专利名称：：一种溶栓蛋白酶基因nks1及用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域、分子生物学领域。具体地，本发明涉及一种利用DNA改组技术获得功能显著提高的溶栓蛋白酶基因，以及利用此基因生产溶栓药物。
背景技术：
：随着生活水平的提高和寿命的延长，血栓病的发生率和病死率日趋增高，已成为人类疾病的头号杀手。溶解血栓是治疗这一类疾病的重要手段，因此寻找理想的溶栓药物已成为国内外研究非常活跃的一个领域，并具有巨大的科学价值、经济价值和社会效益。纳豆是一种久经千年考验的百姓认可的古老的保健食品。近年研究发现，纳豆中存在纤维蛋白溶解酶，具有独特的纤溶功能，药效迅速、效力强、促进和激发机体内其它因子纤溶效能、半衰期长、无任何毒性和副反应等，是目前众多纤溶药物所难以媲美的，它是新型溶栓药物筛选的难得的候选者。1988年，日本学者在日本生产的纳豆中提取得到了血栓溶解酶，并定名为纳豆纤维蛋白溶解酶，简称纳豆酶(NattoKinase,NK)0纳豆激酶是纳豆在发酵过程中由纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)产生的具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶。随后的研究对纳豆酶的分子结构、理化性质等有了进一步的了解。纳豆酶是纳豆菌经由大豆丝制造出来的酶制品，白色粉末状，无异臭。分子量为27728Dalton,在pH712条件下比较稳定，低于5.O时则极不稳定。当温度高达60°C时，则因蛋白变性而迅速失活。反复冻融不影响其活性。纳豆激酶由275个氨基酸组成，含有8个赖氨酸残基。酶的活性部位在Asp32、His64和^^221，与底物结合部位在krl25，Lenl26，Glyl27处。研究发现纳豆酶的最敏感的底物为血浆纤溶酶。纳豆激酶有其特异的水解蛋白的氨基酸作用和识别位点。同时，纳豆酶在血流中的半衰期长达8天，比尿激酶、链激酶以及但织型纤溶解原激活剂都长。研究表明，纳豆激酶能显著溶解体内外血栓，明显缩短优球蛋白的溶解时间(ELT)，并能刺激静脉内皮细胞产生纤溶酶原激活剂，从而更有效地发挥溶栓效果。研究结果还表明，NK除具有较强的溶栓作用外，还具有以下几个优点(1)来源于食品，安全性能好；(2)分子量小，是一个单链蛋白质，体内半衰期长，可能更易被人体消化吸收；(可由消化道吸收，因此有成为口服性药物的可能；(4)NK对纤维蛋白的作用机制不同于UK等现用于临床的药物，它同纤溶酶一样直接作用于纤维蛋白，同时可以激活体内的tPA;(5)可以用细菌进行液体发酵生产，造价低廉.可以预见，NK可能成为新一代治疗血栓的口服药物。为了获得大量的纳豆激酶，国际上多采用改良菌种和改善纳豆生产工艺等方法，国内主要采用改善纳豆杆菌液体发酵条件、改善纳豆激酶的纯化方法等。Nakamura等人于1992年公布了纳豆激酶基因序列，使得利用基因工程方法生产纳豆激酶成为可能。目前已成功地从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基因组中扩增得到了纳豆激酶的编码基因，构建了纳豆激酶基因的表达载体，并在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒中实现了表达。综上所述，纳豆激酶具有十分良好的应用开发价值。目前存在的主要问题是，利用基因工程的方法生产纳豆激酶普遍存在酶活不高的现象。因此，如何利用分子生物学技术提高纳豆激酶的酶活，成为利用该基因生产纳豆激酶的关键。DNA改组(DNASmffling)技术是目前蛋白质、酶和单克隆抗体等体外定向进化的快速高效方法，在提高酶活性、蛋白质产量和改善蛋白质(酶)的性能等方面具有广泛的应用前景。其原理是将一组紧密相关的核酸序列随机片段化，然后利用无引物PCR将这些随机片段进行重新组装而得到全长的核酸序列，在这个过程中引入突变并对不同的突变进行广泛的重组，从而完成对目的核酸序列的迅速进化，以提高核酸序列或其编码的蛋白白勺功能(StemmerWP.DNAshufflingbyrandomfragmentationandreassembly:invitrorecombinationformolecularevolution.ProcNatlAcadSciUSA.1994,91:1074710751)。DNA改组技术自诞生以来，已成功地对多种基因如工业用酶、抗体及一些重要的蛋白等进行了定向进化，使酶的活性、底物特异性及抗体的特异性、蛋白功能、热稳定性等得到了显著的提高(CrameriA,RaillardS,BermudezE,StemmerWP.DNAshufflingofafamilyofgenesfromdiversespeciesacceleratesdirectedevolution.Nature.1998,391:288)。