一种编码金属蛋白酶的基因pme16A及其应用的制作方法
【专利摘要】一种编码金属蛋白酶的基因pme16A，其核苷酸序列如序列表No.1所示；氨基酸残基的序列如序列表No.2所示。序列表1中的DNA从5’端第1个核苷酸开始起始密码子ATG到第1461个核苷酸以终止密码子TAA结束，存在一个完整的ORF，核苷酸1-1461，自5’端的第1-3位核苷酸为pme16A基因的起始密码子ATG，自5’端的第1459-1461位核苷酸为pme16A基因的终止密码子TAA。本发明为金属蛋白酶的工业化生产应用提供了新的材料，可以有效弥补动植物源金属蛋白酶原材料的短缺现状，具有重要的研究价值和应用前景。
【专利说明】—种编码金属蛋白酶的基因pme16A及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种编码金属蛋白酶的基因pmel6A及其应用。
【背景技术】
[0002]金属蛋白酶(EC3.4.24._)是指其活性中心，依赖于金属离子的一类蛋白酶。大多数金属蛋白酶主要依赖二价阳离子，如锌离子、铜离子、钴离子和锰离子等。其中Zn2+最为普遍。金属蛋白酶容易被金属螯合剂强烈抑制。金属蛋白酶，分布广泛，性质特异，有着重要的经济和应用价值。由于金属蛋白酶的来源不同，所以大多数都具有自己与众不同的特点。一般具有耐高温或者嗜低温、耐有机溶剂、耐碱性、热敏感等特性。目前，金属蛋白酶类主要应用于食品、洗涤剂、化妆品、抗肿瘤药物和疾病机理研究等方面，而且应用于以上各行业中的金属蛋白酶大多源自于动植物，由于动植物源酶来源有限，限制了金属蛋白酶在生产生活上的进一步应用与发展。
[0003]近年来，被确定的锌金属蛋白酶/肽酶的数量逐年增加。金属蛋白酶超家族的成员，都不同程度的涉及胚胎发育和骨骼形成，关节炎和癌症等。对不同金属蛋白酶之间的结构活性研究，有利于我们设计不同的工程金属蛋白酶。将金属蛋白酶的结合位点，引入蛋白质中，可以调节酶的活性，也有可能诱发可预测的特异构象变化。在对金属蛋白酶的氨基酸序列进行比对时，发现它们都拥有一段共同的锌离子结合位点序列HEXXH，其中H代表组氨酸残基，E代表谷氨酸残基，X代表任意的氨基酸残基。两个组氨酸残基，是作为锌的配基，谷氨酸残基作为常见的支点。含有保守的锌结合位点序列HEXXH的金属肽酶都被称为Zincins，根据锌离子第三个配基所在的位置，又把Zincins分成三个不同的族群，Gluzincins,即下游的谷氨酸残基作为锌离子的第三个配基,属于这一类的金属蛋白酶，包括嗜热菌蛋白酶，肽链内切酶，白三烯A4水解酶等。
[0004]金属蛋白酶也广泛存在于植物的各种器官或组织中，植物幼嫩部分的含量较多，成熟部分含量较少。如:亮氨酸氨基肽酶(LAP)，是广泛存在于植物中的金属蛋白酶，序列和结构都很保守。在寄生虫中，有来`自亚马逊利什曼原虫的，亮氨酰氨基肽酶(Lap)，它是一个60kDa的蛋白质,与来源于革兰氏阴性菌、植物、哺乳动物中的LaP具有同源性。Eggleson等从食物泡中，纯化并鉴定了一种新的金属肽酶，镰形溶解素(Falcilysin)。这种金属肽酶，出现在疟原虫的天冬氨酸蛋白酶I和II，以及恶性疟原虫的半胱氨酸蛋白酶血色素水解功能的下游。它不能断裂球蛋白和血色素，但易断裂血色素的多肽片段。镰形溶解素的序列显示了 ME家族中M16金属肽酶的特点，具有一个倒转的HXXEH的活性位点基序。通过用随机的多肽对镰形溶解素进行分析，发现重组的镰形溶解素在酸性条件下，具有高度的活性。在中性条件下，也具有较低的活力，但是，却有不同的底物特异性。
