一种发酵酶解制备几丁聚糖的方法
【专利摘要】本发明公开了一种发酵酶解制备几丁聚糖的方法，包括如下步骤：将蟹壳或虾壳干燥、粉碎；发酵；酶解脱钙和脱蛋白；酶解脱乙酰、水洗干燥粉碎即得。本发明的酶解工艺与现有技术制相比，脱钙与脱蛋白在同一步骤中实现，大大提高生产效率，无须使用强酸和强碱，耗能低，无污染，更加环保。酶解后的游离钙溶液经回收后可以制备成有机钙制剂，这样所有的产物都能够被合理利用产生显著的经济价值。
【专利说明】一种发酵酶解制备几丁聚糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及几丁聚糖制备方法，属于制造领域。
【背景技术】
[0002]甲壳素是一种天然含氮多糖物质，广泛存在与无脊椎动物的外壳或角质层中，尤其是虾蟹类的外壳中。甲壳素很容易获得，可再生，是仅次于纤维素的天然均聚物，但是因分子内部有很强的氢键作用，溶解性低，应用范围受到限制。
[0003]甲壳素脱乙酰后生成壳聚糖。目前壳聚糖的制备多采用化学法和酶解法脱乙酰。化学法脱乙酰反应中，影响脱乙酰的因素很多，但是主要影响因素包括:碱液浓度、反应温度和时间。一般来说，提高反应温度和延长反应时间均可提高脱乙酰度，但是会导致甲壳素主链降解增加，从而影响产品的粘度和分子量。通入氮气可以在一定程度上减缓主链的降解。由于化学法使用的碱液浓度高，反应时间长，产品质量不稳定，环境污染严重。
[0004]酶解法不会降解主链，并且无污染，具有重要的研究开发价值。影响酶解的因素很多，主要包括PH值和温度。文献记载最适宜PH值4-8，最适宜温度30-70°C (《甲壳酶特性与应用研究》万云洋等《天然产物研究与开发》2003 vol 15 N0.6)。迄今为止发现的真菌甲壳质脱乙酰酶(CDA)都是糖蛋白，且有良好的热稳定性。但是不同来源CDA的存在位置、最适宜PH值(PH4.5-12)、碳水化合物含量、相对分子质量及离子影响等有较大的差异。
[0005]迄今报道的CDA基本都来源于真菌。真菌来源的CDA主要作用是自身细胞壁的合成，最适底物一般为甲壳寡糖，对甲壳质的活性较低，不适合用酶法脱乙酰生产壳聚糖。真菌来源的CDA来源广泛，获取容易，成本相对较低。因此如何能够将真菌来源的CDA用于制备壳聚糖成为本领域技术人员急需解决的问题。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种新的几丁聚糖制备方法，所述的方法能够较现有技术更节能环保。
[0007]本发明的另一目的是提供一种用真菌来源的CDA制备几丁聚糖的方法，所述的方法能够解决现有技术CDA不适于生产几丁聚糖的技术难题。
[0008]本发明的另一目的是提供一种安全的几丁聚糖制备方法，所述的方法制得的几丁聚糖无强酸或强碱残留，产品更安全。
[0009]本发明的另一目的是提供一种具有市场竞争力的几丁聚糖，所述的产品不因工艺的改进而增加生产成本。
[0010]为达到上述目的，本发明采用下列技术方案实现:
干燥、超微粉碎、发酵；酶解脱钙和蛋白、过滤；酶解脱乙酰、水洗干燥即得。
[0011]本发明采用制备方法对脱钙前的蟹壳或虾壳进行预处理，然后再进行酶解脱钙和脱蛋白。
[0012]为增强脱钙和脱蛋白效果，本发明优选的将蟹壳或虾壳粉碎至0.5~1.0mm颗粒，颗粒过小则增加生产成本，颗粒过大效果较差。发明人经过多次试验及经验，最终确定0.5~1.0mm颗粒范围达到脱钙和成本的最佳性价比。
[0013]发明人提供大量实验，意外发现多种乳酸菌按照一定的配比组合进行发酵后脱钙效果更好，而采用乳双歧杆菌(B.lactis)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)和瑞士乳杆菌(L.helviticus)三种乳酸菌进行发酵效果较好；采用此三种乳酸菌配比后发酵效果最好，当三种乳酸菌以重量比2:6:5进行组合时，游离钙含量较单一乳酸菌发酵后提高10%~20%。优选的，乳酸菌占蟹壳或虾壳原料重量比为0.02~0.06%。
[0014]本发明采用高温灭菌的方法达到杀菌消毒的目的，同时也去除酶解液中的乳酸菌。
[0015]本发明的酶解采用复合酶解方法，经过筛选后，最终发现用木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶进行酶解较其他蛋白酶具有更好的效果。当然，选用其他蛋白酶进行酶解也能够实现本发明的目的。本发明工艺中最佳酶解方案是将蟹壳或虾壳粉碎后的原料中加入4-8倍重量体积比的水制成料液，加入乳酸菌发酵36h，然后70~100°C，20min ;发酵液加入菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2~5的复合蛋白酶，加柠檬酸调PH值至5.5~6.5，40~60°C搅拌I~2h ;分离液体，残渣再次重复提取。