如Memmer等应用该技术取得了一系列研究成果，获得了酶活提冑了32000.白勺β-IitI^BI(StemmerWP.RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling.Nature.1994,370:389391)、荧光强度超过野生型45倍的绿色荧光蛋白(CrameriA,WhitehornEA,TateΕ,StemmerWP.ImprovedgreenfluorescentproteinbymolecularevolutionusingDNAshuffling.NatBiotechnol.1996,14:315319)。通过DNA改组方法，Crameri等成功得到了砷酸盐抗性提高40倍的菌株(CrameriA,DawesG,RodriguezEJ,SilverS,StemmerWP.MolecularevolutionofanarsenatedetoxificationpathwaybyDNAshuffling.NatBiotechnol.1997,15:436438)。但是，应用该技术在改进纳豆激酶基因及其蛋白质的性能方面，国内外均未见报导。主要参考文献1.FujitaMjHongK，ItoY，FujiiRjKariyaK，NishimuroS.(1995)Thrombolyticeffectofnattokinaseonachemicallyinducedthrombosismodelinrat.BiolPharmBull，18(10):1387-13912.FujitaMjNomuraK,HongK,ItoY，AsadaA,NishimuroS.(1993)Purificationandcharacterizationofastrongfibrinolyticenzyme(nattokinase)inthevegetablecheesenatto,apopularsoybeanfermentedfoodinJapan.BiochemBiophysResCommun；197(3):1340-13473.SumiH，HamadaH，TsushimaH，MiharaH，MurakiH.(1987)Anovelfibrinolyticenzyme(nattokinase)inthevegetablecheeseNatto；atypicalandpopularsoybeanfoodintheJapanesediet.Experientia，43(10):1110-144.SuzukiY,KondoK,IchiseH,TsukamotoY,UranoΤ,UmemuraK.(2003)Dietarysupplementationwithfermentedsoybeanssuppressesintimalthickening.Nutrition,19(3):261-45.PengY,HuangQ,ZhangR,ZhangY.(2003)PurificationandcharacterizationofafibrinolyticenzymeproducedbyBacillusamyloliquefaciensDC-4screenedfromdouchi,atraditionalChinesesoybeanfood.CompBiochemPhysiolBBiochemMolBiol,134(1):45-526.徐涛，宋文延.一种新型纤溶活性物质一纳豆激酶，2001，中国生化药物杂志，6)196.7.李麒，武井直树，2002，纳豆在保健和医疗上的应用价值，中国微生态杂志，44(4)243-2468.张淑梅，李晶，王玉霞，王佳龙，赵晓宇，2003，纳豆激酶基因的表达及纯化，生物技术，13(6):12-159.刘北域，宋后燕，2002，纳豆激酶基因的克隆及其在枯草杆菌中的表达，生物化学与生物物理学报，34(3)338-34010.姜媛媛，王曙文，王铁，丁东红，王景会，2009，纳豆激酶基因的克隆及表达研究，吉林农业大学学报，31(4):39840111.辛及娣，范长胜，2010，一种新型纳豆激酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达，复旦学报(自然科学版)，49(5):582-586。
