一种富锗桑黄发酵产物的制备方法

一种富锗桑黄发酵产物的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种富锗桑黄发酵产物的制备方法，包括：将活化的桑黄菌种接种于添加辣木提取物的液体种子培养基中培养得桑黄液体菌种；先将桑黄液体菌种接入添加有汗麻叶酶解物、甜菜渣、富锗酵母和茶籽饼的固体培养基中培养得富锗桑黄固体培养物Ⅰ；再将桑黄液体菌种接入添加富锗桑黄固体培养物Ⅰ、富锗酵母和柳珊瑚降解物的液体培养基中培养得富锗桑黄液体发酵产物。本发明通过在固体发酵和液体发酵阶段添加有利于有机锗和锗多糖代谢生成的外源添加物，并将桑黄在固体发酵阶段的培养产物作为外源添加物添加到液体发酵阶段中循环利用，通过固体发酵和液体发酵两阶段的协同培养，大幅度提高了最终桑黄发酵产物中有机锗、桑黄锗多糖的含量和活性。
【专利说明】一种富锗桑黄发酵产物的制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种富锗桑黄发酵产物的制备方法。

【背景技术】
[0002] 桑黄（Phellinus igniarius)属担子菌亚门，层孔菌纲，锈革孔菌科，针层孔菌属。 桑黄菌提取物在抑制癌细胞转移和防止癌症手术后复发等的临床应用中具有显著效果，是 目前国际公认的生物治癌药剂中有效率最高的一种药用真菌。作为目前国际公认的抗癌效 果最好的大型药用真菌，桑黄抑制肿瘤的研究主要集中在药理活性成分桑黄多糖上。
[0003] 锗是一种具有高度生物活性的微量元素，是人体不可缺少的物质之一。锗主要以 化合物和络合物的形式存在，分为无机锗与有机锗两种，无机锗毒性较大，对人体是严格禁 用的，有机锗的药理作用和保健功能已引起了人们的重视，尤其是富集在植物和草药中的 有机锗被认为是发挥药理作用和保健功能的主要因素。近年来研究表明：有机锗可使人体 酶活化，增强细胞活力，促进机体新陈代谢，具有抗肿瘤、消炎与免疫调节、抗病毒、抗氧化、 抗衰老、降血脂、促进植物和微生物的生长、改善血液循环、增加携氧量等多重功能，某些药 物的医疗保健功能都与之有关。
[0004] 食药真菌具有很强的富集微量元素的作用，是锗元素的优良载体生物。桑黄作为 富集锗元素的载体，可通过菌丝细胞内物质代谢的转化将锗结合到大分子活性物质上，形 成锗多糖和锗蛋白。富锗桑黄多糖含有微量的天然有机锗，是锗与多糖的联合体，集多糖和 锗的优点和生物活性于一身。
[0005] 锗多糖既可作为免疫调节剂，又可作为防癌、抗病毒的保健品，其生物活性普遍高 于多糖和有机锗，且更易于机体的吸收和利用。在清除活性氧自由基方面锗多糖也有独特 功能，从而可以使人体避免由氧自由基引起的如炎症、衰老、肿瘤、免疫性损伤、某些药物毒 性等100余种疾病。
[0006] 微生物发酵是一个十分复杂的生物化学反应过程。有些次生代谢产物的合成代谢 非常复杂，发酵过程的细微差别都会引起产物代谢的不同响应。在真菌不同生长阶段用外 源添加物处理，其细胞生长和次级代谢产物的积累程度不同。
[0007] 中国专利申请CN201310339260. 7公开了一种富铬锰锗硒硼灵芝菌丝体液体发酵 的方法，该方法包括：（1)将菌株转接于斜面培养基上进行培养、活化，得到斜面菌种；（2) 将斜面菌种制成孢子悬液，接于液体培养基中，摇瓶培养，得到液体菌种；（3)发酵培养基 高温灭菌后冷却，再将液体菌种接入，摇瓶培养，得到含菌丝体的发酵液；(4)通过过滤将 菌丝体及发酵液分离，纯净水冲洗菌丝，洗去培养基，收集菌丝体，烘至恒重，制得干菌丝 体。该方法的技术关键是在发酵培养基中添加微量元素。
