原蛋白转化酶2基因在制备治疗癌症药物中的应用的制作方法

文档序号:917632阅读:354来源:国知局
专利名称:原蛋白转化酶2基因在制备治疗癌症药物中的应用的制作方法
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种原蛋白转化酶2基因在制备治疗癌症药物中的应用,特别是治疗人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌症药物中的应用。
背景技术
原蛋白转化酶(Subtilisin-likeProprotein Convertases, SPCs 或 PCs)是一类蛋白内切加工酶,它们介导了与胚胎形成、基因表达、细胞周期、凋 亡和神经内分泌等功能活动的相关前体蛋白的加工和成熟。这些前体蛋白分子的成熟需要涉及多个加工酶的分子加工步骤。目前,这些属于丝氨酸蛋白酶家族的原蛋白转化酶有PCl (或PC1/3),PC2,PC4,Furin,PACE4,PC5/6,PC7,SK1-1和PCSK9等9种。它们在脊椎动物功能细胞中单独或共同表达,在时间和空间上起作用。已经证实,哺乳类原蛋白转化酶与许多疾病相关,如癌症、脑卒中、青光眼等。原蛋白转化酶2 (PC2)广泛地表达在内分泌组织中,在原蛋白加工成熟中伴有基础的角色。Tanaka S等和Sang-Nam L等报道,在高Ca2+、pH5. O和其它原蛋白转化酶存在下,鼠PC2原蛋白(proPC2,637aa/74kDa)裂解成成熟的PC2酶(529aa/64kDa)。在这个加工成熟过程中,proPC2蛋白分子的正确折叠需其分子伴侣7B2蛋白(21kDa)的帮助。文献报道,在人pc2基因(1914bp/638aa)和小鼠pc2基因(1911bp/637aa)之间有96. 55%同源性;在大鼠和小鼠之间,pc2基因有99. 53%同源性,这显示pc2基因在人和鼠之间有极高度保守性。PC2是内肽酶,许多文献报道,前体蛋白的成熟需要PC2作用。神经内分泌肽前体蛋白到成熟通常有三种形式,带有信号肽的前原蛋白(pre-pro-protein),原蛋白(pro-protein)和成熟肽。这些加工过程是由信号肽酶和PCs系统起作用。

发明内容
本发明的第一个目的是提供原蛋白转化酶2基因在制备治疗癌症药物中的应用,特别是在制备治疗人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌症药物中的应用。本发明所述的原蛋白转化酶2基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的第二个目的是提供原蛋白转化酶2在制备治疗癌症药物中的应用,特别是在制备治疗人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌症药物中的应用,所述的原蛋白转化酶2,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2的第109 637位所示。本发明的第三个目的是提供编码原蛋白转化酶2的基因在制备治疗癌症药物中的应用,特别是在制备治疗人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌症药物中的应用。所述的编码原蛋白转化酶2的基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第325 1911位所示。本发明将原蛋白转化酶2基因和7b2基因分别插入表达载体P⑶NA3.1中,形成表达载体PCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2。将重组细菌培养,重组质粒用通用的DNA纯化试剂盒抽提后,通过脂质体介导将P⑶NA3. l-pc2和P⑶NA3.1_7b2重组质粒共转染人肺癌细胞A549、人肝癌细胞H印G2、人乳腺癌细胞MCF、小鼠乳腺癌细胞4T1和小鼠黑色素瘤细胞B16。应用MTT法测定pc2重组质粒对上述癌细胞的半数起效量IC50分别为94. 20,0. 02,8. 11、1.39和2. 23 (μ g/50y I)。由此可见本发明的原蛋白转化酶2基因对人肝癌细胞H印G2、人乳腺癌细胞MCF、小鼠乳腺癌细胞4Τ1和小鼠黑色素瘤细胞Β16具有较好的抑制作用,这显示,pc2基因对人和鼠癌症有同样的效果。因此可以将原蛋白转化酶2基因用于制备治疗人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或黑素瘤等癌症药物中。