发明内容本发明提供了一种通过DNA改组技术获得的新的纳豆激酶基因NKS1。本发明提供了一种通过DNA改组技术对进纳豆激酶基因进行体外分子进化以获得活性更高的进纳豆激酶新基因，此新基因编码的产物具有更高的纳豆激酶基因活性，可以用于纳豆激酶的基因工程产品生产。本发明的技术方案如下本发明涉及到能够提高纳豆激酶活性的一种新基因NKS1，其编码由序列表中SEQIDNO:1中所表示的氨基酸序列或者与SEQIDNO:1所示氨基酸序列同源性在70%以上的基因。本发明另一实施方式，所述基因包含序列表中SEQIDN0:2中所示的核苷酸序列或者与SEQIDN0:2所示氨基酸序列同源性在70%以上的基因。本发明另一方面，一种核酸构建体或携有所述核酸构建体的载体，含编码如权利要求1或2所述蛋白质的基因或者基因片段构建得到的核酸构建体或所述核酸构建体的载体。本发明另一方面，一种利用如编码所述蛋白质的基因产生溶栓蛋白酶基因NKSl的方法，该方法包括以下步骤纳豆激酶基因NKSl的克隆采用PCR扩增法、重组法或人工合成法方法来获得纳豆激酶基因NKSl核苷酸全长序列或其片段；纳豆激酶基因NKSl的DNA改组用于DNA改组的底物为生物体不同个体、株系或种类的纳豆激酶基因制取的不同突变形式的纳豆激酶基因；表达改组文库的构建将含有重组纳豆激酶基因片段的重组基因库转入到一种细胞或生物体内进行筛选；高活性纳豆激酶基因的筛选筛选到的活性显著提高的细菌、酵母、枯草杆菌突变株中提取质粒，从而获得了一个活性非常高的新的纳豆激酶基因。本发明另一实施方式，所述纳豆激酶基因进行DNA改组的主要步骤为首先用DNaseI或限制酶对纳豆激酶基因进行随机片段化，回收其中的小片段即重叠片段；然后在不加引物的情况下，用DNA聚合酶进行I^imerlessPCR使小片段互为引物和模板进行扩增，从而使不同的突变得到广泛的重组；最后经I^rimerPCR扩增得到含有重组纳豆激酶基因片段的重组基因库。本发明另一实施方式，所述表达改组文库的构建步骤中，所述细胞或生物体包括细菌、酵母、枯草杆菌或植物细胞。本发明另一实施方式，所述方法还包括以下步骤，高活性纳豆激酶新基因NKSl的序列分析通过测序来获取所述新的纳豆激酶基因的核苷酸序列，运用生物软件对活性显著提高的所述新的纳豆激酶基因和野生型纳豆激酶基因进行核苷酸序列比对、氨基酸序列比对生物信息学分析。本发明另一方面，所述的溶栓蛋白酶基因NKSl在制备溶栓药物中的应用。本发明的有益效果为，本发明的通过DNA改组技术获得的新的纳豆激酶基因NKSl,此基因编码具有比野生型纳豆激酶基因更强活性的纳豆激酶。利用本发明制备方法生产的新的纳豆激酶酶活非常高，而且应用DNA改组技术在改进纳豆激酶基因及其蛋白质的性能方面，达到了非常显著的效果。图1表示本发明中NKSl新基因编码的氨基酸序列与野生型纳豆激酶基因编码的氨基酸序列的比较图。具体实施例方式本发明的技术方案结合以下附图详细描述如下。实施例1.枯草杆菌纳豆激酶基因NKSl的克隆基因组DNA的提取取IOOml过夜培养的枯草杆菌，4！离心收集菌体，提取高分子量基因组DNA，得到分子量大于501Λ的DNA,A260/A280=1.80，所获得的DNA的纯度与分子量均适合PCR反应。目的基因的PCR扩增和序列分析以基因组DNA为模板进行PCR扩增(5'弓丨物5'CGCTGMTTCATGGCGCMTCTGTTCTT3‘,3'引物5'AGGCGTCGACTTATTGTGCAGCTGCTTG3‘)，30个循环后，将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，在825bp处有一条明显的特异性扩增带。以重组质粒为模板进行测序，结果表明，所克隆的纳豆激酶基因编码区含有825个bp核苷酸，正确编码275个氨基酸，与Nakamum发表的纳豆激酶成熟肽基因序列完全相同。实施例2.NKSl基因的DNA改组1)起始材料的制备以PUC19-NK为模版，用TaqDNA聚合酶对NK进行PCR扩增，纯化后作为DNA改组的起始材料。2)DNaseI随机酶切取约10微克纯化的NK，加入到50微升酶切反应体系中(IOmMTris-HClpH7.4、50mMMnC12)，15°C，lOmin。加入0.15UDNaseI，混勻，15°C，2min,90°C，lOmin.产物通过2.5%琼脂糖凝胶电泳，切下含100_200bp的片段的凝胶并回收。3)无引物PCR取约1微克回收的小片段，加入到50微升反应体系中(IOXPfubuffer,0.2mMeachdNTP，0.6U/微升Pfu聚合酶)。PCR程序为反应条件94°C预变性60s,94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸30s，共40cycles，最后72°C延伸5min。4)有引物PCR取1微升无引物PCR的产物作为模板，用两个引物对重组的NK基因全长序列进行PCR扩增。PCR反应体系为(10XPfu缓冲液，0.2mMeachdNTP，30微米每种引物，0.6UPfu聚合酶)，PCR反应程序为94°C预变性60s，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共30cycles，最后72°C延伸5min。通过DNA改组，获得了含有重组纳豆激酶基因片段的重组基因库。实施例3.表达改组文库的构建重组表达载体构建从含有NKSl基因的pUC19质粒上切下NKSl基因，与经过同样酶切的pET23a质粒以21比例混合后，加T4DNA连接酶于22°C连接4h，连接液转化感受态的ElcoliDH5a细胞，筛选阳性重组子，提取其质粒，并用EcoRIPSalI进行酶切鉴定。