[0008] 中国专利ZL200910011338. 6公开了一种富锗灵芝菌丝体的生产方法，按以下步 骤进行：制备富锗玉米浸泡液；在富锗玉米浸泡液中加入碳源、氮源、中量元素、豆油制备 培养基并灭菌、冷却；在培养基中接种经斜面培养的灵芝液体菌种，培养菌种至生成灵芝菌 丝体。可将有机锗元素（玉米锗）转化为灵芝锗生物大分子，明显提高了灵芝中有机锗含 量，使灵芝在有效发挥灵芝多糖作用的前提下，还可以充分发挥有机锗的作用。
[0009] 上述技术一般仅单一采用液态或固态发酵方式，简单地模仿常规食药用菌菌丝体 发酵的方式，以牛肉膏、蛋白胨或普通酵母粉为氮源，以蔗糖、葡萄糖或大米为主要碳源，在 培养基中添加二氧化锗等无机锗为主的锗源，未考虑特定食药用菌在发酵过程中对培养基 的特殊营养要求，配方的组分缺乏针对性。由于食药用菌液体培养时间有限，无机锗等一般 不容易被菌丝体吸收，简单通过培养时间有限的液体发酵制备富锗食药用菌菌丝体会导致 菌丝体、发酵液中的有机锗、锗多糖等有效组分含量不高。


【发明内容】

[0010] 本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种富锗桑黄发酵产物 的制备方法，该方法采用桑黄固体-液体发酵，安全可靠，可明显提高有机锗和桑黄锗多糖 含量和活性。
[0011] 本发明采用的技术方案是：
[0012] 一种富锗桑黄发酵产物的制备方法，包括步骤：
[0013] (1)桑黄液体种子液制备：将活化后的桑黄菌种接种于添加有辣木提取物的液体 种子培养基中培养3天-7天，制备桑黄液体菌种（即桑黄液体种子液）；
[0014] (2)桑黄固体发酵培养：将步骤（1)中的桑黄液体菌种按占固体培养基体积 5% -20%的用量接入固体培养基中培养5天-20天后，将培养产物真空冷冻干燥粉碎后得 富锗桑黄固体培养物I ;所述的固体培养基中含有汗麻叶酶解物、甜菜渣、茶籽饼和富锗酵 母；
[0015] (3)桑黄液体发酵培养：将步骤（1)中的桑黄液体菌种按占液体培养基体积 5% -20 %的用量接入液体培养基中，培养3天-8天，得到富锗桑黄发酵产物；所述的液体 培养基中含有富锗桑黄固体培养物I、富锗酵母和柳珊瑚降解物。
[0016] 本发明根据药用真菌桑黄的发酵培养条件和富锗特性，利用固体发酵培养状态下 真菌微生物在接近于自然状态下的生长、代谢产物丰富以及液体发酵培养状态下发酵均 匀、培养时间较短等各自的优点，并通过在固体培养基和液体培养基中添加有利于有机锗 和桑黄锗多糖代谢生成的汗麻叶酶解物、柳珊瑚降解物等外源添加物，同时创造性地将桑 黄在固体发酵阶段的培养产物作为外源添加物添加到液体发酵阶段中循环利用，先固体发 酵、后液体发酵，通过固体发酵和液体发酵两阶段的协同培养，大幅度提高了最终桑黄发酵 产物中有机锗、桑黄锗多糖的含量和活性。
[0017] 本发明，所述的富锗桑黄发酵产物经过后续的分离处理可以得到桑黄锗多糖。所 述的分离处理为本领域常规的分离方法，例如包括：可将所述的富锗桑黄发酵产物用多层 纱布过滤，从过滤所得菌丝体中提取桑黄锗多糖。具体的提取步骤包括：将菌丝体用水 冲洗干净，在55°c -65°c干燥至恒重，粉碎得到菌丝体干粉，将菌丝体干粉按料液质量比 1:10-15加入水，90°C _95°C浸提3h-3. 5h，提取两次，合并提取液过滤收集滤液，50°C _55°C 下减压浓缩，向浓缩液中加入占浓缩液4倍-5倍体积的无水乙醇，隔夜醇沉，离心，沉淀即 为桑黄锗多糖。
[0018] 所述的桑黄菌种可采用任意一种桑黄菌种，可采用市售产品。例如桑黄 (Phellinus linteus)ACCC51181菌种购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
[0019] 为了达到更好的发明效果，进行以下优选：
