一种调控微生物代谢多糖化合物组成的方法
【专利摘要】本发明涉及一种调控微生物代谢产多糖化合物组成的方法，该方法包括如下步骤：（1）在基础培养集中添加不同生糖氨基酸；（2）培养微生物：（3）收获多糖。与现有技术相比，本发明通过在培养基中添加不同的生糖氨基酸替代其它的氮源和磷源来提高微生物代谢产多糖化合物的含量，具有生产成本低，节约分离纯化费用、工艺简单和多糖产量高等优点，是工业制备微生物产多糖化合物的快速、有效的方法。
【专利说明】一种调控微生物代谢多糖化合物组成的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种调控微生物代谢组成的方法，尤其是涉及一种调控微生物代谢多糖化合物组成的方法。
【背景技术】
[0002]多糖是指由20个以上单糖构成的糖类化合物，根据来源不同可分为植物多糖、动物多糖和微生物多糖，其中微生物多糖是指由细菌、真菌以及蓝藻等微生物在代谢过程中产生的具有保护其自身作用的生物大分子聚合物，由于微生物产生的多糖具有低毒、理化性质独特、生产周期短、易于分离纯化等优势、在食品、医药、石油以及化工等多个领域都具有广阔的应用前景。
[0003]通过优化培养条件来提高多糖产量是目前多糖制备中普遍关注的问题，碳源是微生物代谢产多糖中的主要营养源，不同碳源及组合对微生物多糖的合成有很大的影响，Cerning等人研究发现在培养基中加入葡萄糖可以促进干酪乳杆菌CG22产生胞外多糖；白丽娟研究发在乳酸菌的液体培养基中添加葡萄糖/麦芽糖或葡萄糖和乳糖的组合作为碳源，均利于乳酸菌胞外多糖的生产；Gancel F研究发现在培养基中添加乳糖时唾液链球菌嗜热亚种发酵胞外多糖的量最大；MoZZi F发现在合成培养基中加入半乳糖有利于干酪乳杆菌胞外多糖的生物合成；Arsnio M发现添加葡萄糖后可以促进S.paucimobilisATCC3146产生结冷胶。这些都是通过调节碳源来调控微生物的多糖代谢，氮源也是微生物生长所必需的营养，以前常用的氮源分为无机氮和有机氮，相比较有机氮的利用率要高于无机氮，常用的有牛肉膏、酵母膏、以及一些由动、植物蛋白质经酶消化后的各种蛋白胨，但是这些氮源微生物在利用时还需要进一步的消化，而且不同的细菌在利用这些复杂有机氮源时的利用效率也不同。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种调控微生物代谢产多糖化合物组成的方法，通过在培养基中直接加入不同的氨基酸，加入的生糖氨基酸可以在微生物体内通过糖异生产生葡萄糖，为多糖的合成提供单体，氨基酸的氨基还可以为微生物的生长提供氮源，这种方法能有效提高微生物代谢产多糖化合物的含量，且生产成本较低。
[0005]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0006]一种调控微生物代谢产多糖化合物组成的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:
[0007](I)基础培养基预处理:向基础培养基中加入生糖氨基酸组成介质；
[0008](2)培养微生物:将微生物置于预处理后的介质中培养，微生物的加入量为介质的3%~5% (V/V)，控制培养温度为38°C~42°C，培养时间为24h~48h，得到微生物的发酵液；
[0009](3)收获多糖:首先利用有机溶剂沉淀法来处理步骤(2)中得到的发酵液获得粗多糖，然后通过沙维积(sevag)法脱去除蛋白以及凝胶柱层析法除去低分子量的杂质后，SP收获多糖。
[0010]所述步骤(I)中的基础培养基为微生物正常的生长代谢提供营养，该基础培养基的组成为乙酸钠5.0g/L，柠檬酸氢二胺2.0g/L，吐温-801.0ml/L，磷酸氢二钾2.0g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸锰0.05g/L,蒸馏水1.0L。[0011]所述步骤(I)中的生糖氨基酸包括丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gin)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、脯氨酸(Pro)、异亮氨酸(He)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)，各氨基酸的加入量均为2.0g/L。
[0012]所述步骤(2)中的微生物为具有代谢产多糖化合物性能的微生物，该微生物包括乳酸菌。
[0013]所述的乳酸菌为市售的乳酸乳球菌(Lactococcus Schleifer)。
[0014]所述步骤(3)中有机溶剂沉淀工艺包括以下步骤:将除去细胞的发酵液先进行旋转蒸发浓缩然后加入3倍体积的预冷乙醇，在4°C下沉淀12h，通过离心收集沉淀，最后通过洗涤烘干得到粗多糖。
[0015]本发明与现有技术相比，具有如下优点:
[0016](I)由于只需要在基础培养基中加入氨基酸，不需加入其它氮源和碳源，因此有效地降低了生产成本；
[0017](2)由于本发明省去了分离纯化工艺，因此有效地节约分离纯化的费用；
[0018](3)本发明能有效提高微生物代谢产多糖组合物的含量，多糖组合物含量提高20%以上。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0020]实施例1
[0021]一种调控微生物代谢产多糖化合物组成的方法，该方法包括以下步骤:
[0022](I)基础培养基预处理:基础培养基预处理:向基础培养基中加入氨基酸组成介质，所用培养基:乙酸钠5.0g/L,柠檬酸氢二胺2.0g/L,吐温-801.0ml/L,磷酸氢二钾2.0g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸锰0.05g/L,蒸馏水1.0L。在上述液体培养基中分别加入2.0g/L的下述生糖氨基酸:丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gin)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、脯氨酸(Pro)、异亮氨酸(He)、甲硫氨酸(Met)、缴氨酸(Val)、天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)。
[0023](2)培养微生物:利用乳酸乳球菌Lactococcus Schleifer发酵生产多糖,将微生物乳酸乳球菌Lactococcus Schleifer置于由基础培养基和氨基酸组成的介质中培养,微生物的加入量为介质的3% (v/v)，控制培养温度为38°C，培养时间为24h，得到微生物的发酵液。
[0024](3)收获多糖:培养结束后，首先将除去细胞的发酵液先进行旋转蒸发浓缩然后加入3倍体积的预冷乙醇，在4°C下沉淀12h，通过离心收集沉淀，洗涤烘干得到粗多糖，然后将粗多糖通过沙维积(sevag)法脱蛋白，通过凝胶柱层析去除多糖中的低分子量杂质，得到纯化的多糖化合物。
[0025]采用凝胶柱层析法分析鉴定，结果表明:Lactococcus Schleifer在含有不同生糖氨基酸培养基和未加生糖氨基酸培养基相比，前者产生的生物多糖的含量为110mg/L~130mg/L，后者为82mg/L，加生糖氨基酸培养基产生的生物多糖明显高于未加生糖氨基酸培养基产生的多糖，乳酸乳球菌产生的多糖属于异源多糖，在细胞膜上合成，它的合成需要活性前体包括高能态的单糖，生糖氨基酸:丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gin)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、脯氨酸(Pro)、异亮氨酸(He)、甲硫氨酸(Met)、缴氨酸(Val)、天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)在代谢中可以通过糖异生途径合成葡萄糖，而其中的氨基也可以为微生物的生长提供氮源，加入这些氨基酸后乳酸球菌产生胞外多糖的产量明显增加最低为115.8mg/L，最高达到了 135.3mg/L,其它非生糖氨基酸如赖氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)和亮氨酸(Leu)对多糖的产量影响不是很明显，胞外多糖的产量在92mg/L左右，明显低于加入生糖氨基酸的培养基产生的多糖。
[0026]实施例2
[0027]—种调控微生物代谢产多糖化合物组成的方法，该方法包括以下步骤:
[0028](I)基础培养基预处理:基础培养基预处理:向基础培养基中加入氨基酸组成介质，所用培养基:乙酸钠5.0g/L,柠檬酸氢二胺2.0g/L,吐温-801.0ml/L,磷酸氢二钾2.0g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸锰0.05g/L,蒸馏水1.0L。在上述液体培养基中分别加入2.0g/L的下述生糖氨基酸:丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gin)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、脯氨酸(Pro)、异亮氨酸(He)、甲硫氨酸(Met)、缴氨 酸(Val)、天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)。
[0029](2)培养微生物:利用乳酸乳球菌Lactococcus Schleifer发酵生产多糖,将微生物乳酸乳球菌Lactococcus Schleifer置于由基础培养基和氨基酸组成的介质中培养,微生物的加入量为介质的4% (v/v)，控制培养温度为40°C，培养时间为36h，得到微生物的发酵液。