[0005]在锌金属蛋白酶中，嗜热菌蛋白酶和羧肽酶A，被认为是典型的模型来研究作用机制。在嗜热菌蛋白中，锌离子具有近四面体的结构，有三个残基提供(Hisl42，Hisl46,Glul66)还有一个是由水分子来提供。进来的底物，取代溶剂分子。锌离子在其中，扮演两个重要的角色，第一，使底物的羰基极化，第二，促进去质子化的水亲核试剂。在羧肽酶A中，在酶的催化中心，Zn2+与Hisl96，Glu72，His69结合，它具有以下作用，第一，通过Zn2+-OH键极化一个水分子，使其攻击底物易断裂的肽键，从而形成一个四面体的过渡态结构。第二，通过静电作用，稳定过渡态结构中的部分电荷。Argl27、Glu270协助形成过渡态结构，Argl27与底物的羰基结合，Glu270与水分子，通过氢键结合。Argl45，在Asnl44和Tyr248的协助下，对底物的结合，具有重要的作用。第225位的氨基酸被认为，是决定底物特异性的关键残基。Mpp (线粒体加工肽酶)是一种金属肽酶，专门裂解N-端信号肽序列。它的活性位点位于一个大的中央腔，在α和β亚基之间，内衬亲水性氨基酸，其中包括谷氨酸和天冬氨酸。信号肽的底物是富含带正电荷的氨基酸残基，因此，在底物结合区域，带负电荷的残基可以与之结合，形成稳定的静电相互作用的酶和底物。另外，高极性的空腔，不喜欢两亲性的α-螺旋结构。底物可到达活性位点的部位，被富含甘氨酸环(由a-MPP的284-301位残基组成)部分阻止。电子密度被甘氨酸环弱化，显示灵活。Arecent等人的研究表明，Mpp去除这个甘氨酸环后，对底物的亲合力降低以及催化活性降低。这些结果表明，Mpp中富含甘氨酸环，可能与底物的结合或产物的释放相关，可能取决于它的灵活度 。
[0006]目前，获得金属蛋白酶的主要方式有:(1)从动植物组织中直接提取，分离纯化得到；这种方法要获得大量的蛋白酶，则需大量的生物体组织，且生物组织的前期处理较麻烦，价格较贵。(2)利用微生物发酵法生产金属蛋白酶。此方法有诸多优势，如成本低、获得量大、通过分泌表达系统使纯化更容易等。产金属蛋白酶的菌株可通过纯培养技术筛选得到，但由于各方面条件的限制，自然界约有99%的微生物不能通过纯培养技术来实现，在发掘新基因方面有一定的局限性，因此，宏基因组技术在发掘新基因方面得到越来越多的科学家的重视。宏基因组是指生境中全部微小生物遗传物质的总和，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和，通过宏基因组技术可绕过纯培养技术瓶颈。本发明从污染水样污泥中直接提取宏基因组总DNA，构建了环境宏基因组文库，通过直接测序筛选策略，结合生物信息学技术分析平台，获取了一个编码金属蛋白酶的基因pmel6A，完成了该基因的克隆表达，以及对其表达产物进行生理生化性质的鉴定，为金属蛋白酶的研究提供新的材料。本发明提供的新的金属蛋白酶可以为金属蛋白酶的工业化生产应用提供理论参考，可以有效弥补动植物源金属蛋白酶原材料的短缺现状，具有重要的研究价值和应用前景，在食品和疾病机理研究等方面具有广泛的用途。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种编码金属蛋白酶的基因pmel6A及其应用。
[0008]本发明提供的一种编码金属蛋白酶的基因pmel6A的克隆方法包括下列步骤:
[0009](I)从广西某地污染水样(22° 84; N，108° 28, E)淤泥样本中提取未培养微生物宏基因组DNA，构建环境宏基因组文库；
[0010](2)基于序列特异性的筛选策略，从环境宏基因组文库中分离筛选包含金属蛋白酶新基因的克隆。
[0011]本发明通过构建环境宏基因组文库，基于序列特异性的直接测序筛选策略，得到了一种新的编码金属蛋白酶的基因，可在宿主细胞中大量表达，产生的金属蛋白酶对酪蛋白底物有较好的水解能力。