[0020] 步骤⑴中，所述的辣木提取物的添加量为液体种子培养基体积的2% -8%。本 发明，添加的辣木提取物等会溶解于液体种子培养基中，因此添加辣木提取物前后的液体 种子培养基总体积不变。
[0021] 所述的辣木提取物可以选用市售产品，优选采用以下制备方法制备的辣木提取 物，包括：
[0022] 称取一定量的辣木，粉碎（优选过40目-100目），先加占辣木重量8倍量-10倍 量的质量百分浓度为70% -80%的乙醇水溶液在80°C -85°C浸提1. 5h-2h，过滤后得到上 清液，上清液浓缩真空冷冻干燥后得提取物II ;上述醇提后的辣木残渣加占辣木重量8倍 量-10倍量的水在95°C -100°C下浸提2h-2. 5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩真空冷冻干 燥后得提取物III ;合并所述提取物II和提取物III得辣木提取物。
[0023] 步骤（1)中，所述的活化后的桑黄菌种在添加有辣木提取物的液体种子培养基中 培养的温度为自然环境温度，优选为20°C -30°C。一般1L添加有辣木提取物的液体种子培 养基中接入2cm2-5cm2大小的菌块（即活化后的桑黄菌种）。
[0024] 步骤（1)中，桑黄菌种的活化方法为本领域常规的菌种活化方法，包括：将斜面保 藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22°C -30°C，培养时间4 天-10天。
[0025] 所述的PDA平板培养基和液体种子培养基均采用本领域种子培养常用的培养基， 可采用市售产品。进一步优选，所述的PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂 15g-20g，用水定容至1000mL。进一步优选，所述的液体种子培养基：葡萄糖5g-20g、酵母粉 4g、蛋白胨 3g、KH2P04lg 和 MgS040. 5g，用水定容至 1000mL。
[0026] 步骤⑵中，所述的固体培养基优选由以下质量百分比的组分组成： 1(2册0 40.1%-0.2%、1^040 . 05%-0.1%、水40%-65%和余量的营养物质。所述的营养物 质优选由以下质量百分比的组分组成：汗麻叶酶解物40% -50%、甜菜渣20% -30%、茶籽 饼20% -30%和富锗酵母10% -20%。
[0027] 步骤⑵中，所述的固体培养基的制备方法，包括：将K2HP04、MgS0 4和营养物质充 分搅拌均匀，加水，使固体培养基中水的质量百分比达到40% -65%，pH值自然，得到固体 培养基。
[0028] 步骤（2)中，所述的固体发酵培养的温度为自然环境温度，优选为20°C -30°C。
[0029] 步骤（2)中，所述的汉麻叶酶解物的制备方法，包括：将汉麻叶加水磨成浆液，灭 酶；调节浆液PH4. 5-6. 5,加入由纤维素酶和果胶酶构成的第一复合酶，在45°C -55°C进行 酶解反应〇. 5小时-1. 5小时，灭酶后调节浆液pH5. 5-7. 0,加入由淀粉酶和中性蛋白酶构成 的第二复合酶，于45°C -65°C进行酶解反应1小时-1. 5小时，灭酶后离心，上清液经过滤、 浓缩和干燥，得到汉麻叶酶解物。
[0030] 所述的第一复合酶与汉麻叶的质量比优选为1 :30-50。
[0031] 所述的第二复合酶与汉麻叶的质量比优选为1 :25-45。
[0032] 所述的纤维素酶与果胶酶的质量比优选为1:2至3:1。
[0033] 所述的淀粉酶与中性蛋白酶的质量比优选为1:3至2:1。