再通过脂质体介导,将质粒P⑶NA3. l-pc2和p⑶NA3.1_7b2基因共转染小鼠乳腺癌细胞株4T1,结果显示,转染小鼠乳腺癌细胞株4T1具有最高的PC2酶活性和明显的PC2蛋白表达。转染48小时后,培养液中出现大量的悬浮细胞,与相同细胞密度的转染空载体PCDNA3.1的瘤细胞比较,共转染组贴壁细胞明显减少,不同密度瘤细胞的共转染引起相同的凋亡现象。贴壁细胞荧光染色(DAPI)显示,部分癌细胞核裂解成碎块和TUNEL反应阳性, 显示有明显细胞死亡。体内试验显示,通过脂质体介导,将质粒P⑶NA3. 1-PC2和P⑶NA3.1_7b2共转染乳腺癌细胞4T1,转染的瘤细胞接种在雄性BALB/c小鼠腹部皮下(Ex vivo技术),5和15天后,分别测定瘤体积或瘤重,以空质粒P⑶NA3.1转染的乳腺癌细胞4T1接种雄性BALB/c小鼠腹部皮下作为对照。结果显示相同瘤细胞接种5天和15天后,重组质粒共转染组瘤直径比对照组分别减少了 66. 5±7. 4%或66. 2±1. 9%(P〈0. 01),而15天的瘤重仅为对照组的
I1.8%,减少了 88±1. 8%。在雄性BALB/c小鼠腹部皮内接种野生型乳腺癌细胞4T18. 4X IO6个/mm2,2天后,在癌细胞接种部位一次性对角注射各100微升含有重组质粒p⑶NA3. l-pc2和P⑶NA3. l-7b2的脂质体悬液(每个重组质粒15微克,共30微克基因载体/100 μ I)(瘤内注射技术)。继续生长6和8天后,分别测定瘤体积和瘤重。结果显示一次60微克原蛋白转化酶2基因的瘤内注射,与注射等量pCDNA3.1空载体的对照组比较,平均瘤体积缩小了 54. 4±13. 3% (6天)和47. 2±7. 7% (8天),8天平均瘤重仅是对照组的27. 7%,减少了 72.3±0.4%。Ex vivo技术的基因转染组的瘤组织和瘤内注射的瘤组织进行HE染色和PC2、CPE免疫组化分析,显示与P⑶ΝΑ3.1空载体转染的对照组比较,重组基因共转染组细胞出现大量核固缩、碎裂等死亡现象,重组基因瘤内注射出现灶状坏死。PC2免疫组化染色显示,重组基因共转染组的死亡细胞显示了明显高的PC2蛋白表达,瘤内注射组的灶状坏死细胞显示了高的PC2蛋白表达。CPE免疫组织化学染色显示,重组基因转染组的死亡细胞显不了略闻的CPE蛋白表达,瘤内注射组灶状坏死细胞显不了闻的CPE蛋白表达。这些结果显示,癌细胞的PC2基因转染和瘤内注射含质粒P⑶ΝΑ3. l-pc2和ρ⑶ΝΑ3.1_7b2的脂质体悬液可引起明显的癌细胞死亡。以上结果表明,含有原蛋白转化酶2基因的表达载体经脂质体介导转染癌细胞后,在癌细胞中,原蛋白转化酶2基因表达PC2原蛋白前体(pr印roPC2,637aa/84kDa,其序列如SEQ ID NO. 2所示),该原蛋白前体包括信号肽序列SEQ ID NO. 2的第I位到24位所示、原肽序列(Prop印tide)序列SEQ ID NO. 2的25 108位所示和成熟PC2酶序列SEQ IDN0. 2的109 637所示。该PC2原蛋白前体经癌细胞自身转化成PC2原蛋白,后者经过共转基因7b2表达产物7B2分子伴侣的帮助,使PC2原蛋白转化成成熟PC2,最终该成熟PC2蛋白诱导了小鼠乳腺癌细胞4T1死亡。因此,本发明的第四个目的是提供原蛋白转化酶2基因联合7b2基因在制备治疗癌症药物中的应用,特别是在制备治疗人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌症药物中的应用,所述的原蛋白转化酶2基因的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示,所述的7b2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。经过pc2:7b2不同比例优化选择,本文所述的原蛋白转化酶2基因和7b2基因是按照质量比1:1联合使用的。本发明的原蛋白转化酶2基因在小鼠乳腺癌细胞中表达,能够诱导小鼠乳腺癌细胞凋亡,进一步将原蛋白转化酶2基因在人肺癌细胞A549、人肝癌细胞H印G2、人乳腺癌细胞MCF和小鼠黑色素瘤细胞B16中表达,对上述癌细胞具有抑制作用,从而可以将原蛋白转化酶2基因用于制备治疗癌症的药物,特别是治疗人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或黑素瘤等癌症药物中,具有良好的应用前景。


