专利名称：一种兽用高效复合微生态预混剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种微生态预混剂的制备方法，更具体地说涉及一种兽用高效复合微生态预混剂的制备方法，属于微生态制剂饲料添加剂技术领域。
背景技术：
兽用微生态预混剂是一种天然、绿色、安全的饲料添加剂，由于其具有无毒、无害、无残留、无污染等优点，同时具有防病治病，提高饲料利用率，提高动物生产性能等作用，而且能克服抗生素所产生的菌群失调、二重感染和耐药性等，在动物源性食品安全问题日益突出的情况下越来越得到广泛研究和应用。目前，国内市场上的兽用微生态预混剂产品主要存在以下不足:(1)活菌含量低，近年大量研究表明，如果一种菌在动物盲肠内容物中的浓度低于IO7个/g，则该菌产生的酶及代谢产物不足以影响宿主，难以满足治疗需要；(2)对胃酸和胆汁稳定性差，致使只有少数菌株进入肠道后仍具有活性，达不到发挥作用所需的活菌数量；(3)体内增殖速度差；不耐高铜，高温加工和贮存过程中不稳定，保存期短；(5)复合预混剂少，仅适应某一特定动物。由此影响了微生态预混剂在动物上的应用效果，限制了微生态预混剂的应用范围。
发明内容
本发明的目的在于提供一种活菌含量高、耐胃酸和胆汁、对高铜和高温有耐受性、体内增殖速度稳定、保存期长的兽用高效微生态预混剂及其制备方法。本发明的目的是通过下述技术方案予以实现:
一种兽用高效复合微生态预混剂的制备方法，包括以下步骤:
1)菌种优化筛选
将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母分别进行菌株耐酸、耐胆汁盐、耐温、耐高铜驯化；
所述耐酸驯化是指φΗ 3.2-3.6的条件下筛选出耐酸菌株；
所述耐胆盐驯化是指:在培养基中加入胆盐后，再对筛选出的耐酸菌株进行驯化；
所述耐温驯化是指:将经耐胆盐驯化后的菌体培养物接种至LB、TB液体培养基中，然后在40-60°C水浴中加热，随后继续将培养物置于37°C培养；
所述耐高铜驯化是指:将经耐温驯化后的菌体在含200-250mg/kg铜的MRS肉汤培养基中进行生长；
2)选取复壮菌种
选取地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的第四代活化菌种作为复壮菌种，产朊假丝酵母、酿酒酵母选第三代活化菌种作为复壮菌种；
3)摇瓶培养
所述四种复壮菌种再分别采用下列相应的培养基，在摇瓶中进行培养:
①地衣芽孢杆菌培养:培养基组成为葡萄糖18-20g/L、豆饼粉60-70g/L、玉米浆6.5-7.0g/L、蛋白胨 1.3-1.5g/L，pH 值为 7.2-7.5，培养温度为 33-37°C ；
②枯草芽孢杆菌培养:培养基组成为葡萄糖32-35g/L、蛋白胨7.5-8.3g/L、酵母膏
4.5-5.0g/L、KH2PO4 3.0-3.5g/L、CaCO3 2.0-2.5g/L，pH 值为 6.5-7.1，培养温度为 32-34°C ；
③产朊假丝酵母培养:培养基组成为葡萄糖35-40g/L、蛋白胨10-12g/L、KH2PO4
1.8-2.0g/L、MgSO4.7H20 0.25-0.30g/L，培养温度为 25-28°C ；
④酿酒酵母培养:培养基组成为酪蛋白胨13_16g/L、酵母粉12-15g/L、葡萄糖25_30g/UKH2PO4 2.2-2.4g/L、K2HPO4.3H20 15-16.34g/L，培养温度为 26-30°C ；
4)30L发酵罐培养
依照步骤3)的培养条件，将经摇瓶培养后的菌种分别放入30L发酵罐中扩大培养；
5)菌体喷雾干燥
分别连续离心收集菌体，将菌泥用保护液和载体调配至固形物浓度3-5%，再于28-35°C的温度下进行喷雾干燥，分别收集单一菌粉；
所述保护液由脱脂乳粉、半胱氨酸、谷氨酸钠组成，其含量分别为:脱脂乳粉80-85g/L、半胱氨酸 0.04-0.05mol/L、谷氨酸钠 25_30g/L ；
