植物乳杆菌和含有该植物乳杆菌的饲料预混剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种植物乳杆菌和含有该植物乳杆菌的饲料预混剂及其制备方法，该植物乳杆菌Lactobacillus plantarum的保藏编号为：CGMCC No.9642。本发明提供的饲料预混剂以乳清粉、蔗糖、马齿苋提取物、土茯苓提取物、黄芪提取物和地锦草提取物复合而成的复合培养液作为培养基，进行厌氧发酵，制成饲料预混剂。该饲料预混剂含有丰富的活性多糖、黄酮、活菌体及其代谢产物，将其作为对虾养殖的微生态饲料预混剂，活菌体及其代谢乳酸可抑制肠道病原菌生长，活性多糖、黄酮、活菌体的代谢产物更容易被虾吸收，可以有效发挥活菌体与活性多糖、代谢产物的多重效应。
CGMCC No. 9642
20140905
【专利说明】植物乳杆菌和含有该植物乳杆菌的饲料预混剂及其制备方 法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物应用和饲料调制加工领域，特别是涉及一种用于预防治疗肠道 疾病及免疫疾病的植物乳杆菌和含有该植物乳杆菌的饲料预混剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 2005年我国的南美白对虾淡水、海水总养殖面积150万亩，至2010年即超过300 万亩，年产量90-100万吨。至2012年开始南美白对虾养殖不再是南方四省的专业；向北方 延伸到江浙、山东、河北沿海地区迅速发展到150多万亩。2011年以来，南美白对虾养殖的 病害死亡率越来越高，大多数地区养成率在20%以下；至2011年上半年在海南、广东和广 西等省份的产量比同期下降了 80%以上，给白对虾养殖业带来巨大损失。其主要原因是由 于水体生态恶化引发的肠炎、白便、空肠空胃、厌食游塘等肠道病害越来越多。因对虾的免 疫细胞产生于肠道，故肠道病害严重影响免疫细胞活力，导致对虾的死亡率非常高。
【发明内容】
[0003] 有鉴于此，本发明的目的在于提出一株植物乳杆菌和含有该植物乳杆菌的饲料预 混剂及其制备方法，以降低对虾的死亡率。
[0004] 基于上述目的，本发明提供的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)，所述菌株 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西 路1号院3号中国科学院微生物研宄所，保藏登记入册的编号为CGMCC No. 9642,保藏日期 为2014年9月5日。
[0005] 本发明还提供所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum在制备饲料预混剂中的 应用。
[0006] 本发明还提供一种饲料预混剂的制备方法，所述饲料预混剂制备方法包括：以所 述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum为发酵菌种，以乳清粉、鹿糖、马齿苋提取物、土茯 苓提取物、黄芪提取物和地锦草提取物复合而成的复合培养液作为培养基，进行厌氧发酵， 制成活菌含量彡3X10 8CFU/ml的饲料预混剂。
[0007] 较佳地，所述饲料预混剂制备方法包括以下步骤：
[0008] 1)将马齿苋、土茯苓、黄芪和地锦草按照1?2:1?2:1?2:1?4的重量比投入 到水中，经蒸煮得到提取液；
[0009] 2)将乳清粉和蔗糖加入到所述提取液中，调节提取液的pH至6. 4?7. 5,经灭菌、 降温后，接入所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum菌种，厌氧条件下发酵，即得到所 述含有植物乳杆菌Lactobacillus plantarum的饲料预混剂。
[0010] 优选地，接种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum后，所述厌氧发酵的温度为 30°C?35°C，厌氧发酵时间为26?35小时，S卩得到植物乳杆菌Lactobacillus plantarum 有效活菌含量为3X 108?8X 10 9CFU/ml的饲料预混剂。
[0011] 可选地，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum的接种量为5%?10%。
