专利名称：用于治疗癌症的当归萃取物的制作方法
技术领域：
本发明是关于当归(Angelicae sinesis)萃取物，特别是关于当归的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物，以及由其所纯化的活性成份在癌症治疗的新用途。
背景技术：
癌症是不正常的细胞增生，起因于细胞中基因变化的累积而赋予增生潜能。癌症治疗主要是手术、化学疗法、放射疗法及近来的免疫疗法。然而，对于治疗及预防癌症仍需要进一步的研究。
当归(Angelicae sinensis；Dangqui)是传统中国医药处方中最常使用的药物之一。当归的传统用途包括促进血液制造、保护肝脏、降低血压、杀菌、缓解妇女月经不正常的疼痛以及降低血胆固醇(Chinese Herbs，Shanghai Science and Technology Publication，Inc.Shanghai，China，Vol.5，p.893，1999)。
中国专利CN1053747揭示了制备伞科植物当归(Angelicae sinensis(Oliv)Diels、ASD)及ASDP与ASDE作为佐剂的有效成份，且可使用作为遗传重组B型肝炎疫苗的免疫佐剂。在CN1109356中报导由当归(Angelicae sinensis(Oliv)Diels、ASD)萃取的有效成份内酯类(ASDE)，可增强免疫抗原性(immunogenicity)及降低毒性，可作为免疫佐剂。Kumazawa等人提供由当归的水萃取物分离的免疫刺激性多醣类，由于其抗肿瘤活性而在带有艾氏腹水细胞的老鼠中，观察到存活期间的延长，可作为具有潜力的佐剂(Y.Kumazawa等人，Immunology，Vol.47，p.75，1982)。然而，先前技术文献仅提供由当归分离的多醣类，经由其免疫刺激活性，在癌症治疗的一般性叙述，关于机制并无充足的证据。
发明内容
本发明提供当归的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物，以及由其所纯化的成分，例如正-亚丁基苯酞(n-butylidenephthalide；BP)，可有效抑制癌细胞的端粒酶(Telomerase)活性，且进一步诱发其细胞凋亡而可使用于治疗恶性肿瘤(malignant neoplasms)。因此，当归的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物，以及由其所纯化的成分，例如正-亚丁基苯酞，有潜力于制造癌症治疗的医药品，且可经由其于细胞周期调节与端粒酶抑制性的活性，与化疗药物组合使用。
因此，本发明的一目的是提供于肿瘤组织中，抑制癌细胞增生及移转的方法。
本发明的另一目的是提供抑制癌细胞端粒酶活性的方法。
本发明的又一目的是提供诱发癌细胞凋亡(apoptosis)的方法。
本发明的再一目的是提供当归的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物，以及由其所纯化的成分，例如正-亚丁基苯酞，用于制造癌症治疗医药品之用途，以及经由其于细胞周期调节与端粒酶抑制性的活性，与化疗药物组合作为佐剂。
图1为细胞周期分析的结果图，显示以70μg/ml AS-C(当归的氯仿萃取物)，处理GBM细胞(DBTRG-05M)(*p＜0.05)，增加细胞周期累积于G0/G1时期(＞90％)，而同时减少S时期。在G5T/VGH细胞也显示相同结果(图未标)。
图2是5至800μM的BP(正-亚丁基苯酞)诱发GBM肿瘤细胞(DBTRG-05MG)凋亡的效果图，是以TUNEL方法计算，使用碘化丙啶(propidium iodide)作为计数染色剂(*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005)。
图3a至图3c为AS-C诱发的凋亡途径的分析结果图，70μg/ml(其中是使用DBTRG-05MG细胞株)。
图3d至图3f为BP诱发的凋亡途径的分析结果图，400μM(其中是使用DBTRG-05MG细胞株)。
图4为AS-C处理(500mg/kg)带有皮下GBM肿瘤(RG-2)的老鼠的肿瘤尺寸的抑制效果图(p＜0.05)。
图5显示经AS-C处理的老鼠的存活率(剂量-500mg/kg)显著延长(p＜0.0001)(与对照组相比)，其中是使用DBTRG-05MG细胞株。
图6显示AS-C处理(500mg/kg)老鼠原位GBM肿瘤(RG2)体积的生长的抑制效果(*p＜0.05，**p＜0.001)。
图7显示AS-C处理(500mg/kg由腹腔或皮下投药)老鼠移植肿瘤生长的抑制效果(p＜0.005)，其中是使用DBTRG-05MG细胞株。
图8显示BP处理(300mg/kg)老鼠原位GBM肿瘤(RG2)体积的抑制效果，使用回波平面造影功能，以MRI成像计算(*p＜0.05，**p＜0.001)。