所述载体选自80-100目的玉米芯粉或80-100目的球磨糠粉,或者是二者以任意重量比的混合物；
所述载体的用量按如下方法计算:在步骤4)的发酵罐培养结束时，先按稀释平板计数法分别测量上述四种菌液浓度(CFU/L)，再按四种单一菌粉中菌浓规格要求(CFU/g)，准确计算出载体用量，以保证并控制菌粉中活菌浓度；
6)配制复合菌粉
按复合菌粉中含枯草芽孢杆菌20.0-25.0亿CFU/g、地衣芽孢杆菌18.0-20.0亿CFU/g、酿酒酵母12.0-15.0亿CFU/g、产朊假丝酵母15.0-20.0亿CFU/g、总菌数彡65亿CFU/g的标准，计算并称取四种单一菌粉和载体，混合均匀即制得微生态预混剂产品。本发明的兽用高效复合微生态预混剂的制备方法与现有技术相比具有以下优
点
1)科学选取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母四种微生物，并进行优化筛选和驯化，使其具有耐酸、耐盐、耐温及耐胆汁的优良特性；
2)本发明的兽用高效复合微生态预混剂活菌含量高，总菌浓度>65亿CFU/g ;对高铜有耐受:性，在动物词料含有闻铜的情况下仍能发 车其防病治病，提闻词料利用率，提闻动物生产性能等作用；
3)本发明的兽用高效复合微生态预混剂耐胃酸、胆盐和高温，进入肠道后仍具较强活性，在饲料造粒加工后稳定性较好，在常温保存条件下活性稳定；
4)本发明的兽用高效复合微生态预混剂可显著降低大肠杆菌、沙门氏菌数量，抑制病原菌，减少蛋白质向胺及氨的转化，使肠内粪便和血液中氨浓度下降，从而降低粪便臭味，改善舍内空气质量，减少机体应激，降低对环境的污染；
5)本发明的兽用高效复合微生态预混剂在菌体干燥前加入保护剂和载体，并采用低温喷雾干燥，从而大大降低了成本，探明了培养条件、收获期、冷冻速率、残留水分及复水条件对干燥菌体存活率的影响，保证了产品中菌体的活性，所生长的菌粉易于包装运输。
具体实施例方式实施例1
一种兽用高效复合微生态预混剂的制备方法，包括以下步骤:
1)菌种优化筛选
将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母分别进行菌株耐酸、耐胆汁盐、耐温、耐高铜驯化；
所述耐酸驯化是指φΗ 3.2-3.6的条件下筛选出耐酸菌株；
所述耐胆盐驯化是指:在培养基中加入胆盐后，再对筛选出的耐酸菌株进行驯化；
所述耐温驯化是指:将经耐胆盐驯化后的菌体培养物接种至LB、TB液体培养基中，然后在40-60°C水浴中加热，随后继续将培养物置于37°C培养；
所述耐高铜驯化是指:将经耐温驯化后的菌体在含200-250mg/kg铜的MRS肉汤培养基中进行生长；
2)选取复壮菌种
选取地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的第四代活化菌种作为复壮菌种，产朊假丝酵母、酿酒酵母选第三代活化菌种作为复壮菌种；
3)摇瓶培养
所述四种复壮菌种再分别采用下列相应的培养基，在摇瓶中进行培养:
①地衣芽孢杆菌培养:培养基组成为葡萄糖20g/L、豆饼粉70g/L、玉米浆7.0g/L、蛋白胨1.5g/L，pH值为7.5，培养温度为37°C ；
②枯草芽孢杆菌培养:培养基组成为葡萄糖35g/L、蛋白胨8.3g/L、酵母膏5.0g/L、KH2PO4 3.5g/L、碳酸钙 2.5g/L，pH 值为 7.1，培养温度为 34°C ；
③产朊假丝酵母培养:培养基组成为葡萄糖40g/L、蛋白胨12g/L、KH2PO42.0g/L、MgS04.7H20 0.30g/L ;培养温度为 25-28。。。④酿酒酵母培养:培养基组成为酪蛋白胨16g/L、酵母粉15g/L、葡萄糖30g/L、KH2PO4 2.4g/L、K2HPO4 _3H20 16.34g/L，培养温度为 26-30°C ；
4)30L发酵罐培养
依照步骤3)的培养条件，将经摇瓶培养后的菌种分别放入30L发酵罐中扩大培养；
5)菌体喷雾干燥