[0034] 所述的中性蛋白酶的酶活力优选为20. 0万U/g-30. 0万U/g、淀粉酶的酶活力优选 为10. 0万U/g-20. 0万U/g、果胶酶的酶活力优选为3. 0万U/g-5. 0万U/g、纤维素酶的酶 活力优选为2. 0万U/g-3. 0万U/g。
[0035] 将汉麻叶加水磨成浆液的步骤中，汉麻叶与水的重量比优选为1:5至1:10。所述 的汉麻叶可选用采摘后经清洗、真空冷冻干燥后的汉麻叶，也可直接选用市售的干燥汉麻 叶。
[0036] 所述的灭酶的条件依据酶失活的条件，一般为：90°C -95°C下灭酶5分钟-8分钟。
[0037] 所述的汉麻叶酶解物的制备方法中，优选：上清液用截留分子量为lkDa_4kDa的 超滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，得到汉麻叶酶解物。
[0038] 步骤（3)中，所述的液体培养基由以下质量百分比的组分组成：富锗桑黄固体培 养物I 2% -4%、葡萄糖1% -2%、富锗酵母0.04% -0.4%、柳珊瑚降解物0.05% -0.4%、 K2HP04〇m、MgS040 . 05% -0· 1% 和余量的水。
[0039] 步骤⑶中，所述的柳珊瑚降解物的制备方法，包括：将金顶侧耳接种在添加有柳 珊瑚的培养基中培养3天-15天（培养温度可保持在自然的环境温度，如21°C -28°C的环 境温度），将培养物过滤，滤液经灭菌、浓缩和真空冷冻干燥得到柳珊瑚降解物。
[0040] 所述的添加有柳珊瑚的培养基组成为：柳珊瑚15g/L-35g/L、葡萄糖15g/L、酵母 粉 3g/L、蛋白胨 4g/L、KH2P041. 5g/L、MgS040. 75g/L 和余量的水。
[0041] 所述的金顶侧耳（Pleurotus citrinopileatus)，又名榆黄蘑、金顶蘑、玉皇蘑；菌 盖草黄色至鲜黄色，光滑，漏斗状，直径3-10厘米。菌肉白色。柄偏生。所述的金顶侧耳可采 用任意一种金顶侧耳菌种，可采用市售产品。例如金顶侧耳（Pleurotus citrinopileatus) CGMCC No. 5. 838购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0042] 步骤（3)中，所述的液体发酵培养的温度为自然环境温度，优选为20°C -30°C。
[0043] 所述的金顶侧耳的菌种的接种量优选为3% -15%。
[0044] 本发明，所述的接种量指接入的菌种体积或接入的培养好的种子液体积与培养基 体积之比的百分数。
[0045] 本发明所用的培养基均需灭菌后使用，灭菌的条件采用本领域的常规条件，例如 可在 120°C _125°C下灭菌 20min-30min。
[0046] 本发明中，所述的富锗酵母中锗含量优选为500mg/kg-900mg/kg。
[0047] 富锗酵母集有机锗生物活性和酵母本身丰富的营养为一体，含有丰富的蛋白质和 矿物质等营养因子。所述的富锗酵母可以选用市售产品，优选采用以下制备方法制备的 富锗酵母，包括：将活性的啤酒酵母斜面菌种接种到液体发酵培养基中，22°C -28°C发酵培 养15h-20h，发酵终止后离心过滤，将沉淀真空冷冻干燥即得富锗酵母。其中，所述的液体 发酵培养基由以下质量百分比的组分组成：葡萄糖1% -2%，麦芽汁2 % -5%，玉米淀粉 2% -4%，Ge020 · 005% -0· 01%和余量的水。即每lkg液体发酵培养基中二氧化锗（Ge02) 的用量为50mg-100mg。所述的啤酒酵母采用市售产品。
[0048] 甜菜渣，是制糖的副产品，是甜菜块根、块茎经过浸泡，压榨提取糖液后的残渣，故 残渣中不溶于水的物质大量存在，特别是粗纤维全部保留。所述的甜菜渣可选用市售产品， 例如购于甘肃武威黄羊镇糖厂的甜菜渣。