[0016]酶解壳料所用的复合蛋白酶占壳料重量比为0.05~0.2%为佳。
[0017]酶解除具有脱蛋白的效果外，还具有脱钙的作用。酶解可以将发酵后的产品中钙元素游离出来，达到脱钙效果。
[0018]酶解脱蛋白后，过滤，滤液回收干燥得有机钙。残渣中加入含有甲壳质脱乙酰酶的发酵液脱乙酰，甲壳质与发酵液的重量体积比(g/1) I~3:1~6，30~32°C，48~72h，0.2MPa，然后120°C灭菌20min，干燥即得几丁聚糖。
[0019]所述的可以从公开市场上购得，也可以通过构巢曲霉菌发酵后制得。
[0020]所述的甲壳质脱乙酰酶制备方法如下:
(1)制备发酵培养基:酵母粉Sg，壳聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，无水硫酸镁Ig, 二氯化钴(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)发酵条件:发酵培养基灭菌，接种构巢曲霉菌，30~35°C，PH6.0~7.0，72~96h。
[0021]经过酶解脱钙和脱蛋白后，去除了原料中的钙离子、蛋白质其它有机物质。
[0022]本发明所述的几丁聚糖脱乙酰度高达95%以上。
[0023]本发明的产物与任何一种或一种以上药剂学上辅料如淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙二醇、硬脂酸镁、微粉硅胶、木糖醇、乳糖醇、葡萄糖、甘氨酸、甘露醇、甘氨酸等混合制成的各种剂型，例如，可制成片齐?、缓释片、滴丸、颗粒齐?、胶囊齐?、微粒剂。优选剂型为胶囊剂或颗粒剂。
[0024]本发明的酶解工艺与现有技术制相比，脱钙与脱蛋白在同一步骤中实现，大大提高生产效率，无须使用强酸和强碱，耗能低，无污染，更加环保。酶解后的游离钙溶液经回收后可以制备成有机钙制剂，这样所有的产物都能够被合理利用产生显著的经济价值。
【具体实施方式】
[0025]实施例1
制备甲壳质脱乙酰酶:(1)制备发酵培养基:酵母粉Sg，壳聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，无水硫酸镁Ig, 二氯化钴(0.01mol/1) 10ml，水 1000ml ；
(2)发酵:发酵培养基灭菌，接种构巢曲霉菌，35°C，PH6.0,发酵72h。
[0026]将蟹壳或虾壳干燥粉碎至0.5_颗粒，加入4倍重量体积比的水制成料液，加入乳双歧杆菌:保加利亚乳杆菌:瑞士乳杆菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比为0.02%,发酵36h，然后70~100°C，20min ;发酵液加入菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2的复合蛋白酶，蛋白酶占壳料重量比为0.05%，加柠檬酸调PH值至5.5，40°C搅拌Ih ;分离液体，残渣再次重复提取，过滤，弃滤液，留取残渣，加入含有甲壳质脱乙酰酶的发酵液脱乙酰，甲壳质与发酵液的重量体积比1:1，30°C，48h，0.2MPa，然后120°C灭菌20min，干燥即得几丁聚糖。
[0027]实施例2
制备甲壳质脱乙酰酶:
(1)制备发酵培养基:酵母粉Sg，壳聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，无水硫酸镁Ig, 二氯化钴(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)发酵条件:发酵培养基灭菌，接种构巢曲霉菌，30°C，PH7.0，72h。
[0028]将蟹壳或虾壳干燥粉碎至1.0mm颗粒，加入8倍重量体积比的水制成料液，加入乳双歧杆菌:保加利亚乳杆菌:瑞士乳杆菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比为0.06%,发酵液加入菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1: 5的复合蛋白酶，蛋白酶占壳料重量比为0.2%，加柠檬酸调PH值至6.5，60°C搅拌2h ;分离液体，残渣再次重复提取，过滤，弃滤液，留取残渣，加入含有甲壳质脱乙酰酶的发酵液脱乙酰，甲壳质与发酵液的重量体积比1: 6，320C，72h，0.2MPa，然后120°C灭菌20min，干燥即得几丁聚糖。