活化构建好的工程菌，次日以洲接种量转接于新鲜的LB培养基中，30°C培养至A600=0.81.0,加入IPTG至终浓度为ImM，继续培养4h，离心收集菌体，加入10倍体积的PBS，超声破壁30min，4°C离心IOmin，收集上清，进行SDS-PAGE分析。目的蛋白的分离纯化3L的表达菌，以5000rRiiin离心IOmin，收集菌体，将菌体悬浮于100mlPBS中，冰上超声破菌30min，镜检95%破壁后，IOOOOrPmin离心30min，收集上清，加入(NH4)2S04至60%饱和度，4°C过夜，以6000rRnin离心30min，收集沉淀，用20mMPBS溶解，透析48h，先过DEAE-CelluloseDE-52柱，用20mMPBS(pH7.4)洗脱，收集各峰流出液，用PEG浓缩至5-IOml，再过kphedaxG-100柱，常规洗脱，收集各峰流出液。制成冻干粉。表达产物的活性测定称取aiig纳豆激酶干粉，溶于IOOml生理盐水中，取10μ1样品，采用纤维蛋白平板法测定纯化后的纳豆激酶活性。实施例4.高活性纳豆激酶基因的筛选我们通过对于表达改组文库的筛选，获得了一个纳豆激酶活性比野生基因提高了2倍的新基因。实施例5.高活性纳豆激酶新基因NKSl的序列分析用质粒提取试剂盒提取突变子中的质粒进行DNA测序。用DNAStar,Clustalx和TMpred等软件对高活性纳豆激酶基因和野生型纳豆激酶基因进行核苷酸序列比对、氨基酸序列比对。结果显示，NKSl基因与野生型纳豆激酶基因之间有7个核苷酸的突变，分别发生在第37、2M、320、433、467、515的核苷酸处；此外，788位后面的核苷酸为缺失。权利要求1.一种溶栓蛋白酶基因NKS1，其特征在于其编码由序列表中SEQIDN0:1中所表示的氨基酸序列或者与SEQIDNO:1所示氨基酸序列同源性在70%以上的基因。2.如权利要求1所述的溶栓蛋白酶基因NKS1，其特征在于所述基因包含序列表中SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列或者与SEQIDNO:2所示氨基酸序列同源性在70%以上的基因。3.—种核酸构建体或携有所述核酸构建体的载体，其特征在于含编码如权利要求1或2所述蛋白质的基因或者基因片段构建得到的核酸构建体或所述核酸构建体的载体。4.一种利用如编码权利要求1所述蛋白质的基因产生溶栓蛋白酶基因NKSl的方法，该方法包括以下步骤纳豆激酶基因NKSl的克隆采用PCR扩增法、重组法或人工合成法方法来获得纳豆激酶基因NKSl核苷酸全长序列或其片段；纳豆激酶基因NKSl的DNA改组用于DNA改组的底物为生物体不同个体、株系或种类的纳豆激酶基因制取的不同突变形式的纳豆激酶基因；表达改组文库的构建将含有重组纳豆激酶基因片段的重组基因库转入到一种细胞或生物体内进行筛选；高活性纳豆激酶基因的筛选筛选到的活性显著提高的细菌、酵母、枯草杆菌突变株中提取质粒，从而获得了一个活性非常高的新的纳豆激酶基因。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述纳豆激酶基因进行DNA改组的主要步骤为首先用DNaseI或限制酶对纳豆激酶基因进行随机片段化，回收其中的小片段即重叠片段；然后在不加引物的情况下，用DNA聚合酶进行I^imerlessPCR使小片段互为引物和模板进行扩增，从而使不同的突变得到广泛的重组；最后经I^rimerPCR扩增得到含有重组纳豆激酶基因片段的重组基因库。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述表达改组文库的构建步骤中，所述细胞或生物体包括细菌、酵母、枯草杆菌或植物细胞。7.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法还包括以下步骤，高活性纳豆激酶新基因NKSl的序列分析通过测序来获取所述新的纳豆激酶基因的核苷酸序列，运用生物软件对活性显著提高的所述新的纳豆激酶基因和野生型纳豆激酶基因进行核苷酸序列比对、氨基酸序列比对生物信息学分析。8.如权利要求1至3任一所述的溶栓蛋白酶基因NKSl，其特征在于所述的溶栓蛋白酶基因NKSl在制备溶栓药物中的应用。全文摘要本发明提供了一种溶栓蛋白酶基因NKS1，其编码由序列表中SEQIDNO:1中所表示的氨基酸序列或者与SEQIDNO:1所示氨基酸序列同源性在70%以上的基因。本发明的通过DNA改组技术获得的新的纳豆激酶基因NKS1，此基因编码具有比野生型纳豆激酶基因更强活性的纳豆激酶。文档编号A61K48/00GK102337282SQ20111013590公开日2012年2月1日申请日期2011年5月25日优先权日2011年5月25日发明者夏涛,王沁申请人:夏涛,王沁