[0012] 本发明还提供一种饲料预混剂，所述饲料预混剂根据上述饲料预混剂的制备方法 制备得到。
[0013] 较佳地，所述饲料预混剂中植物乳杆菌Lactobacillus plantarum有效活菌含量 为 3X108?8X109CFU/ml〇
[0014] 本发明还提供上述饲料预混剂的应用，将所述饲料预混剂按照饲料质量的2%? 5%加入到饲料中，并在投喂前预混。
[0015] 较佳地，提前1?2小时在密封容器中预混所述饲料预混剂和饲料，预混后使饲料 预混剂于20°C?30°C条件下厌氧活化。
[0016] 从上面所述可以看出，本发明提供的饲料预混剂以乳清粉、蔗糖、马齿苋提取物、 土茯苓提取物、黄芪提取物和地锦草提取物复合而成的复合培养液作为培养基，进行厌氧 发酵，制成活菌含量多3X 108CFU/ml的饲料预混剂。该饲料预混剂含有丰富的活性多糖、黄 酮、活菌体及其代谢产物，将其作为对虾养殖的微生态饲料预混剂，活菌体及其代谢乳酸可 抑制肠道病原菌生长，活性多糖、黄酮、活菌体的代谢产物（氨基酸、维生素、微量元素等） 更容易被虾吸收，可以有效发挥活菌体与活性多糖、代谢产物的多重效应。
【具体实施方式】
[0017] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发 明进一步详细说明。
[0018] 实施例1植物乳杆菌Lactobacillus plantarum的分离和鉴定
[0019] 所述植物乳杆菌BW2013菌株于2014年9月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No. 9642,保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编：100101。
[0020] 本菌种分离于北京市郊区蔬菜种植基地，采用MRS培养基，平板涂布法由茄子皮 分离而得，其生长温度20?38°C，最适宜生长温度35°C。适宜生长pH4. 0?7. 5,最适宜生 长pH6. 5,菌种保藏采用MRS培养基。经中国科学院环境生物技术重点实验室鉴定为植物乳 杆菌（Lactobacillus plantarum) 〇
[0021] 实施例2含有植物乳杆菌Lactobacillus plantarum的饲料预混剂的制备方法
[0022] 以所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum为发酵菌种，以乳清粉、鹿糖、马齿 苋提取物、土茯苓提取物、黄芪提取物和地锦草提取物复合而成的复合培养液作为培养基， 进行厌氧发酵，制成活菌含量多3X10 8CFU/ml的饲料预混剂。
[0023] 作为本发明的一个实施例，所述含有植物乳杆菌Lactobacillus plantarum的饲 料预混剂的制备方法如下（以1000L为例）：
[0024] (1)将马齿苋10kg、土茯苓10kg、黄芪10kg和地锦草20kg投放到1000L中药提取 罐内，第一次加水600L，浸泡2h后，一边以50?60转/分钟速度搅拌，一边加热升温，升温 至100°C搅拌lh ;然后降温至40°C?50°C，过滤，收集滤液，约400L。第二次再加水350L ; 升温至100°C搅拌40min ;降温至40°C?50°C，过滤，收集过滤液，约300L。第三次再加水 350L ;升温至100°C搅拌40min ;降温至40°C?50°C，过滤，收集过滤液，约300L，三次共收 集中药提取液约1000L。
[0025] (2)取磷酸二氢钾600g、磷酸氢二钾300g、氯化钙30g、硫酸铵300g、硫酸镁120g、 蔗糖10kg和乳清粉15kg加入到上述1000L中药提取液中，搅拌均匀。用12N氢氧化钠调 溶液pH至6. 8?7. 5 ;然后于121 °C灭菌30min，再降温至30°C?35°C接种所述植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum，接种量为 7. 5%?10%，恒温 30°C?35°C，厌氧发酵 28 ?30h 后，得到植物乳杆菌活菌含量为3 X 108?7. 5 X 10 9CFU/ml的发酵液，即所述含有植物乳杆 菌Lactobacillus plantarum的饲料预混剂。该发酵液中还含有多糖和黄酮。