图1是大鼠垂体总RNA的电泳图。泳道I为总RNA,泳道2为DNAmarkers(100-2000bp);图2是原蛋白转化酶2基因扩增产物和连接产物质粒P⑶NA3.1_pc2的电泳图。泳道I为质粒P⑶NA3.1_pc2,泳道2为原蛋白转化酶2基因PCR扩增产物,DNAmarkers(O. 5-lOkb);图3是7b2基因扩增产物的电泳图。泳道I为7b2基因PCR扩增产物,泳道2为DNA markers(100-2000bp);图4是7b2基因重组质粒pCDNA3.1_7b2的电泳图。泳道I为DNAmarkers (O. 5-lOkb),泳道 2 为质粒 pCDNA3.1_pc2,泳道 3 为 pCDNA3.1_7b2 ;图5是原蛋白转化酶2基因在乳腺癌细胞4T1中的蛋白表达的Western blot分析图。泳道I为转染空载体P⑶NA3.1的乳腺癌细胞,泳道2为共转染重组质粒P⑶NA3.1_pc2和P⑶NA3. l-7b2的乳腺癌细胞,对照为β -Actin蛋白;图6是质粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2共转染乳腺癌细胞4T1对体外培养癌细胞生长的影响(光镜,放大倍数10X5)。A :共转染重组质粒P⑶NA3.1_pc2和PCDNA3.1_7b2,转染瘤细胞密度70%,培养48小时;B :转染空质粒pCDNA3.1,转染瘤细胞密度70%,培养48小时;C :共转染重组质粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2,转染瘤细胞密度30%,培养48小时;D :转染空质粒pCDNA3. 1,转染瘤细胞密度30%,培养48小时;图7是重组质粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2共转染乳腺癌细胞4T1的细胞核荧光染色分析(DAPI染色,放大倍数10X20)。A :转染空质粒p⑶NA3.1的瘤细胞;B :转染重组质粒P⑶NA3. l-pc2和P⑶NA3.1_7b2的瘤细胞,箭头显示细胞核破碎和死亡;图8是重组质粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2共转染乳腺癌细胞4T148小时后体外凋亡分析(TUNEL染色,绿色为阳性)。A :转染空质粒P⑶NA3.1的贴壁乳腺癌细胞(放大倍数IOX 15) ;B :共转染重组质粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2的贴壁乳腺癌细胞(放大倍数10 X 15) ;C共转染重组质粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2的悬浮乳腺癌细胞(放大倍数10X10);
图9是体内共转染pc2和7b2基因的乳腺癌组织形态分析(n=4,Ex vivo技术)(细胞接种15天)。共转染组共转染重组质粒P⑶NA3. l-pc2和p⑶NA3.1_7b2的乳腺癌细胞4T18. 4 X IO6个/mm2,对照组转染空质粒p⑶NA3.1的乳腺癌细胞4T18. 4 X IO6个/mm2 ;图10是体内共转染pc2和7b2基因的乳腺癌组织形态分析(n=4,Invivo瘤内注射技术)(细胞接种8天),PBS组注射空载体P⑶NA3.1的脂质体一 PBS溶液(60微克p⑶NA3.1空载体);基因组注射含质粒P⑶NA3. l-pc2和P⑶NA3.1_7b2的脂质体悬液一 PBS溶液(每100 μ L注射液含15微克PCDNA3.1_pc2和15微克pCDNA3.1_7b2基因载体);图11是体内共转染pc2和7b2基因的乳腺癌组织的HE染色分析(放大倍数200),A :转染空质粒pCDNA3.1的乳腺癌组织;B :共转染含质粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2的乳腺癌组织;C :瘤内注射含重组质粒P⑶NA3. l-pc2和P⑶NA3.1_7b2的脂质体悬液的乳腺癌组织,黑色箭头为灶状坏死细胞; 图12是体内共转染pc2和7b2基因的乳腺癌组织的PC2免疫组织化学染色分析(放大倍数400 X,Envision法),A :转染空质粒p⑶NA3.1的乳腺癌组织;B :共转染重组质粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2的乳腺癌组织;C :瘤内注射含重组质粒pCDNA3.1_pc2和P⑶NA3. l-7b2的脂质体悬液的乳腺癌组织,黑色箭头为灶状坏死细胞;图13是体内共转染重组质粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2的乳腺癌组织的CPE免疫组织化学染色分析(放大倍数400 X,Envision法),A :转染空质粒p⑶NA3.1的乳腺癌组织:共转染重组质粒P⑶NA3. l-pc2和p⑶NA3.1_7b2的乳腺癌组织;C :瘤内注射含重组质粒P⑶NA3. l-pc2和P⑶NA3.1_7b2的脂质体悬液的乳腺癌组织,黑色箭头为灶状坏死细胞。