[0012]重组质粒菌株E.coli BL21 (DE3)/pGXM16已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，编号为CGMCC N0.7473，保存日期为2013年4月15日，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0013]序列表N0.1的DNA是克隆载体pGEM_3Zf (+)部分DNA序列和克隆在载体上的外源未培养微生物的DNA，包含完整的编码金属蛋白酶的新基因pmel6A。该基因的ORF位于克隆第I至第1461位核苷酸之间，由第1-3位核苷酸的起始密码子ATG起始，第1459-1461位核苷酸的终止密码子TAA终止。该ORF —共1461个核苷酸可编码由486个氨基酸组成的多妝。在氨基酸水平上与假定的 Zn-dependent peptidase (YP_004863228.1)、PeptidaseM16domain protein (ZP_09615990.1)分别具有 38% 及 35% 的一致性。[0014]本发明可以为金属蛋白酶的工业化生产应用提供新的材料，可以有效弥补动植物源金属蛋白酶原材料的短缺现状，具有重要的研究价值和应用前景，在食品和疾病机理研究等方面具有广泛的用途。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为从广西某地污染水样环境(22° 84' N，108° 28' E)活性淤泥样品中提取的宏基因组DNA。
[0016]图2为宏基因组DNA双酶切后的电泳图。
[0017]图3为淤泥宏基因文库克隆的限制性内切酶酶切分析以判断文库质量。
[0018]图4为表达金属蛋白酶活性克隆的筛选。
[0019]图5为原始克隆PGXM16的酶切检测结果。
[0020]图6为基因pmel6A的PCR扩增结果。
[0021]图7为表达重组质粒E.coli BL21 (DE3)/pGXM16的酶切检测结果。
[0022]图8为表达重组质粒E.coli BL21 (DE3)/pGXM16的测序结果。
[0023]图9为表达重组菌株E.coli BL21(DE3)/pGXM16诱导表达的SDS-PAGE分析结果。
[0024]图10不同温度对Pmel6A重组蛋白酶活的影响。
[0025]
[0026]【具体实施方式】
[0027]在本发明的实施例中所用到的主要材料包括:限制性内切酶(EcoR I > Pst I及Hind III)及T4DNA连接酶均购自Fermentas公司、克隆载体pGEM_3Zf(+)及表达载体pET-32a(+)均购自Promega公司、PVPP (交联聚乙烯吡咯烧酮)购自Sigma公司、CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)购自Sigma公司。
[0028]实施例1
[0029]—种编码新型金属蛋白酶的基因pmel6A的克隆,其主要包括下述步骤1、2、3、4。
[0030]步骤1:从污染水样活性淤泥中提取和纯化宏基因组DNA，方法步骤如下。
[0031](I)首先配制DNA提取液:100mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)，l%(w/v)CTAB, IOOmM EDTA(pH8.0),0.3M NaCl,0.01mM Tris-HCl (pH8.0)；
[0032](2)PVPP酸洗处理:称取IOg PVPP，加入3M HCl，浸泡12h，有滤纸过滤，用20mM磷酸钾缓冲液(PH7.4)清洗搅拌PVPP，重复几次直至悬浮液达到中性，将PVPP过滤，于50°C烘干；
[0033](3)称取Ig样品于15mL离心管，加入0.25g酸化的PVPP，4mL提取缓冲液，混匀，70°C和液氮反复冻融3次，每次30min。最后一次溶解后，加入SDS至终浓度为1%，颠倒混匀，放置室温20min, 5000rpm离心8min,取上清待用；
[0034](4)加入2mL提取液重悬沉淀，离心取上清，重复此步骤两次，合并所有上清；
[0035](5)加入蛋白酶K至终浓度为0.2mg/mL，65°C水浴lh，加入0.5g酸化PVPP及0.5gSephadex G-200混匀，室温结合30min, 5000rpm离心8min,取上清待用；
[0036](6)加入2mL提取液重悬沉淀，离心取上清，重复此步骤两次，合并所有上清；