[0049] 茶籽饼也叫茶柏，是油茶籽经榨油后的渣饼，茶籽饼中含有茶皂素、蛋白质、天然 茶油等。茶籽饼蛋白质中含有18种氨基酸，其中苏氨酸、谷氨酸、组氨酸和精氨酸等含量较 为丰富。所述的茶籽饼可选用市售产品，例如购于衢州刘家香食品有限公司的茶籽饼。
[0050] 辣木（Moringa oleifera),又称鼓植树（Drumsticktree),为辣木科 (Moringaceae)辣木属（Moringa)热带落叶乔木。辣木起源于印度北部的热带、亚热带。据 研究报道，辣木富含胡萝卜素和维生素 C，钙、铁、钾含量特别高，必需氨基酸组成优于一般 蔬菜，是一种综合营养价值较高的木本蔬菜。辣木根中含有丰富的蛋白质，V。和多种微量元 素，本发明优选辣木的根。
[0051] 汉麻属于木兰纲（Magnoliopsida)荨麻目（Urticales)大麻科（Cannabinaceae) 大麻属（Cannabis)大麻种（Cannabis sativa L.)的一年生草本植物。研究表明，汉麻植 物中含有多达600余种化学物质，其主要活性物质则为各种酚类。汉麻韧皮部占植物总重 的30%左右，韧皮中纤维素含量超过70%。汉麻叶有单叶和复叶，且多为掌状复叶，叶序为 对生和互生，叶片绿色，上有短茸毛，容易脱落。叶子由叶柄支撑，叶柄长度一般在3cm-15cm 之间。生长旺盛时，叶子的质量占整个植株质量的24%-25% ;本发明选用汉麻的叶。
[0052] 柳珊瑚俗称海扇（sea fan)、海鞭（sea whip)或海羽（seaplume)等，属于腔肠动 物门珊瑚纲Anthozoa八放珊瑚亚纲Octocorallia动物，是一种常见的海洋生物。柳珊瑚 的化学成分主要包括萜类、留醇和生物碱三大类，此前还有脂肪酸等。柳珊瑚的生物活性研 究包括抗肿瘤（细胞毒）、抗炎、抗菌（金葡菌、结核杆菌等）、抗疟疾、抗污损等方面。
[0053] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0054] (1)本发明根据药用真菌桑黄的发酵培养条件和富锗特性，利用固体发酵培养状 态下真菌微生物在接近于自然状态下的生长、代谢产物丰富以及液体发酵培养状态下发酵 均匀、培养时间较短等各自的优点，并通过在固体培养基和液体培养基中添加有利于有机 锗和桑黄锗多糖代谢生成的汗麻叶酶解物、柳珊瑚降解物等外源添加物，同时创造性地将 桑黄在固体发酵阶段的培养产物作为外源添加物添加到液体发酵阶段中循环利用，先固体 发酵、后液体发酵，通过固体发酵和液体发酵两阶段的协同培养，大幅度提高了最终桑黄发 酵产物中有机锗、桑黄锗多糖的含量和活性。
[0055] 本发明方法可将锗元素转化为桑黄锗多糖生物大分子，显著提高了桑黄发酵产物 中有机锗含量（可达8. 84mg/g)，使桑黄在有效发挥桑黄多糖作用的前提下，还可以充分发 挥有机锗的作用。
[0056] (2)培养基中的富锗酵母在起到补充氮源的作用同时，还是锗的来源。传统的富 锗食药用菌菌丝体在形成过程中，锗的来源一般为无机态的二氧化锗，发酵时要将培养基 中的无机锗吸收后转化为有机锗，这个过程中锗不易为菌丝体所吸收。而富锗酵母携带的 锗元素是有机锗的形态，不含任何毒性，又更容易为菌丝体吸收，通过桑黄菌丝细胞内物质 的代谢，将底物中的锗结合到大分子上转化为有机锗多糖和锗蛋白，从而发挥锗和桑黄固 有的协同生理作用。
[0057] (3)本发明在桑黄固体发酵阶段以来源广泛、价廉的甜菜渣、茶籽饼为原料，一方 面使生产成本大幅降低，另一方面甜菜渣、茶籽饼中的有益成分有利于桑黄有机锗和锗多 糖的生成，是一种极具工业化前景的生产方法。

【具体实施方式】
[0058] 以下实施例对本发明作进一步详细描述。