图9显示不同剂量BP处理(70至800mg/kg)老鼠移植肿瘤生长的抑制效果(p＜0.005)，其中是使用DBTRG-05MG细胞株。
图10显示BP处理(70至800mg/kg)带有移植肿瘤(皮下DBTRG-05MG)的裸鼠存活期间的延长效果(p＜0.001)。
具体实施例方式
本发明提供当归的有机溶剂萃取物，由其所纯化的成分，例如正-亚丁基苯酞(BP)，可抑制癌细胞端粒酶活性且进一步诱发癌细胞凋亡。因此，它可抑制癌细胞增生且可用于癌症治疗。
当归萃取物的制备当归(Angelicae sinensis；Dangqui)长时间以来用于血液疾病与女性疾病。一般是使用属于伞科(family of Umbelliferae)当归(Angelicaesinensis(Oliv)Diels)的干燥根部。Angelicae sinensis(后文简称为AS)是此项技术领域中通常知识。已知有多种技术用以萃取、单离、及/或纯化Angelicae sinensis的个别活性成分。Angelicae sinensis的有机溶剂萃取物可由此项技术领域中惯用的任何标准程序获得。根据本发明，Angelicae sinensis是用丙酮、氯仿或己烷类萃取。本发明的具体例中，Angelicae sinensis的经干燥及粉末化的根茎部分(rhizomes)，使用丙酮作为溶剂萃取，制得萃取物为AS-A。再者，AS-A进一步使用氯仿萃取，制得萃取物为AS-C；且AS-A进一步使用己烷类萃取，制得萃取物AS-H。
活性成分的纯化Angelicae sinensis的活性成分可使用任何现有技术，由Angelicaesinensis的有机溶剂萃取物中单离及/或纯化。该活性成分可由任何形式的Angelicae sinensis中纯化，特别是根茎部分。可用于进一步纯化的技术包括过滤、选择性沉淀、使用有机溶剂萃取、使用水性溶剂萃取、管柱层析、高效液相层析(HPLC)等。根据本发明，由Angelicae sinensis的有机溶剂萃取物中纯化某些活性成分，例如蒿本内酯(ligustilide)及正-亚丁基苯酞(n-butylidenephthalide)，该活性成分可诱发肿瘤细胞凋亡(apoptosis)。本发明的一具体例中，正-亚丁基苯酞(BP)的E-及Z-几何异构物使用管柱层析加以单离且使用HPLC及NMR加以特征化。
癌症治疗机制端粒(telomeres)，为真核染色体的末端，是维持基因体完整性所必需且在细胞成熟(aging)及不死亡(immortality)扮演重要角色(N.W.Kim，M.A.Piatyszek，K.R.Prowse，C.B.Harley，M.D.West，P.L.C.Ho，G.M.Coviello，W.E.Wright，S.L.Weinrich，J.W.Shay，Science，266，2011-2015(1994))。端粒长度及其减少速率在器官与个体中多有变化。人类与老鼠的端粒长度有大的染色体内变化(large interchromosomalvariation)且单一染色体端粒的短少可导致异常的染色体分离(chromosomal segregation)(L.L.Sandell，V.A.Zakian，Cell，75，729-739(1993))。因此，结论为端粒长度变化的调控与维持在癌症发展中扮演重要角色。显然地，细胞具有对抗端粒重要的减短及异常延伸两者的保护系统。已确定端粒酶为端粒长度的调控者之一(G.B.Morin，Cell，59，521-529(1989))。因此，具有选择性抑制端粒酶活性的任何化合物或物质，可抑制肿瘤生长且因此进一步诱发肿瘤细胞的细胞凋亡。
细胞凋亡是癌症治疗的另一机制，已成为细胞生物学研究的最新领域。
细胞凋亡进程的活化是由来自细胞内及细胞外刺激的多种信号调控。事实上，近年来的证据开始累积，多个(或全部)癌症化疗剂借由推进细胞凋亡的机制杀死肿瘤细胞。期望与细胞凋亡相关的新药能更有效对抗具有高增生速率的肿瘤。已筛选许多该候选者用于癌症治疗(Ricardo Pe’rez-Toma’s*，Beatriz Montaner，Esther Llagostera，VanessaSoto-Cerrato.Biochemical Pharmacology，66，1447-1452(2003))。
细胞凋亡由两个通常使用的终点分析检测细胞的形态改变(核染色质的浓缩、细胞凋亡体的形成)以及DNA片段化为大片段(300至50kbp)且而后成为寡核体长度的片段(oligonucleosomesizedfragment)(多个200bp)，其在琼脂胶电泳呈现DNA带的「阶梯」(ladder)。虽然该终点的观测为细胞凋亡的指示，但无法由该分析去定量族群中凋亡细胞的百分比。为此，本发明在固定细胞中添加荧光-生物素化核苷至DNA片段的终点过程期间，也采用TUNEL分析(Jacques Piettea，*，Ce’dric Volantia，Annelies Vantieghemb，Jean-Yves Yvette Habrakena，Patrizia Agostinis.Biochemical Pharmacology，66，1651-1659(2003))。