[0037](7)加入PEG-8000使其终浓度达到10%，加入NaCl使其终浓度为1.1M，放至4°C静止2h后,分装于2mL离心管中，4°C, 13000rpm离心IOmin,弃上清；
[0038](8)用75%乙醇洗涤2次，无水乙醇洗涤I次，真空浓缩至乙醇挥发完全，加入TE缓冲液溶解，_20°C保存。
[0039]取适量宏基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，所得的宏基因组DNA片段完整性较好(见图1)，经EcoR I和Pst I双酶切后成弥散条带(见图2)，证实其纯度符合分子实验要求。
[0040]对照图1，为提取的宏基因组DNA电泳图。泳道M为λ/Hind III Marker，片段大小从大到小依次为:23.13kb，9.4kb，6.6kb，4.4kb，2.3kb，2.0kb ;泳道1-9为从活性污泥中提取和纯化的宏基因组DNA。
[0041]对照图2，为宏基因组DNA酶切后电泳图。泳道M为λ/HindIIlMarker，片段大小从大到小依次为:23.13kb，9.4kb，6.6kb，4.4kb，2.3kb，2.0kb ;泳道I为宏基因组DNA用EcoR I和Pst I进行双酶切结果，泳道2为酶切前的宏基因组DNA。
[0042]步骤2:污染水样活性污泥宏基因组文库的构建，详细方法如下。
`[0043]首先通过手工法提取宏基因组DNA，采用EcoR I和Pst I两种限制性内切酶对宏基因组DNA进行双酶切。经琼脂糖凝胶电泳回收3-10kb的片段，与经同样的两种限制性内切酶双酶切和纯化的克隆载体pGEM-3Zf(+)连接，导入E.coli DH5 α宿主中，涂布于含有40 μ g/mL X_gal、40 μ g/mL IPTG及50 μ g/mLAmp的LA平板上进行蓝白筛选。将白色克隆挑至含有50 μ g/mL Amp的LA平板上，37°C倒置培养至菌落为2_3mm后，再次挑板，将转化子挑取到文库保存培养基于96孔培养板孔中，37°C恒温培养24h左右，然后保存于_80°C低温冰箱中。最终得到了 8500个白色转化子。随机挑取14个转化子提取质粒，用EcoR I和Pst I进行酶切检测，均发现14个带有随机插入的外源DNA片段，平均长度为3.0kb,结果见图3。
[0044]对照图3，为活性污泥宏基因组文库的质量检测。泳道M为Ikb Marker,从上至下片段大小依次为:10.0kb, 8.0kb, 6.0kb, 5.0kb, 4.0kb, 3.5kb，3.0kb, 2.5kb，2.0kb, 1.5kb,1.0kb, 750bp, 500bp, 250bp ;泳道1_14为随机挑取的重组质粒用EcoR I和Pst I进行双酶
切结果。
[0045]步骤3:采用直接测序筛选策略从宏基因组文库中分离金属蛋白酶基因，详细方法如下。
[0046]为了获得金属蛋白酶基因，采用直接测序分离筛选方法，用双脱氧核苷酸法在ABI377DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列。得到一个编号为pGXM16的阳性克隆，携带一个可能的编码延胡索酸还原酶的基因。如图4所示，电泳检测结果表明，pGXM16克隆所携带的外源DNA片段大小约为1.5kb。[0047]对照图4，为携带金属蛋白酶基因克隆质粒DNA的酶切检测结果。泳道M为IkbLadder Marker,从上至下片段大小依次为:10.0kb, 8.0kb, 6.0kb, 5.0kb, 4.0kb, 3.5kb,
3.0kb, 2.5kb, 2.0kb, 1.5kb, 1.0kb, 750bp, 500bp, 250bp ;泳道 I 为克隆 pGXM16 质粒 DNA 酶切之前的检测结果；泳道2为克隆pGXM16质粒DNA酶切之后的检测结果。
[0048]步骤4:克隆pGXM16测序及生物信息学分析，详细方法如下。