[0059] 下面结合部分具体实施例对本
【发明内容】
进行进一步阐明，但本发明的内容并不仅 限于下面的实施例。
[0060] 桑黄（Phellinus linteus)ACCC51181菌种购于中国农业微生物菌种保藏管理中 心。
[0061] 金顶侧耳（Pleurotus citrinopileatus) CGMCC No. 5. 838购自中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心。
[0062] 甜菜渣购于甘肃武威黄羊镇糖厂，茶籽饼购于衢州刘家香食品有限公司。
[0063] 啤酒酵母购于安琪酵母股份有限公司。
[0064] 实施例1
[0065] 一、材料准备
[0066] 中性蛋白酶（酶活力为20. 0万U/g)、淀粉酶（酶活力为10. 0万U/g)、果胶酶（酶 活力为5. 0万U/g)、纤维素酶（酶活力为3. 0万U/g)，由广西庞博生物工程有限公司提供。
[0067] PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下灭菌 20min。
[0068] 外源添加物的制备：
[0069] a.汉麻叶酶解物的制备：将采摘的汉麻叶清洗、真空冷冻干燥后，称量100g加 500mL水，磨成浆液，95°C灭菌5min，使各种酶失活；调节浆液pH5. 0,加入由lg纤维素酶和 lg果胶酶构成的复合酶，在45°C进行酶解反应1. 0小时，在95°C下灭酶6分钟；然后调节 浆液PH6. 0,加入由1. 75g淀粉酶和1. 75g中性蛋白酶构成的复合酶，于55°C进行酶解反应 1. 5h，在95°C下灭酶5分钟，得到酶解液；离心酶解液，取上清液用截留分子量为lkDa的超 滤膜超滤，截留液真空浓缩后进行冷冻干燥，获得汉麻叶酶解物。
[0070] b.柳珊瑚降解物的制备：将金顶侧耳按15%的接种量接种在添加有柳珊瑚的培 养基中25°C培养10天后收获培养物，再将培养物过滤得滤液，进行高压灭菌，浓缩后真空 冷冻得到柳珊瑚降解物。
[0071] 添加有柳珊瑚的培养基组成为：柳珊瑚28g/L、葡萄糖15g/L、酵母粉3g/L、蛋白胨 4g/L、KH 2P04l. 5g/L、MgS040. 75g/L 和余量的水，pH 自然。
[0072] c.辣木提取物的制备：称取一定量的辣木根，粉碎过40目，先加占辣木根重量8 倍量质量百分浓度为70%的乙醇水溶液在80°C浸提1. 5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩 真空冷冻干燥后得提取物II ;上述醇提后的辣木根残渣加占辣木根重量8倍量水在95 °C下 浸提2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩真空冷冻干燥后得提取物III ;合并所述提取物II 和提取物III得辣木提取物。
[0073] d.富锗酵母的制备：将活性的啤酒酵母斜面菌种接种到液体发酵培养基中，25°C 发酵培养18h，发酵终止后离心过滤，将沉淀真空冷冻干燥即得富锗酵母，富锗酵母中锗含 量为700mg/kg。其中，液体发酵培养基由以下质量百分比的组分组成：葡萄糖2%，麦芽 汁2%，玉米淀粉4%，Ge0 20. 008%和余量的水；即每lkg液体发酵培养基中Ge02的用量为 80mg〇
[0074] 二、富锗桑黄发酵产物的制备