对于药物诱发的细胞凋亡的受体及粒线体途径的相关分部已成为争论的主题。取决于毒性药物本身的种类、剂量及动力学或介于特定细胞种类间的差异，其影响依赖于Fas/FasL途径中信号的细胞种类。
细胞凋亡途径可由不同点起始，例如细胞膜，经由死亡受体条节信号(受体途径；Fas/FasL/caspase-8/caspase-3途径)，粒线体(粒线体途径；Bax/AIF/caspase-9/caspase-3途径)及细胞周期调控(包括p53、Rb肿瘤抑制剂、p16及p21周期素(cyclin)激酶抑制剂及周期素/cdk细胞周期确认点)(Simone Fulda，Matroulea，Klaus-Micheal Debatin.CancerLetter，197，131-135(2003))。
已有文献报导，Angelicae sinensis的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物及其活性成分具有抗心绞痛(angina)、抗凝集及在心血管系统的特定其它活性。
本发明人惊讶地在本发明中发现Angelicae sinensis的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物，由其纯化的活性物质例如正-亚丁基苯酞，具有抗癌症活性。
根据本发明，多种癌细胞株的生长是用以测试Angelicae sinensis的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物，由其纯化的活性物质例如正-亚丁基苯酞。发现其等对癌细胞为毒性；其等抑制癌细胞的端粒酶活性(如图7所示)；其等压抑癌细胞增生(如图2所示)及其等也可诱发癌细胞凋亡(图3及图4所示)。再者，动物研究也显示其等有效于压抑癌细胞生长(如图5及图6所示)。因此其等有潜力用以治疗癌症，特别是人类恶性神经胶母细胞瘤(malignant glioblastoma)、结肠直肠癌、血癌、神经母细胞瘤、肝癌、乳癌、卵巢癌及肺癌。
医药组成物本发明的Angelicae sinensis的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物、由其纯化的活性成分及衍生物，可依照任何现有的投药途径予以投药，该投药途径包括但不限于经口腔、非经肠的、腹腔的(ip)、静脉内的(iv)、肌肉内的(im)、皮下的(sc)、经肺的、穿皮的、经颊的、经鼻的、舌下的、经眼的、经直肠的、经阴道的或其它途径。熟习此项技术者应可轻易辨明提供所要治疗效果的投药的任何剂量及频率皆适用于本发明。在一具体例中，其等可使用现有药物或食品递送所使用的方法而经口递送。
在治疗投药目的，Angelicae sinensis的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物、由其纯化的活性成分及衍生物，取决于投药途径，其形式可以是锭剂、丸剂、胶囊、粒剂、凝胶、粉剂、无菌非经肠式溶液或悬浮液、定量喷雾或液体喷雾、栓剂。为制备本发明的医药组成物，Angelicae sinensis的有机萃取物、由其纯化的活性成分或衍生物，可根据现有医药组合技术与医药可接受载剂混合，其中该载剂取决于所要投药的制剂形式而可有宽广范围的形式。合适的医药可接受载剂为此项技术领域中所熟知。某些医药可接受载剂的处方可见于由美国医药协会及英国医药协会(American Pharmaceutical Association and thePharmaceutical Society of Great Britain)出版的医药赋形剂手册(TheHand Book of Pharmaceutical Excipients)中。举例而言，锭剂、胶囊、凝胶、溶液或悬浮液也可包括下述成分医药可接受赋形剂或载剂，其为无毒性、惰性固体或半固体、稀释剂、封装物质(encapsulatingmaterial)、凝胶基剂或任何形式的配方佐剂。溶液及悬浮液可含有佐剂，例如注射水、生理盐水、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇或其它合成溶剂；蛋白质例如血清白蛋白以增加溶解度；抗菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯(methyl parabens)；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；缓冲液例如醋酸盐类、柠檬酸盐类或磷酸盐类及用以调整等张性的试剂例如氯化钠或右旋糖。溶液或悬浮液制剂可密封于安瓿、抛弃式注射器或玻璃或塑料制的多剂量小瓶。