[0049]采用双脱氧核苷酸法在ABI377DNA自动测序仪上测定克隆pGXM16的核苷酸序列，用软件DNA Star对测序所得到的序列进行拼接。使用ORF Finder工具分析其测序结果，发现外源DNA片段中携带的可能的编码金属蛋白酶的新基因大小为1461bp，将该基因命名为pmel6A，其序列见序列表1。从5’端第I个核苷酸起始密码子ATG到1461个碱基以终止密码子TAA结束，存在一个完整的0RF，自5’端的第1-3位核苷酸为pmel6A基因的起始密码子ATG，自5’端的第1459-1461位核苷酸为pmel6A基因的终止密码子TAA，编码一个由486个氨基酸组成的多肽。该基因编码的相应的氨基酸产物见图5所示。
[0050]根据Blastp结果，发现其与一个假设的Zn-dependent peptidase (依赖锌离子肽酶)(GenBank登录号:YP_004863228.1)的基因的一致性为38%，相似性为54% ;与基因Peptidase M16domain protein (M16 家族妝酶)(GenBank 登录号:ΖΡ_09615990.I)的一致性为35%，相似性为55%。通过对氨基酸水平的相似性分析，ΡΜΕ16Α的氨基酸序列，与金属蛋白酶中Μ16蛋白酶的氨基酸序列具有一定的相似性，因此，pmel6A基因可能是一个编码金属蛋白酶的基因。经SMART分析后，PME16A蛋白从N端开始，第I个氨基酸到第22个氨基酸为信号肽序列。第44个氨基酸到第17 9个氨基酸序列为Peptidase-Mie结构域，第197个氨基酸到第377个氨基酸 序列为Peptidase-M16-C结构域。PME16A蛋白序列存在一个HXXEH的保守氨基酸残基结构，该结构是金属蛋白酶的锌离子结合位点。因此，PME16A可能具有金属蛋白酶的功能。
[0051]对照图5,金属蛋白酶基因pmel6A的核苷酸序列及其编码的产物的氨基酸序列。
[0052]实施例2
[0053]pmel6A基因表达重组质粒的构建。
[0054]利用美国Novagen公司提供的质粒pET_32a(+)作为表达载体和E.coliBL21 (DE3) pLysS作为宿主细胞进行目标基因的异源高效表达。
[0055]根据pmel6A基因序列，利用相关软件进行引物设计。正向扩增引物Fl: 5’ -GCGAATTCATGCCCCTTTATCAGACCTTC-3，,引入 EcoR I 酶切位点；反向扩增引物 Rl:5，-AACTCGAGGGGCGATTCGAGCTC-3'添加 Pst I 酶切位点。以 pGXM16 为模板，采用 Pfu DNA聚合酶进行PCR反应，扩增pmel6A基因，如图6所示。提取表达载体pET_32 (a) +质粒，用EcoR I和Pst I进行双酶切，纯化后与同样经过双酶切并纯化的pmel6A扩增产物连接，构建表达重组质粒，采用化学转化法转入E.coli DH5ci，酶切验证后(见图6)进行测序。利用ExPASy网站相关软件分析pGXPME16A的理论等电点和分子量，发现其理论等电点为5.95，分子量约为54kDa。
[0056]实施例二请参考图6。图6为表达重组质粒PGXPME16A的检测结果，I为Ikb LadderMaker,从上至下片段大小依次为:10.0kb, 8.0kb, 6.0kb, 5.0kb, 4.0kb, 3.5kb, 3.0kb,
2.5kb，2.0kb, 1.5kb, 1.0kb, 750bp, 500bp, 250bp ;2 为用 EcoR I 和 Pst I 酶切 pGXPME16A之后的结果。[0057]实施例3
[0058]pmel6A基因在大肠杆菌中的诱导表达和纯化。