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。实施例1:一、大鼠脑垂体总RNA的分离和cDNA的获取将S-D大鼠(购自广州中医药大学)处死并立即将其垂体转移保存于液氮中,用Trizol试剂盒提取大鼠垂体组织的总RNA,其电泳图如图1所示。按照试剂盒说明书的方法将6 μ g的总RNA,用逆转录酶(AMV)制备成双链的总cDNA。二、RT-PCR扩增原蛋白转化酶2基因以总cDNA 为模板,pc2基因克隆的两个引物是上游引物5’ -ggg ^gatccftttttatttgcatcttccctc-3’,其限制性内切酶是 BamHl,下游引物 5’ -aagca aagcnjcagaccaggct-3',其限制性内切酶是HindiII ;7b2基因克隆的两个引物是上游引物5,-GTATGAA IggatccI aatggcctcaaggctggtctctgctatg-3',其限制性内切酶是 BamH I,下游引物 5,-GGCCC IttcgaaI ctttattctgcttccttctcctcttctg-3 ',其限制性内切酶是Hind III。两个PCR的反应体系为18· 6μ I H2O, L 2 μ I含MgCI2的10XPCR缓冲液,各O. 6 μ I (5 μ Μ)的上下游引物,2 μ I (IOmM) dNTP, 2. 4 μ I tag 酶(5U/ μ I)和 O. 6 μ I 总 cDNA模板。pc2基因的PCR反应条件为95° C变性I分钟,55° C退火I分钟,72° C延伸1. 5分钟,循环40次,72° C延伸10分钟,最后4° C保存;7b2基因的PCR反应条件为95° C变性5分钟,95° C变性15秒,55° C退火15秒,72° C延伸I分钟,循环40次,最后4° C保存。将pc2基因的PCR产物1%琼脂糖电泳,其电泳图如图2所示,2号泳道的条带为2133bp,经割胶回收测序验证,其包括原蛋白转化酶2基因5’端的部分非编码区序列tttttatttgcatcttccctcttcttcccctgctccaccaccctgcgcgcctcgcagccccacttttcactcccaaagaagg、原蛋白转化酶2基因表达序列(1914bp,ACCESSI0N NM 012746,其序列如SEQ ID NO.1所示和原蛋白转化酶2基因3’端的部分非编码区序列gccacgcttccgcctccatctccccttcctccctgtctctgcctctccttggtccacagttctggcagccaccacctgttaccctcacacaagcagtcccagcctggtctgaagctt,加上末端设计的内切酶位点,总序列长为2133bp,与电泳图上的条带大小一致。这显示它是严格按原形PC2蛋白表达的。将7b2基因的PCR产物2. 5%琼脂糖电泳,其电泳图如图3所示,7b2基因的PCR产物大小为680bp,经割胶回收测序验证,其包括7b2基因信号肽序列(l_78bp)编码区序列79-636bp、7b2基因序列为636bp [ACCESSION X15830,其序列如SEQ ID NO. 3所示,与电泳图上的条带大小一致。这显示它是严格按原形7B2蛋白表达的。上述基因PCR产物纯化后,用BamHl和Hind III双酶切。载体p⑶NA3.1同样用BamHl和HindIII双酶切。用T4连接酶将pc2和7b2基因分别与载体p⑶NA3.1连接。连接反应为pc2或7b2基因,载体pCDNA3. 1,T4DNA连接酶缓冲液(IOX)和T4DNA连接酶,14°C过夜,具体按T4DNA连接酶的说明书进行操作,由此而获得连接液。转化筛选感受态菌的制备将E. coli BL21 (DE3)单菌落接种于IOml LB培养基,37°C摇菌至OD6tltl为O. 8,8000rpm离心2min收集沉淀菌体,按每毫升菌体加O. lmol/L CaCl2IOO μ I,冰上放置30min,8000rpm离心5min,弃上清,沉淀用相同浓度CaCl2悬浮菌体,100 μ I分装,