[0026] 其中，所述马齿苋、土茯苓、黄芪和地锦草均为无腐烂、无虫蛀、无霉变的优质干 品。
[0027] 作为本发明的又一个实施例，所述含有植物乳杆菌Lactobacillus plantarum的 饲料预混剂的制备方法如下（以1000L为例）：
[0028] (1)将马齿苋12kg、土茯苓13kg、黄芪9kg和地锦草18kg投放到1000L中药提取 罐内，第一次加水600L，浸泡2h后，一边以50?60转/分钟速度搅拌，一边加热升温，升温 至100°C搅拌lh ;然后降温至40°C?50°C，过滤，收集滤液，约400L。第二次再加水350L ; 升温至100°C搅拌40min ;降温至40°C?50°C，过滤，收集过滤液，约300L。第三次再加水 350L ;升温至100°C搅拌40min ;降温至40°C?50°C，过滤，收集过滤液，约300L，三次共收 集中药提取液约1000L。
[0029] (2)取磷酸二氢钾650g、磷酸氢二钾310g、氯化钙25g、硫酸铵300g、硫酸镁110g、 蔗糖9. 5kg和乳清粉18kg加入到上述1000L中药提取液中，搅拌均匀。用10N氢氧化钠调 溶液pH至6. 4?7. 2 ;然后于118°C灭菌40min，再降温至30°C?35°C接种所述植物乳杆 菌Lactobacillus plantarum，接种量为5%?8%，恒温30°C?35°C，厌氧发酵26?30h 后，得到植物乳杆菌活菌含量为8 X 108?8 X 10 9CFU/ml的发酵液，即所述含有植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum的饲料预混剂。该发酵液中还含有多糖和黄酮。
[0030] 作为本发明的又一个实施例，所述含有植物乳杆菌Lactobacillus plantarum的 饲料预混剂的制备方法如下（以1000L为例）：
[0031] (1)将马齿苋15kg、土茯苓8kg、黄芪13. 5kg和地锦草32kg投放到1000L中药提 取罐内，第一次加水600L，浸泡2h后，一边以50?60转/分钟速度搅拌，一边加热升温，升 温至100°C搅拌lh ;然后降温至40°C?50°C，过滤，收集滤液，约400L。第二次再加水350L ; 升温至100°C搅拌40min ;降温至40°C?50°C，过滤，收集过滤液，约300L。第三次再加水 350L ;升温至100°C搅拌40min ;降温至40°C?50°C，过滤，收集过滤液，约300L，三次共收 集中药提取液约1000L。
[0032] (2)取磷酸二氢钾600g、磷酸氢二钾300g、氯化钙30g、硫酸铵300g、硫酸镁120g、 蔗糖10kg和乳清粉15kg加入到上述1000L中药提取液中，搅拌均匀。用12N氢氧化钠调溶 液pH至6. 8?7. 15 ;然后于125°C灭菌30min，再降温至30°C?35°C接种所述植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum，接种量为 5. 8%?9. 6%，恒温 30°C?35°C，厌氧发酵 27. 6 ? 33h后，得到植物乳杆菌活菌含量为3X 108?8X 10 9CFU/ml的发酵液，即所述含有植物乳 杆菌Lactobacillus plantarum的饲料预混剂。该发酵液中还含有多糖和黄酮。
[0033] 实施例3所述饲料预混剂的用途
[0034] 所述饲料预混剂的用途包括：
[0035] (1)将所述饲料预混剂按照饲料质量的2%?5%加入到饲料中，并在投喂前预 混。可以根据虾苗大小，在投饵料前采用不同添加量的饲料预混剂预混到对虾饲料中进行 喂养。
[0036] (2)提前1?2小时在干净的塑料袋内预混饲料预混剂和饲料，预混后扎紧塑料袋 口使饲料预混剂厌氧活化，并使饲料预混剂中的有效物质（例如活性多糖、黄酮、活菌体以 及其代谢产物等）充分渗透到饲料中。根据养殖需要可以每日添加所述饲料预混剂1次或 者多次。
[0037] (3)投喂时，将拌混均匀并经厌氧活化的饲料直接投放到虾塘的料台上。
[0038] 作为本发明的一个实施例，将所述饲料预混剂按照饲料质量的2%?3. 5%加入 到饲料中，并在投喂前1?1. 5小时在密封容器中预混所述饲料预混剂和饲料，预混后使饲 料预混剂于20°C?27°C条件下厌氧活化。投喂时，将拌混均匀并经厌氧活化的饲料直接投 放到虾塘的料台上。