[0059]提取序列正确的重组质粒pGXPME16A，转入E.coli BL21(DE3)表达宿主细胞。将已验证具有金属蛋白酶活性的重组表达菌转接于IOmL含有Amp和Cm的LB培养基中，37°C，200rpm培养过夜。按1%接种量取200 μ L加入IOmL的LB培养基(含有Amp和Cm)中，370C，200rpm 振荡培养 2_3h 至 0D_ 到 0.6-0.8，加入终浓度为 0.8mM 的 IPTG，28°C，200rpm诱导12h,制备粗酶液；采用Qiagen公司的His-Bind Purification Kit (组氨酸结合纯化试剂盒)对重组蛋白进行分离纯化。制备的对照样品以及分离纯化得到的重组蛋白通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况。
[0060]实施例三请参考图7。图7为重组质粒PGXPME16A转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)PLysS诱导表达后的SDS-PAGE分析结果。泳道I为蛋白质标准样品带，自上而下大小依次为:116.0kDa, 66.2kDa, 45.0kDa, 35.0kDa, 25.0kDa, 18.4kDa, 14.4kDa ;泳道 2 为 E.coliBL21 (DE3)pLysS/pET-32a(+)全蛋白；泳道 3 为 Ε.coli BL21 (DE3)pLysS/pGXPME16A 全蛋白；泳道4为采用镍柱亲和层析技术分离纯化得到的Pmel6A蛋白。
[0061]实施例4
[0062]温度和pH对Pmel6A蛋白的酶活影响。
[0063]设置不同的温度，测定重组蛋白Pmel6A的酶活。使用Thermo公司的酶标仪，在660nm波长处测定OD值。
[0064]结果参见图8，35°C时Pmel6A蛋白具有最高的酶活。
[0065]Pme 16A蛋白与底物在最适温度下、不同pH值的缓冲液中测定Pmel6A蛋白的酶活:磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(6.0-8.`0) ；Tirs-HCl缓冲液(7.5-8.9) ；Gly-Na0H缓冲液(8.6-10.6)。
[0066]结果参见图9，pH值为7.0时Pmel6A蛋白具有最高的酶活。
[0067]实施例5
[0068]不同金属离子对Pmel6A蛋白活性影响。
[0069]在温度35°C和pH7.0的条件下，在酶促反应体系中，加入种类不同的金属离子，均为卤化物，加入终浓度为2mM，测定酶活力，以未加入金属离子的,在最适温度和最适pH条件下的酶活力作100%,得出不同金属离子的相对酶活力，如图10所示。
[0070]结果显示，金属锌离子(氯化物)可以刺激酶活提升至对照组的120%左右。表明Pmel6A蛋白酶活的提升，需要金属锌离子的刺激。
[0071]含有本发明基因的开放阅读框及其部分序列的表达载体、细胞系以及产物金属蛋白酶等均属于本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种编码金属蛋白酶的基因pmel6A,其特征在于,其核苷酸序列如序列表N0.1所/Jn ο
2.权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如序列表N0.2所示。
3.权利要求1所述的金属蛋白酶的基因pmel6A,其特征在于,序列表N0.1中的DNA从5’端第I个核苷酸开始起始密码子ATG到第1461个核苷酸以终止密码子TAA结束，存在一个完整的ORF (核苷酸1-1461)，自5’端的第1_3位核苷酸为pmel6A基因的起始密码子ATG,自5’端的第1459-1461位核苷酸为pmel6A基因的终止密码子TAA。
4.权利要求2所述 的蛋白质在制备金属蛋白酶中的应用。
【文档编号】C12N9/50GK103509810SQ201310450387
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】蒋承建, 黄捷, 古恒森, 曾蓉, 陈高, 申佩弘, 武波 申请人:广西大学