[0029]实施例3 制备甲壳质脱乙酰酶:
(1)制备发酵培养基:酵母粉Sg，壳聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，无水硫酸镁Ig, 二氯化钴(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)发酵条件:发酵培养基灭菌，接种构巢曲霉菌，33°C，PH6.5，96h。
[0030]将蟹壳或虾壳干燥粉碎至0.5mm颗粒，加入8倍重量体积比的水制成料液，加入乳双歧杆菌:保加利亚乳杆菌:瑞士乳杆菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比为0.04%,发酵液加入菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1: 5的复合蛋白酶，蛋白酶占壳料重量比为0.1%，加柠檬酸调PH值至6.5，60°C搅拌2h ;分离液体，残渣再次重复提取，过滤，弃滤液，留取残渣，加入含有甲壳质脱乙酰酶的发酵液脱乙酰，甲壳质与发酵液的重量体积比3: 6，31°C，72h，0.2MPa，然后120°C灭菌20min，干燥即得几丁聚糖。
[0031]实施例4 制备甲壳质脱乙酰酶:
(1)制备发酵培养基:酵母粉Sg，壳聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，无水硫酸镁Ig, 二氯化钴(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)发酵条件:发酵培养基灭菌，接种构巢曲霉菌，32°C，PH6.6，72h。
[0032]将蟹壳或虾壳干燥粉碎至1.0mm颗粒，加入4倍重量体积比的水制成料液，加入乳双歧杆菌:保加利亚乳杆菌:瑞士乳杆菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比为0.05%,发酵液加入菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2的复合蛋白酶，蛋白酶占壳料重量比为0.15%，加柠檬酸调PH值至6，40°C搅拌2h ;分离液体，残渣再次重复提取，过滤，弃滤液，留取残渣，加入含有甲壳质脱乙酰酶的发酵液脱乙酰，甲壳质与发酵液的重量体积比1:3，320C ,48~72h，0.2MPa，然后120°C灭菌20min，干燥即得几丁聚糖。
[0033]实施例5 制备甲壳质脱乙酰酶:
(1)制备发酵培养基:酵母粉Sg，壳聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，无水硫酸镁Ig, 二氯化钴(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)发酵条件:发酵培养基灭菌，接种构巢曲霉菌，34°C，PH6.l，72h。
[0034]将蟹壳或虾壳干燥粉碎至0.8mm颗粒，加入6倍重量体积比的水制成料液，加入乳双歧杆菌:保加利亚乳杆菌:瑞士乳杆菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比为0.03%,发酵液加入菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:3的复合蛋白酶，蛋白酶占壳料重量比为0.12%，加柠檬酸调PH值至5.5，50°C搅拌2h ;分离液体，残渣再次重复提取，过滤，弃滤液，留取残渣，加入含有甲壳质脱乙酰酶的发酵液脱乙酰，甲壳质与发酵液的重量体积比1:5，31.5°C，64h，0.2MPa，然后120°C灭菌20min，干燥即得几丁聚糖。
[0035]实施例6 制备甲壳质脱乙酰酶:
(1)制备发酵培养基:酵母粉Sg，壳聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，无水硫酸镁Ig, 二氯化钴(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)发酵条件:发酵培养基灭菌，接种构巢曲霉菌，32°C，PH6.0，80h。