[0039] 作为本发明的一个实施例，将所述饲料预混剂按照饲料质量的3. 3%?5%加入 到饲料中，并在投喂前1. 4?2小时在密封容器中预混所述饲料预混剂和饲料，预混后使饲 料预混剂于24°C?30°C条件下厌氧活化。投喂时，将拌混均匀并经厌氧活化的饲料直接投 放到虾塘的料台上。
[0040] 实施例4所述饲料预混剂的喂养实验
[0041] (1)南美白对虾99天喂养实验
[0042] 地点：广东省番禺区海鸥岛陈桂明虾场，低盐度土塘半精养。
[0043] 实验方法：采用同批次虾苗，同日投放。选用正大饲料，设定实验1按1. 5%、实验 2按2. 0%、实验3按2. 5%拌喂所述含有植物乳杆菌Lactobacillus plantarum的饲料预 混剂，每天早晚拌喂两次。对照组预混同等量的温开水。每天从排底污管套网中收集死虾 计数。
[0044] 养殖水体平均盐度1. 0/1000平均水温28. 2°C时间：2013年4月2日-7月5日
【权利要求】
1. 一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，其特征在于，所述菌株保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中 国科学院微生物研宄所，保藏登记入册的编号为CGMCC No. 9642,保藏日期为2014年9月5 曰。
2. 根据权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum在制备饲料预混剂中 的应用。
3. -种饲料预混剂的制备方法，其特征在于，包括：以所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum为发酵菌种，以乳清粉、蔗糖、马齿苋提取物、土茯苓提取物、黄芪提取物和地锦 草提取物复合而成的复合培养液作为培养基，进行厌氧发酵，制成活菌含量多3X108CFU/ ml的饲料预混剂。
4. 根据权利要求3所述的饲料预混剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将马齿苋、土茯苓、黄芪和地锦草按照1?2:1?2:1?2:1?4的重量比投入到水 中，经蒸煮得到提取液； 2) 将乳清粉和蔗糖加入到所述提取液中，调节提取液的pH至6. 4?7. 5,经灭菌、降温 后，接入所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum菌种，厌氧条件下发酵，即得到所述含 有植物乳杆菌Lactobacillus plantarum的饲料预混剂。
5. 根据权利要求4所述的饲料预混剂的制备方法，其特征在于，接种植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum后，所述厌氧发酵的温度为30 °C?35 °C，厌氧发酵时间为 26?35小时，S卩得到植物乳杆菌Lactobacillus plantarum有效活菌含量为3X 108? 8X109CFU/ml的饲料预混剂。
6. 根据权利要求4所述的饲料预混剂的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum 的接种量为 5%?10%。
7. -种饲料预混剂，其特征在于，所述饲料预混剂根据权利要求1?6中任意一项所述 的饲料预混剂的制备方法制备得到。
8. 根据权利要求7所述的饲料预混剂，其特征在于，所述饲料预混剂中植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum 有效活菌含量为 3X 108?8X 10 9CFU/ml〇
9. 根据权利要求7或8所述的饲料预混剂的应用，其特征在于，将所述饲料预混剂按照 饲料质量的2%?5%加入到饲料中，并在投喂前预混。
10. 根据权利要求7或8所述的饲料预混剂的应用，其特征在于，提前1?2小时在密 封容器中预混所述饲料预混剂和饲料，预混后使饲料预混剂于20°C?30°C条件下厌氧活 化。
【文档编号】C12N1/20GK104450582SQ201410758159
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】杨卫东, 任塞北, 李艳青, 陈力 申请人:北京世纪新探生物科技有限公司