分别连续离心收集菌体，将菌泥用保护液和载体调配至固形物浓度4%，再于33°C的温度下进行喷雾干燥，分别收集单一菌粉；
其中，所述的保护液由脱脂乳粉、半胱氨酸、谷氨酸钠组成，其浓度为脱脂乳粉80g/L、半胱氨0.04mol/L、谷氨酸钠25g/L ；
所述载体选自80-100目的球磨糠粉。所述载体的用量按如下方法计算:在步骤4)的发酵罐培养结束时，先按稀释平板计数法分别测量上述四种菌液浓度(CFU/L)，再按四种单一菌粉中菌浓规格要求(CFU/g)，准确计算出载体用量，以保证并控制菌粉中活菌浓度；
6)配制复合菌粉
按复合菌粉中含枯草芽孢杆菌25.0亿CFU/g、地衣芽孢杆菌20.0亿CFU/g、酿酒酵母15.0亿CFU/g、产朊假丝酵母20.0亿CFU/g的标准，计算并称取四种单一菌粉和载体，混合均匀即制得微生态预混剂产品。该微生态预混剂产品含枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和产朊假丝酵母总菌数为80亿CFU/g。
实施例2
一种兽用高效复合微生态预混剂的制备方法，包括以下步骤:
1)菌种优化筛选
将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母分别进行菌株耐酸、耐胆汁盐、耐温、耐高铜驯化；
所述耐酸驯化是指:PH 3.2-3.6的条件下筛选出耐酸菌株；
所述耐胆盐驯化是指:在培养基中加入胆盐后，再对筛选出的耐酸菌株进行驯化；
所述耐温驯化是指:将经耐胆盐驯化后的菌体培养物接种至LB、TB液体培养基中，然后在40-60°C水浴中加热，随后继续将培养物置于37°C培养；
所述耐高铜驯化是指:将经耐温驯化后的菌体在含200-250mg/kg铜的MRS肉汤培养基中进行生长；
2)选取复壮菌种
选取地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的第四代活化菌种作为复壮菌种，产朊假丝酵母、酿酒酵母选第三代活化菌种作为复壮菌种；
3)摇瓶培养
所述四种复壮菌种再分别采用下列相应的培养基，在摇瓶中进行培养:
①地衣芽孢杆菌培养:培养基组成为葡萄糖18g/L、豆饼粉60g/L、玉米浆6.5g/L、蛋白胨1.3g/L，pH值为7.2，培养温度为350C ；
②枯草芽孢杆菌培养:培养基组成为葡萄糖32g/L、蛋白胨8.0g/L、酵母膏4.5g/L、KH2PO4 3.0g/L、CaCO3 2.0g/L, pH 值为 7.0，培养温度为 32°C ；
③产朊假丝酵母培养:培养基组成为葡萄糖35g/L、蛋白胨10g/L、KH2PO41.8g/L、MgSO4.7H20 0.25g/L，培养温度为 25-28°C ；
④酿酒酵母培养:培养基组成为酪蛋白胨13g/L、酵母粉12g/L、葡萄糖25g/L、KH2PO4
2.2g/L、K2HPO4.3H20 15g/L，培养温度为 26-30°C ；
4)30L发酵罐培养
依照步骤3)的培养条件，将经摇瓶培养后的菌种分别放入30L发酵罐中扩大培养；
5)菌体喷雾干燥
分别连续离心收集菌体，将菌泥用保护液和载体调配至固形物浓度3%，再于33°C的温度下进行喷雾干燥，分别收集单一菌粉；
其中，所述的保护液由脱脂乳粉、半胱氨酸、谷氨酸钠组成，其浓度为脱脂乳粉85g/L、半胱氨0.05mol/L、谷氨酸钠30g/L ；
所述载体选自80-100目的玉米芯粉。所述载体的用量按如下方法计算:在步骤4)的发酵罐培养结束时，先按稀释平板计数法分别测量上述四种菌液浓度(CFU/L)，再按四种单一菌粉中菌浓规格要求(CFU/g)，准确计算出载体用量，以保证并控制菌粉中活菌浓度；
6)配制复合菌粉
按复合菌粉中含枯草芽孢杆菌20.0亿CFU/g、地衣芽孢杆菌18.0亿CFU/g、酿酒酵母12.0亿CFU/g、产朊假丝酵母15.0亿CFU/g的标准，计算并称取四种单一菌粉和载体，混合均匀即制得微生态预混剂产品。该微生态预混剂产品含枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和产朊假丝酵母总菌数为65亿CFU/g。实施例3