[0030](3)收获多糖:培养结束后，首先将除去细胞的发酵液先进行旋转蒸发浓缩然后加入3倍体积的预冷乙醇，在4°C下沉淀12h，通过离心收集沉淀，洗涤烘干得到粗多糖，然后将粗多糖通过沙维积法(sevag)脱蛋白，通过凝胶柱层析去除多糖中的低分子量杂质，得到纯化的多糖化合物，多糖含量为128.2mg/L。
[0031]实施例3
[0032]一种调控微生物代谢产多糖化合物组成的方法，该方法包括以下步骤:
[0033](I)基础培养基预处理:基础培养基预处理:向基础培养基中加入氨基酸组成介质，所用培养基:乙酸钠5.0g/L,柠檬酸氢二胺2.0g/L,吐温-801.0ml/L,磷酸氢二钾2.0g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸锰0.05g/L,蒸馏水1.0L。在上述液体培养基中分别加入2.0g/L的下述生糖氨基酸:丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gin)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、脯氨酸(Pro)、异亮氨酸(He)、甲硫氨酸(Met)、缴氨酸(Val)、天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)。
[0034](2)培养微生物:利用乳酸乳球菌Lactococcus Schleifer发酵生产多糖,将微生物乳酸乳球菌Lactococcus Schleifer置于由基础培养基和氨基酸组成的介质中培养,微生物的加入量为介质的5% (v/v)，控制培养温度为42°C，培养时间为48h，得到微生物的发酵液。
[0035](3)收获多糖:培养结束后，首先将除去细胞的发酵液先进行旋转蒸发浓缩然后加入3倍体积的预冷乙醇，在4°C下沉淀12h，通过离心收集沉淀，洗涤烘干得到粗多糖，然后将粗多糖通过沙维积法(sevag)脱蛋白，通过凝胶柱层析去除多糖中的低分子量杂质，得到纯化的多糖化合物，多糖 含量为135.3mg/L。
【权利要求】
1.一种调控微生物代谢产多糖化合物组成的方法，包括以下步骤: (1)基础培养基预处理:向基础培养基中加入生糖氨基酸组成介质； (2)培养微生物:将微生物置于预处理后的介质中培养，微生物的加入量为介质的3%~5% (V/V)，控制培养温度为38°C~42°C，培养时间为24h~48h，得到微生物的发酵液； (3)收获多糖:首先利用有机溶剂沉淀法来处理步骤(2)中得到的发酵液获得粗多糖，然后通过沙维积(sevag)法脱去除蛋白以及凝胶柱层析法除去低分子量的杂质后，即收获多糖。
2.根据权利要求1所述的调控微生物代谢产多糖化合物组成的方法，其特征在于所述的基础培养基为微生物正常的生长代谢提供营养，该基础培养基的组成为乙酸钠5.0g/L，柠檬酸氢二胺2.0g/L,吐温-801.0ml/L,磷酸氢二钾2.0g/L,七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸猛0.05g/L，蒸馏水LOL0
3.根据权利要求1所述的调控微生物代谢产多糖化合物组成的方法，其特征在于所述的生糖氨基酸包括丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gin)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、脯氨酸(Pro)、异亮氨酸(He)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)，各氨基酸的加入量均为2.0g/L。
4.根据权利要求1所述的调控微生物代谢产多糖化合物组成的方法，其特征在于所述的微生物为具有代谢产多糖化合物性能的微生物，该微生物包括乳酸菌。
5.根据权利要求4所述的乳酸菌，其特征在于所述的乳酸菌为市售的乳酸乳球菌(Lactococcus SchleiferX
6.根据权利要求1所述的调控微生物代谢产多糖化合物组成的方法，其特征在于所述的有机溶剂沉淀工艺包括以下步骤:将除去细胞的发酵液先进行旋转蒸发浓缩然后加入3倍体积的预冷乙醇，在4°C下沉淀12h，通过离心收集沉淀，最后通过洗涤烘干得到粗多糖。
【文档编号】C12P19/04GK103468763SQ201310450637
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】郭辽原, 胡婧, 曹功泽, 李彩风, 王刚, 郝斌, 冯云, 宋欣, 徐登霆, 刘涛, 曹嫣镔, 宋永亭, 张守献 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司胜利油田分公司采油工艺研究院