本发明的Angelicae sinensis的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物、由其纯化的活性成分及衍生物，也可作为佐剂与化疗药物例如放线菌素(actinomycin)、阿霉素(adriamycin)、Ara-C、平阳霉素(bleomycin)、卡姆斯丁(carmustin)、顺铂(cisplatin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、柔红霉素(daunomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、紫杉醇(taxol)、长春碱(vinblastine)等并用。
本发明的Angelicae sinensis的丙酮萃取物、氯仿萃取物或己烷萃取物、由其纯化的活性成分及衍生物，也可使用熟习此项技术者已知的任何技术调配为任何膳食组成物。
下列实施例仅用以详细说明本发明但不意味限制本发明的范畴。
方法与材料Angelicae sinensis萃取物及化合物的制备Angelicae sinensis(Oliv.)的根茎部由Chung-Yuan公司(中国台湾)提供且经Han-Ching Lin教授鉴定。植物切片的证据样本存放于国防医学院药学系。Angelicae sinensis的经干燥及粉末化的根茎部(12kg)使用丙酮(24L/次)萃取3次制得丙酮萃取物，名为AS-A。AS-A接着进行氯仿(24L/次)萃取3次。后者萃取物在减压下浓缩产生31.67g氯仿萃取物(来自100g丙酮萃取物)，名为AS-C。使用己烷萃取AS-A获得己烷萃取物(AS-H)。正-亚丁基苯酞(BP)由Lancaster Synthesis公司(Newgate，Morecambe，UK)购得且使用时未进一步纯化。BP的E-及Z-型使用管柱层析单离且使用HPLC及NMR特征化。将其等溶解于DMSO，于25℃震荡培养1小时，在各体外试验前储存于4℃。
体外细胞增生分析人类脐带血管内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cells；HUVECs)由Cascade Biologics公司(USA)购得。HUVECs维持于补充有10％胎牛血清(FBSGibco BRL)及低血生长补充物(LSGSCascadeBiologics公司，USA)的Medium 200(Cascade Biologics公司，USA)。人类皮肤纤维母细胞(human dermal fibroblasts；HDFs)由CascadeBiologics公司(USA)购得。HDFs维持于补充有10％FBS及低血生长补充物(LSGSCascade Biologics公司，USA)的Medium 106(CascadeBiologics公司，USA)。人类结肠腺癌细胞株HT-29由ATCC(Manassas，VA，USA)购得。HT-29维持于补充有10％FBS及100ng/ml青霉素及100ng/ml链霉素(Life Technologies公司，Grand Island，NY，USA)的Dubecco’s Modified Eagle Medium(DMEM；Gibco)。将细胞在60至80％密集度时回收，进行于对数生长(G1)细胞的增生分析。将100μl细胞悬浮液分注到Falcon 96孔盘。密度为6×103细胞/孔于Medium200(对HUVECs)、9×103细胞/孔于Medium106(对HDFs)以及5×103细胞/孔于DMEM(对HT-29)补充10％FBS。在培养箱(潮湿大气，例如37℃，5％CO2)预培养细胞24小时。添加各种浓度的毒性物10μl至盘的培养基中。细胞培养48小时。添加10μl的细胞计数套组-8(CellCounting Kit-8；CCK-8；DOJNDO)溶液且在培养箱中培养细胞1至4小时。使用微孔盘测定仪，在600nm或更长的参考波长，测定450nm的吸收度。
由HUVECs抽取RNA使用改良的异氰酸胍(guanidium isothiocyanate)(Trizol；Invitrogen)方法，由培养的基质细胞抽取总RNA。
均质化借由添加1ml trizol试剂至3.5cm直径孔中，将细胞直接于6孔培养盘中溶解，且将细胞溶解物通过吸管(pipette)数次。
相分离均质化的样品在15至30℃培养5分钟，使核蛋白复合体(nucleoprotein complexes)完全解离。而后，每1ml trizol试剂添加0.2ml氯仿(Riedel-de-han)。将样品瓶严密封套。样品瓶用手剧烈震荡15秒且在15至30℃培养2至3分钟。样品在不超过12,000×g下，在2至8℃离心15分钟。离心后，混合物酚为下层红色的酚-氯仿相、中间相(interphase)以及无色的上层水相。RNA独有地保留在水相。