一种兽用高效复合微生态预混剂的制备方法，包括以下步骤:
1)菌种优化筛选
将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母分别进行菌株耐酸、耐胆汁盐、耐温、耐高铜驯化；
所述耐酸驯化是指φΗ 3.2-3.6的条件下筛选出耐酸菌株；
所述耐胆盐驯化是指:在培养基中加入胆盐后，再对筛选出的耐酸菌株进行驯化；
所述耐温驯化是指:将经耐胆盐驯化后的菌体培养物接种至LB、TB液体培养基中，然后在40-60°C水浴中加热，随后继续将培养物置于37°C培养；
所述耐高铜驯化是指:将经耐温驯化后的菌体在含200-250mg/kg铜的MRS肉汤培养基中进行生长；
2)选取复壮菌种
选取地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的第四代活化菌种作为复壮菌种，产朊假丝酵母、酿酒酵母选第三代活化菌种作为复壮菌种；
3)摇瓶培养
所述四种复壮菌种再分别采用下列相应的培养基，在摇瓶中进行培养:
①地衣芽孢杆菌培养:培养基组成为葡萄糖19g/L、豆饼粉65g/L、玉米浆6.8g/L、蛋白胨1.4g/L，pH值为7.4，培养温度为330C ；
②枯草芽孢杆菌培养:培养基组成为葡萄糖34g/L、蛋白胨7.5g/L、酵母膏4.8g/L、KH2PO4 3.2g/L、碳酸钙 2.3g/L，pH 值为 6.5，培养温度为 33°C ；
③产朊假丝酵母培养:培养基组成为葡萄糖38g/L、蛋白胨llg/L、KH2PO41.9g/L、MgS04.7H20 0.28g/L ;培养温度为 25-28。。。④酿酒酵母培养:培养基组成为酪蛋白胨15g/L、酵母粉13g/L、葡萄糖28g/L、KH2PO4 2.3g/L、K2HPO4 _3H20 15.5g/L，培养温度为 26-30°C ；
4)30L发酵罐培养
依照步骤3)的培养条件，将经摇瓶培养后的菌种分别放入30L发酵罐中扩大培养；
5)菌体喷雾干燥
分别连续离心收集菌体，将菌泥用保护液和载体调配至固形物浓度5%，再于33°C的温度下进行喷雾干燥，分别收集单一菌粉；
其中，所述的保护液由脱脂乳粉、半胱氨酸、谷氨酸钠组成，其浓度为脱脂乳粉83g/L、半胱氨0.045mol/L、谷氨酸钠28g/L ；
所述载体选自80-100目的玉米芯粉与80-100目的球磨糠粉按2:1重量比的混合物。所述载体的用量按如下方法计算:在步骤4)的发酵罐培养结束时，先按稀释平板计数法分别测量上述四种菌液浓度(CFU/L)，再按四种单一菌粉中菌浓规格要求(CFU/g)，准确计算出载体用量，以保证并控制菌粉中活菌浓度；
6)配制复合菌粉 按复合菌粉中含枯草芽孢杆菌23.0亿CFU/g、地衣芽孢杆菌19.0亿CFU/g、酿酒酵母13.0亿CFU/g、产朊假丝酵母18.0亿CFU/g的标准，计算并称取四种单一菌粉和载体，混合均匀即制得微生态预混剂产品。该微生态预混剂产品含枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和产朊假丝酵母总菌数为73亿CFU/g。
权利要求
1.一种兽用高效复合微生态预混剂的制备方法，包括以下步骤: 1)菌种优化筛选 将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母分别进行菌株耐酸、耐胆汁盐、耐温、耐高铜驯化； 2)选取复壮菌种 选取地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的第四代活化菌种作为复壮菌种，产朊假丝酵母、酿酒酵母选第三代活化菌种作为复壮菌种； 3)摇瓶培养 所述四种复壮菌种再分别采用下列相应的培养基，在摇瓶中进行培养: ①地衣芽孢杆菌培养:培养基组成为葡萄糖18-20g/L、豆饼粉60-70g/L、玉米浆6.5-7.0g/L、蛋白胨 