[0036]将蟹壳或虾壳干燥粉碎至0.9mm颗粒，加入5倍重量体积比的水制成料液，加入乳双歧杆菌:保加利亚乳杆菌:瑞士乳杆菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比为0.06%,发酵液加入菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2.5的复合蛋白酶，蛋白酶占壳料重量比为0.18%，加柠檬酸调PH值至6.5，55°C搅拌Ih ;分离液体，残渣再次重复提取，过滤，弃滤液，留取残渣，加入含有甲壳质脱乙酰酶的发酵液脱乙酰，甲壳质与发酵液的重量体积比3:5，320C，56h，0.2MPa，然后120°C灭菌20min，干燥即得几丁聚糖。
[0037]实施例7 制备甲壳质脱乙酰酶:
(1)制备发酵培养基:酵母粉Sg，壳聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，无水硫酸镁Ig, 二氯化钴(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)发酵条件:发酵培养基灭菌，接种构巢曲霉菌，35°C，PH6.0，96h。
[0038]将蟹壳或虾壳干燥粉碎至0.6_颗粒，加入7倍重量体积比的水制成料液，加入乳双歧杆菌:保加利亚乳杆菌:瑞士乳杆菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比为0.05%,发酵液加入菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:4的复合蛋白酶，蛋白酶占壳料重量比为
0.08%， 加柠檬酸调PH值至5.5，45°C搅拌1.5h ;分离液体，残渣再次重复提取，过滤，弃滤液，留取残渣，加入含有甲壳质脱乙酰酶的发酵液脱乙酰，甲壳质与发酵液的重量体积比1:3,30°C，72h，0.2MPa，然后120°C灭菌20min，干燥即得几丁聚糖。
【权利要求】
1.一种发酵酶解制备几丁聚糖的方法，包括如下步骤: (1)将蟹壳或虾壳干燥、粉碎； (2)发酵 (3)蛋白酶酶解脱钙和脱蛋白； (4)酶解脱乙酰、水洗干燥粉碎即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将蟹壳或虾壳粉碎至0.5~1.0mm大小。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵采用乳酸菌。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的乳酸菌是乳双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和瑞士乳杆菌复合菌。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的乳酸菌重量比是乳双歧杆菌:保加利亚乳杆菌:瑞士乳杆菌=2:6:5。
6.根据权利要求3、4或5所述的制备方法，其特征在于，乳酸菌占蟹壳或虾壳原料重量比为 0.02 ~0.06%ο
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的酶解是发酵液中加入菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2~5的复合蛋白酶，加柠檬酸调PH值至5.5~6.5，40~60 V搅拌I~2h。
8.根据权利要求1或7所述的制备方法，其特征在于，所述的蛋白酶占壳料重量比为0.05 ~0.2%ο
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的脱乙酰是残渣中加入含有甲壳质脱乙酰酶的发酵液脱乙酰，甲壳质与发酵液的重量体积比I~3:1~6，30~320C，48 ~72h，0.2MPa，然后 120°C灭菌 20min，干燥即得。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的甲壳质脱乙酰酶制备方法是: (1)制备发酵培养基:酵母粉Sg，壳聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，无水硫酸镁Ig, 0.01mol/l 的二氯化钴 10ml，水 100ml ； (2)发酵条件:发酵培养基灭菌，接种构巢曲霉菌，30~35°C，PH6.0~7.0，72~96h。
【文档编号】C12P19/26GK104046666SQ201310450576
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】李莹, 杨国元, 田志同, 白洁, 李雨田, 李卉婷, 苗胜昆 申请人:天津天狮生物发展有限公司