[0075] (1)桑黄液体种子液制备：将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行 活化培养，培养温度25°C,培养时间7天，然后取2cm 2大小的菌块（即活化后的桑黄菌种） 接种于添加有辣木提取物的液体种子培养基，1L添加有辣木提取物的液体种子培养基组成 为辣木提取物5% (辣木提取物与液体种子培养基的体积百分比）、葡萄糖10g/L、酵母粉 4g/L、蛋白胨3g/L、KH2P0 4lg/L、MgS040.5g/L和余量的水，pH自然；25°C培养4天，制备桑 黄液体菌种。
[0076] (2)桑黄固体发酵培养：将步骤（1)中的桑黄液体菌种按占固体培养基体积10% 的用量接入固体培养基中25°C培养10天后，将培养产物真空冷冻干燥粉碎后得富锗桑黄 固体培养物I。
[0077] 固体培养基由以下质量百分比的组分组成：Κ2ΗΡ040· 1%、MgS040 . 05%、水65% 和余量的营养物质；营养物质由以下质量百分比的组分组成：汗麻叶酶解物40%、甜菜渣 20 %、茶籽饼20 %和富锗酵母20 %。
[0078] 固体培养基的制备方法，包括：将K2HP04、MgS04和营养物质充分搅拌均匀，加水， 使固体培养基中水的质量百分比达到65%，pH值自然，得到固体培养基。
[0079] (3)桑黄液体发酵培养：将步骤（1)中的桑黄液体菌种按占液体培养基体积15% 的用量接入液体培养基中，25°C培养5天，得到富锗桑黄发酵产物。
[0080] 液体培养基由以下质量百分比的组分组成：富锗桑黄固体培养物I 3%、葡萄糖 1.5%、富锗酵母0.1%、柳珊瑚降解物0.1%、1(2册040.1%、1^0 40 . 05%和余量的水，？!1自 然。
[0081] 三、测定
[0082] (1)菌丝生物量的测定
[0083] 发酵后菌丝体经8层纱布过滤，菌丝体用蒸馏水冲洗3次，然后置60°C烘箱中烘干 至恒重,称重。
[0084] (2)锗多糖含量的测定
[0085] 称取适量菌丝体干粉，置于烧杯中，按料液比1:10(质量比）加入蒸馏水，90°C浸 提3h，提取两次，减压过滤收集滤液，50°C下减压浓缩，浓缩液加入4倍体积无水乙醇，隔夜 醇沉，3000r/min、20min离心后，沉淀即为粗多糖。将沉淀用蒸馈水定容至50mL，用苯酚-硫 酸法测定发酵液中多糖含量，重复测定3次求平均值，即锗多糖含量。
[0086] (3)锗的测定方法：参照GB/T5009. 151-2003食品中锗的测定方法。
[0087] (4)锗多糖对DPPH自由基清除能力的测定
[0088] 取2mL 5mg/mL待测样品于试管中，加入2mL 0· 2mmol/L的DPPH乙醇溶液（用质 量百分浓度95%乙醇水溶液配制），充分摇匀，室温静置35min，在517nm波长处测定吸光 值。以V。为对照，每组做3个重复，求其平均值。计算公式如下：
[0089] 清除率（％)=

【权利要求】
1. 一种富锗桑黄发酵产物的制备方法，其特征在于，包括步骤： (1) 桑黄液体种子液制备：将活化后的桑黄菌种接种于添加有辣木提取物的液体种子 培养基中培养3天-7天，制备桑黄液体菌种； (2) 桑黄固体发酵培养：将步骤（1)中的桑黄液体菌种按占固体培养基体积5% -20% 的用量接入固体培养基中培养5天-20天后，将培养产物真空冷冻干燥粉碎后得富锗桑黄 固体培养物I ;所述的固体培养基中含有汗麻叶酶解物、甜菜渣、茶籽饼和富锗酵母； (3) 桑黄液体发酵培养：将步骤（1)中的桑黄液体菌种按占液体培养基体积5% -20% 的用量接入液体培养基中，培养3天-8天，得到富锗桑黄发酵产物；所述的液体培养基中含 有富锗桑黄固体培养物I、富锗酵母和柳珊瑚降解物。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中，所述的辣木提取物的添 加量为液体种子培养基体积的2% -8%。
