cfu/ml，10²cfu/ml，以生理盐水作为阴性对照。

样品预孵育方法：

1)在酶标抗中分别加入100ul上述制备的7种浓度染菌样品液和8ul第一金标抗体，室温下孵育4min。

2)再加入8ul第二金标抗体，混匀。

上条检测：

将试纸条插入酶标孔中进行检测，10min后观察检测结果。若信号增强型试纸条b的检测线6出现红色条带，控制线7出现红色条带，可检出此浓度的阪崎克罗诺杆菌；若检测线6未出现红色条带，控制线7出现红色条带，不可检出此浓度的阪崎克罗诺杆菌，阴性结果；若控制线7未出现红色条带，表明试纸条失效。

试剂盒纯菌检测限实验结果：

测结果如图2所示，使用该试剂盒可检测到浓度为10³cfu/ml的纯菌液，且无假阳性存。

2.1.2试剂盒检测乳粉中阪崎克罗诺杆菌的检测限的测定

奶粉样品处理方法：

100g奶粉和900ml预热的nb培养基混合后，接种1ml10³cfu/ml的阪崎克罗诺杆菌，在37℃，200r/min条件下震荡培养1-8h，将菌液浓度调整为10³cfu/ml，10⁴cfu/ml，10⁵cfu/ml，10⁶cfu/ml，10⁷cfu/ml，10⁸cfu/ml。分别取上述6种浓度的染菌乳样10ml于4℃、12000r/min条件下离心10min后,尽量去除干净上清及奶皮，以降低奶粉中蛋白质基质的干扰，将沉淀用1ml生理盐水复溶，以生理盐水作为阴性对照。

样品预孵育方法：

1)在酶标抗中分别加入100ul上述制备的6种浓度染菌样品液和8ul第一金标抗体，室温下孵育4min。

2)再加入8ul第二金标抗体，混匀。

样品上条检测：

将试纸条插入酶标孔中进行检测，10min后观察检测结果。若信号增强型试纸条b的检测线6出现红色条带，控制线7出现红色条带，可检出乳样中此浓度的阪崎克罗诺杆菌；若检测线6未出现红色条带，控制线7出现红色条带，不可检出乳样中此浓度的阪崎克罗诺杆菌；若控制线7未出现红色条带，表明试纸条失效。

试剂盒检测乳样中阪崎克罗诺杆菌检测限实验结果：

检测结果如图3所示，使用该试剂盒可检测到乳样中浓度为10⁴cfu/ml的阪崎克罗诺杆菌，且无假阳性存。

2.2、试剂盒特异性实验

针对7株克罗诺杆菌和16株非克罗诺杆菌(如表1)进行特异性验证试验来研究试剂条的特异性，其中选用7株克罗诺杆菌除阪崎克罗诺杆菌试验的试纸条c线和t线均显色，呈阳性外，其余16株非阪崎克罗诺杆菌试验的试纸条c线和t线均显色，呈阴性。说明本发明试剂盒对检测阪崎克罗诺杆菌特异性强。

2.3、试剂盒的稳定性

将信号增强型试纸条分别置于常温及60℃进行保藏实验，测定试纸条的稳定性。每周取出常温保存的试纸条，检测阪崎克罗诺杆菌浓度为10³cfu/ml，10⁴cfu/ml，10⁵cfu/ml，10⁶cfu/ml，10⁷cfu/ml，10⁸cfu/ml，测其灵敏度。每天取出60℃保存的试纸条，检测阪崎克罗诺杆菌浓度为10³cfu/ml，10⁴cfu/ml，10⁵cfu/ml，10⁶cfu/ml，10⁷cfu/ml，10⁸cfu/ml，测其灵敏度。

试纸条在常温下保存12个月，灵敏度仍未发生变化；在60℃条件下存放7d时，仍能检出10⁴cfu/ml浓度的阪崎克罗诺杆菌，60℃条件下存放7d相当于在常温存放490d，所以说此试纸条灵敏度较好，在常温条件下可存放一年以上，本发明试剂盒稳定性较好。

3、试剂盒检测奶粉中阪崎克罗诺杆菌

本实施例随机抽样16份乳粉并且人工感染8份乳粉，利用上述1中制备的试剂盒实际检测乳粉中的阪崎克罗诺杆菌，同时也利用国标法进行检测，与试剂盒进行比较。具体方法如下：