4°C保存。转化取连接液I 一 7μ 1,加入100μ I感受态细胞,冰上放置30min,42°C热 激90秒,加入37°C预热的LB培养基1ml,37°C缓慢震摇45min,涂布于氨苄青霉素(Amp+)(100 μ g/ml) LB平板,同时设阴、阳性对照,37 °C过夜。重组菌的筛选将转化菌经Amp+抗性平板筛选后,经原菌PCR扩增,DNA测序和诱导表达等方法筛选阳性克隆。①原菌PCR扩增扩增模板为重组菌落,以W:5’ -ggggaattcggcacgagtttttatttgcatcttccctc-3’ ; F: 5' -aagcaaagcttcagaccaggct-3' 作为引物进行菌落 PCR。扩增产物经琼脂糖电泳,如图2和3所示,在2133bp (pc2基因PCR产物,1%琼脂糖电泳)和680bp (7b2基因PCR产物,2. 5%琼脂糖电泳)位置出现电泳条带之菌落为阳性。②DNA测序原菌扩增的阳性克隆经上海生工公司测序。测序用ABI PRISM377DNASequencer测序仪和PCR引物测序。③PC2蛋白基因的诱导表达将带有pc2基因的工程菌接种在200ml含有Amp+抗性的LB培养基中,经37°C摇瓶培养,待菌密度达到A6tltl = O. 6,加O. 5M乳糖到终浓度50mM诱导6小时。试验中,每过一小时,定量取培养基离心收集菌体,做SDS-PAGE表达分析。挑上述鉴定为阳性的单菌落接种于5ml LB Amp+ (100 μ g/ml)液体培养基,37°C摇管培养重组细菌12h,重组质粒采用通用的DNA纯化试剂盒抽提质粒后,1. 2%琼脂糖电泳筛选,其电泳图如图4所示,从图4中可以看出,具体见泳道2和3,泳道2和3显示的DNA大小与实际的大小相符,再将该质粒进行测序验证,测序结果表明,原蛋白转化酶2基因插入了载体口0)嫩3.1中。同理,构建得到重组质粒pO)NA3.1_7b2,进一步经Western blot技术和PC2酶活性验证,pc2和分子伴侣7b2基因的1:1共转染达到最大PC2酶活力,导致成熟PC2蛋白的明显转活。四、重组pc2基因的表达分析用通用的DNA纯化试剂盒抽提上述重组菌中的质粒P⑶NA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2,将 10 μ I 的质粒溶液(含 5 μ gpCDNA3.1_pc2 和 5 μ g pCDNA3.1_7b2 重组质粒)与180 μ I H2O混合,记为混合液A0将10 μ I的脂质体(Lipofactamine 2000,购自Invitrogen公司)与180 μ I的水混合,记为混合液B。强烈混合混合液A和B 3min,静置30min,得到混合液C。将小鼠乳腺癌细胞4T1种在6孔板中,在37°C和5%C02条件下,在高糖DMEM —血清培养基中培养,待细胞密度达到80%时,弃除DMEM培养液,用不含血清的DMEM培养液冲洗一次。将细胞在无血清的DMEM中培养30分钟后,加入380 μ I混合液C到培养的4Τ1乳腺癌细胞孔中,继续培养16小时后,每孔中加入2ml含血清的DMEM培养液, 在37°C、5%C02条件下继续培养48小时。对照组细胞用空的P⑶NA3.1质粒-脂质体做相同处理。用37°C预热的PBS溶液洗涤每个孔的肿瘤细胞一次,再用冷的PBS温和地悬浮细胞。将悬浮细胞在6000rpm,4°C离心6分钟,收集细胞沉淀。用2mL匀浆器和冻融方法将细胞匀浆。匀浆中使用T-H缓冲液50mM Tris -HCl (pH 7. 5)含l%Triton X-100提取蛋白质,得到含蛋白质的上清液。用Bradford法测定上清液的蛋白质浓度。用SDS - PAGE分离蛋白(150V 2小时,每孔进样30微克蛋白质),将SDS - PAGE胶上的蛋白带转到PVDF膜上(Millipore Co. , USA) (166mA,2. 5h)。用原蛋白转化酶2的抗体检测(ABC0M公司,货号ab28571,以1:1000稀释),用ECL方法(A和B液购自碧云天公司)检测膜上的抗体。以β -Actin为参照。如图5所示,泳道I表示的是转染空质粒P⑶ΝΑ3.1的乳腺癌细胞4Τ1,泳道2表示的是转染重组质粒PCDNA3. l-pc2和pCDNA3.1_7b2的乳腺癌细胞4T1,对照为β -actin蛋白。从图5可以看出,乳腺癌细胞4T1转染质粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2后,表达出74kDa(proPC2)和64kDa(成熟PC2)的蛋白质,这与PC2的蛋白大小是一致的。五、原蛋白转化酶2酶活性分析用上述转染方法转染pCDNA3. l-pc2和pCDNA3.1_7b2的乳腺癌细胞4T1或对照或单独转染P⑶NA3. 1-PC2的乳腺癌细胞4T1,先用37°C保温过的PBS洗涤每个孔的肿瘤细胞一次,再用冷的PBS温和地悬浮细胞。将悬浮细胞在6000rpm,4°C离心6分钟,收集细胞沉淀。用 2mL 匀浆器,将乳腺癌细胞 4T1 用 50mM Tris-HCl [pH 7. 5,l%Triton X-100,10% 甘油和蛋白酶抑制剂匀浆。