3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述的辣木提取物的制备方 法，包括：称取一定量的辣木，粉碎，先加占辣木重量8倍量-10倍量的质量百分浓度为 70%-80%的乙醇水溶液在801：-851：浸提1.511-211，过滤后得到上清液，上清液浓缩真 空冷冻干燥后得提取物II ;上述醇提后的辣木残渣加占辣木重量8倍量-10倍量的水在 95°C -10(TC下浸提2h-2. 5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩真空冷冻干燥后得提取物III ; 合并所述提取物II和提取物III得辣木提取物。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)和步骤（3)中，所述的富锗 酵母中锗含量为500mg/kg-900mg/kg。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)中，所述的固体培养基由以 下质量百分比的组分组成：K2HP0 40. 1% -0. 2%、MgS040. 05% -0. 1%、水40% -65%和余量 的营养物质；所述的营养物质由以下质量百分比的组分组成：汗麻叶酶解物40% -50%、甜 菜渣20% -30%、茶籽饼20% -30%和富锗酵母10% -20%。
6. 根据权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于，所述的汉麻叶酶解物的制备 方法，包括：将汉麻叶加水磨成浆液，灭酶；调节浆液PH4. 5-6. 5,加入由纤维素酶和果胶 酶构成的第一复合酶，在45°C -55°C进行酶解反应0. 5小时-1. 5小时，灭酶后调节浆液 pH5. 5-7. 0,加入由淀粉酶和中性蛋白酶构成的第二复合酶，于45°C -65°C进行酶解反应1 小时-1. 5小时，灭酶后离心，上清液经过滤、浓缩和干燥，得到汉麻叶酶解物。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的第一复合酶与汉麻叶的质量 比为1 :30-50 ;所述的第二复合酶与汉麻叶的质量比为1 :25-45。
8. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3)中，所述的液体培养基由 以下质量百分比的组分组成：富锗桑黄固体培养物I 2% -4%、葡萄糖1% -2%、富锗酵母 0· 04% -0· 4%、柳珊瑚降解物 0· 05% -0· 4%、Κ2ΗΡ040· 1% -0· 2%、MgS040. 05% -0· 1%和 余量的水。
9. 根据权利要求1或8所述的制备方法，其特征在于，所述的柳珊瑚降解物的制备方 法，包括：将金顶侧耳接种在添加有柳珊瑚的培养基中培养3天-15天，将培养物过滤，滤液 经灭菌、浓缩和真空冷冻干燥得到柳珊瑚降解物。
10. 根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的添加有柳珊瑚的培养基 组成为：柳珊瑚15g/L-35g/L、葡萄糖15g/L、酵母粉3g/L、蛋白胨4g/L、KH 2P041.5g/L、 MgS040. 75g/L和余量的水。
【文档编号】C12P19/04GK104232727SQ201410458820
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月11日 优先权日:2014年9月11日
【发明者】程俊文, 贺亮, 魏海龙, 胡传久, 付立忠, 李海波, 邹景泉 申请人:浙江省林业科学研究院