1)100g奶粉和900ml预热的nb培养基混合后，在37℃，200r/min条件下震荡前增菌5h，取10ml于4℃、12000r/min条件下离心20min，尽量去除干净上清及奶皮，以降低乳粉中蛋白质基质的干扰，将沉淀用1ml生理盐水复溶。

2)取步骤1所得样溶液100ul及第一金标抗体8ul于酶标孔中预孵育4min，使得第一金标抗体与样品充分结合。

3)再向酶标孔中加入第二金标抗体8ul，混匀，使得第一金标抗体与第二金标抗体相连增强信号。

4)将试纸条插入步骤3中的酶标孔中，10min后观察检测结果：若信号增强型试纸条b的检测线6、控制线7都出现红色条带，表明乳样中含有阪崎克罗诺杆菌，阳性结果；若检测线6未出现红色条带，控制线7出现红色条带，表明乳样中不含有阪崎克罗诺杆菌，阴性结果；若控制线7未出现红色条带，表明试纸条失效；其中检测线6颜色越深，表明乳样中含有的阪崎克罗诺杆菌浓度越高。

检测结果

使用该试剂盒进行检测发现，该试剂盒可将8份人工污染样品检出，另外8份呈现阴性，与国标法检测结果一致，正确率达100％，且总检测过程仅需5h34min。

实施例3：本发明试剂盒的制备及与传统试纸条制备及检测灵敏度对比实验

本实施例结合本发明的方法，制备一种传统型试纸条作为对照实验，与本发明的试剂盒进行比对，具体方法如下：

1、金标抗体的制备

取1ml26nm胶体金溶液加入0.2m碳酸钾4ul调节溶液ph值，加入抗阪崎克罗诺单克隆检测抗体8ug，混匀，室温静置反应1h以上后，加入封闭剂10％bsa100ul，混匀，室温静置反应1h以上；10℃，7000rpm，离心20min，去掉上清(上清一定要尽量取干净)，加150ul复溶液(5％蔗糖、12％海藻糖、1％bsa和0.3％吐温-20,且ph值为8.5的tris缓冲溶液)复溶沉淀并混匀。

2、组装试纸条

样品垫1及结合垫2先经过稀释液(2％吐温-20、0.1％氯化钠、1％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、0.5％酪蛋白，且ph值为8.5的tris缓冲溶液)处理，后置于65℃鼓风干燥箱中干燥1h取出备用。j将2.1中所制得的金标抗体喷在结合垫上制成金标垫，并置于37℃鼓风干燥箱中干燥1h。将样品垫、金标垫、nc膜、吸收垫分别黏贴在pvc板上，每两个垫之间有2-3mm的交叠，在nc膜上分别喷抗阪崎克罗诺捕获抗体1.8mg/ml、羊抗鼠二抗0.6mg/ml分别作为检测线(7)和控制线(8)，控制划膜仪的喷速为0.8ul/cm，后置于37℃鼓风干燥箱中干燥1h取出，切成3mm宽的试纸条，装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用。

3、奶粉样品处理

100g奶粉和900ml预热的nb培养基混合后，接种1ml10³cfu/ml的阪崎克罗诺杆菌，在37℃，200r/min条件下震荡培养1-8h，将菌液浓度调整为10³cfu/ml，10⁴cfu/ml，10⁵cfu/ml，10⁶cfu/ml，10⁷cfu/ml，10⁸cfu/ml。分别取上述6种浓度的染菌乳样10ml于4℃、12000r/min条件下离心10min后,尽量去除干净上清及奶皮，以降低奶粉中蛋白质基质的干扰，将沉淀用1ml生理盐水复溶。

4、样品上条检测

取上述3中处理过的6种浓度的样液100ul滴加在试纸条的样品垫上进行检测，10min后观察检测结果。若检测线7出现红色条带,检测线8出现红色条带，表明可检出此浓度阪崎克罗诺杆菌；若检测线7未出现红色条带，检测线8出现红色条带，表明不可检出此浓度阪崎克罗诺杆菌；若检测线8未出现红色条带，表明试纸条失效。

检测结果如图4，最终获得检测灵敏度为10⁶cfu/ml，需前增菌7h。

利用传统型试剂条对纯阪崎克罗诺杆菌菌液进行检测发现，使用该试剂盒可检测到浓度为10⁵cfu/ml的纯菌液。

综上，本发明制备的试剂盒，相比于传统型试纸条灵敏度提高了100倍，检测限低；利用传统的胶体金试纸条检测需前增菌7h，利用此试剂盒则仅需5h前增菌时间，大大缩短了检测所用时间。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。