1.3-1.5g/L，pH 值为 7.2-7.5，培养温度为 33-37°C ； ②枯草芽孢杆菌培养:培养基组成为葡萄糖32-35g/L、蛋白胨7.5-8.3g/L、酵母膏4.5-5.0g/L、KH2PO4 3.0-3.5g/L、CaCO3 2.0-2.5g/L，pH 值为 6.5-7.1，培养温度为 32-34°C ； ③产朊假丝酵母培养:培养基组成为葡萄糖35-40g/L、蛋白胨10-12g/L、KH2PO41.8-2.0g/L、MgSO4.7H20 0.25-0.30g/L，培养温度为 25-28°C ； ④酿酒酵母培养:培养基组成为酪蛋白胨13_16g/L、酵母粉12-15g/L、葡萄糖25_30g/UKH2PO4 2.2-2.4g/L、 K2HPO4.3H20 15-16.34g/L，培养温度为 26-30°C ； 4)30L发酵罐培养 依照步骤3)的培养条件，将经摇瓶培养后的菌种分别放入30L发酵罐中扩大培养； 5)菌体喷雾干燥 分别连续离心收集菌体，将菌泥用保护液和载体调配至固形物浓度3-5%，再于28-35°C的温度下进行喷雾干燥，分别收集单一菌粉； 6)配制复合菌粉 按复合菌粉中含枯草芽孢杆菌20.0-25.0亿CFU/g、地衣芽孢杆菌18.0-20.0亿CFU/g、酿酒酵母12.0-15.0亿CFU/g、产朊假丝酵母15.0-20.0亿CFU/g、总菌数彡65亿CFU/g的标准，计算并称取四种单一菌粉和载体，混合均匀即制得微生态预混剂产品。
2.如权利要求1所述兽用高效复合微生态预混剂的制备方法，其特征在于:所述耐酸驯化是指:PH 3.2-3.6的条件下筛选出耐酸菌株。
3.如权利要求1所述兽用高效复合微生态预混剂的制备方法，其特征在于:所述耐胆盐驯化是指:在培养基中加入胆盐后，再对筛选出的耐酸菌株进行驯化。
4.如权利要求1所述兽用高效复合微生态预混剂的制备方法，其特征在于:所述耐温驯化是指:将经耐胆盐驯化后的菌体培养物接种至LB、TB液体培养基中，然后在40-60°C水浴中加热，随后继续将培养物置于37°C培养。
5.如权利要求1所述兽用高效复合微生态预混剂的制备方法，其特征在于:所述耐高铜驯化是指:将经耐温驯化后的菌体在含200-250mg/kg铜的MRS肉汤培养基中进行生长。
6.如权利要求1所述兽用高效复合微生态预混剂的制备方法，其特征在于:所述保护液由脱脂乳粉、半胱氨酸、谷氨酸钠组成，其含量分别为:脱脂乳粉80-85g/L、半胱氨酸0.04-0.05mol/L、谷氨酸钠 25_30g/L。
7.如权利要求1所述兽用高效复合微生态预混剂的制备方法，其特征在于:所述载体选自80-100目的玉米芯粉或80-100目的球磨糠粉,或者是二者以任意重量比的混合物。
8.如权利要求1或7所述兽用高效复合微生态预混剂的制备方法，其特征在于:所述载体的用量按如下方法计算:在步骤4)的发酵罐培养结束时，先按稀释平板计数法分别测量上述四种菌液浓度(CFU/L)，再按四种单一菌粉中菌浓规格要求(CFU/g)，准确计算出载体用量，以保证并控制菌粉 中活菌浓度。
全文摘要
本发明涉及一种兽用高效复合微生态预混剂的制备方法，属于微生态制剂饲料添加剂技术领域。该制备方法包括将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母分别进行优化筛选、菌种复壮、摇瓶培养、30L发酵罐培养、菌体喷雾干燥、配制复合菌粉等步骤；本发明制得的高效复合微生态预混剂具有耐酸、耐盐、耐温及耐胆汁的优良特性，活菌含量高，对高铜有耐受性，在饲料造粒加工和常温保存条件下稳定性好，其制备方法简单，成本低廉，生产的产品质量稳定可靠，有较好的市场前景。
文档编号C12N1/16GK103202393SQ20121000687
公开日2013年7月17日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者赵志毅, 胥勇, 温亮 申请人:四川省环亚生物科技有限公司