将匀浆液冻融一次,涡漩振荡破坏细胞,4°C和10,OOOXg离心10分钟,收集蛋白上清液。将含有10微克蛋白的上清与200 μ M的l-pyroglutamyl_Arg-Thr-Lys-Arg-7-amino-4-methyl-coumarin 底物 37°C保温,反应体积 100 微升,反应缓冲液为终浓度IOOmM的醋酸钠(pH 5. O)和ImM CaCl2, 37°C保温4小时。对照管加入2μΜ终浓度的PC2酶特异性抑制剂CT肽(SVNPYLQGKRLDNVVAKK)。PC2酶活性通过测定游离的7-amino-4-methylcoumarin 量来石角定,7-amino-4_methylcoumarin 的释放量使用 SpectraMax GEMINI荧光比色计(Molecular Devices公司)测得(激发波长是360nm,散射波长是480nm)。原蛋白转化酶2的酶活性分析的结果如表I所示表1:转染Pc2基因的乳腺癌细胞4T1的原蛋白转化酶2酶活性分析
权利要求
1.原蛋白转化酶2基因在制备治疗癌症药物中的应用,所述的原蛋白转化酶2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的癌症为人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤。
3.原蛋白转化酶2在制备治疗癌症药物中的应用,所述的原蛋白转化酶2的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2的第109 637位所示。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的癌症为人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤。
5.编码权利要求3所述的原蛋白转化酶2的基因序列在制备治疗癌症药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述的癌症为人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤。
7.根据权利要求5或6所述的应用,其特征在于,所述的编码原蛋白转化酶2的基因序列,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第325 1911位所示。
8.权利要求1所述的原蛋白转化酶2基因联合7b2基因在制备治疗癌症药物中的应用,所述的7b2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述的癌症为人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤。
10.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述的原蛋白转化酶2基因和7b2基因是按照质量比1:1联合使用的。
全文摘要
本发明公开了一种原蛋白转化酶2基因在制备治疗癌症药物中的应用。原蛋白转化酶2基因在制备治疗癌症药物中的应用,特别是治疗人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或黑素瘤等癌症的药物,所述的原蛋白转化酶2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。原蛋白转化酶2在制备治疗癌症药物中的应用,特别是治疗人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或黑素瘤等癌症的药物,所述的原蛋白转化酶2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2的第109~637位所示。本发明的原蛋白转化酶2基因能用于制备治疗癌症的药物,特别是治疗人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或鼠乳腺癌或黑素瘤等癌症药物中,具有良好的应用前景。
文档编号A61K48/00GK102989008SQ20121034175
公开日2013年3月27日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年7月11日
发明者唐松山, 吴文峰, 李红枝, 李谦, 张娟辉, 周东 申请人:广东药学院
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