RNA沉淀将水相移到干净瓶中。水相与异丙醇(Fluka)混合沉淀RNA。在起始均质化所添加的Trizol试剂每1ml添加0.5ml异丙醇。样品在15至30℃培养10分钟后在不超过12,000×g下，在2至8℃离心10分钟。
RNA清洗移除上清液。使用75％酒精清洗RNA沉淀一次，在起始均质化所添加的Trizol试剂每1ml使用至少1ml的75％酒精。震荡混合样品且在不超过7,500×g下，在2至8℃离心5分钟。
再溶解RNA移除上清液后，干燥RNA小粒。溶解RNA在无RNase的水中，且在55至60℃培养10分钟。RNA储存于-70℃。
细胞株测试人类肿瘤细胞株(MCF-7、CL1-5、HT-29、Caco-2)、人类脐带血管内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cells；HUVECs)及人类皮肤纤维母细胞(human dermal fibroblasts；HDFs)对Angelicaesinensis萃取物、蒿本内酯(ligustilide)、正-亚丁基苯酞(n-butylidenephthalide)及其衍生物的敏感度。将DBTRG-05MG，BCM，HL-60及J5细胞，在37℃供给5％CO2的潮湿大气下，生长在含有10％胎牛血清及100ng/ml氢霉素及100ng/ml链霉素的RPMI-1640培养基。将G5T/VGH、RG2、N18、SVEC及Balb/3T3细胞，在37℃供给5％CO2的潮湿大气下，生长在含有10％胎牛血清及100ng/ml氢霉素及100ng/ml链霉素的DMEM培养基。在各试验前，使用PCR筛检法排除受霉浆菌(mycoplasma)感染的培养细胞。
实施例1-细胞毒性的分析以不同浓度的Angelicae sinensis萃取物或由其纯化的活性成分处理对细胞存活的效果，以三重复的MTT分析进行评估。简言之，将细胞(5×103)培养至含有100μl生长培养基的96-孔盘。使细胞附着24小时后，使用100μl的溶解于培养基的植物萃取物或活性成分进行处理。对照组含有≤0.02％(v/v)的DMSO。培养24、48及72小时后，含有药物的培养基以50μl新鲜培养基置换，且在各孔的细胞在50μl的400μg/ml MTT培养6至8小时。而后移除培养基及MTT且在各孔及对照组中添加100μl的DMSO以溶解可溶解成分。以MRX微量滴定盘冷光仪(DYNEX，USA)测定溶液在550nm的吸收度。未进行处理的细胞的吸收度视为100％。评估萃取物或活性成分对于GBM细胞生长速率的影响，5×103个指数生长细胞以不同浓度处理24、48及72小时。各测试物质的细胞毒性以IC50质测定，其代表引起50％抑制性所需的药物浓度。本研究的所有试验均为三重复。
表1.不同Angelicae sinensis有机溶剂萃取物、BP及其衍生物在不同细胞株的细胞毒性(IC50)
HUVEC人类脐带血管内皮细胞HDF人类皮肤纤维母细胞Caco-2人类结肠腺癌细胞MCF-7人类乳癌细胞RG2老鼠恶性神经胶质瘤(rat malignant glioma)表2.Angelicae sinensis的有机溶剂萃取物及BP在不同细胞株的细胞株之细胞毒性(IC50)
A549、AT12人类肺腺癌细胞株(AT12及AT549为抗-紫杉醇次选殖株)J5人类肝癌细胞株HCT15人类结肠腺癌细胞株HT-29人类结肠腺癌细胞株CL1-5人类肺腺癌
DBTRG-05MG人类多形性神经胶质母细胞瘤细胞株G5T/VGH人类多形性神经胶质母细胞瘤细胞株N18神经母细胞瘤BCM人类乳癌HL-60人类前骨髓性血癌细胞RG2老鼠恶性神经胶质瘤SVECSV40转移老鼠淋巴结内皮细胞Balb/3T3老鼠纤维母细胞表3.HUVEC的ETS-1、MMP-2、细胞移转(migration)及管形成(tubeformation)的测试结果
与正常细胞(HUVEC及HDF)相比，正-亚丁基苯酞(BP)及当归萃取物(AS-A、AS-C、AS-H)对人类肿瘤细胞株(表1及表2)一般皆显示较低的IC50值。尤其是BP对人类脑肿瘤细胞显示强的细胞毒性效果。BP也对两个抗紫杉醇的人类肺腺癌细胞、人类肝癌细胞及人类结肠腺癌细胞具有毒性。
AS-C及BP对脑肿瘤细胞株的IC50分别为35至60μg/ml及1.4至10μg/ml，对正常细胞株(HDF)为85至300μg/ml(p＜0.0001)。
在正常细胞中，血管内皮细胞(IC50＝44.2±0.1μg/ml)比纤维母细胞(IC50＝85.1μg/ml)对AS-C较敏感(p＜0.05)。
也测试卡姆斯丁(carmustin)(BCNU)及紫杉醇的抑制效果。结果显示GBM肿瘤对卡姆斯丁并不敏感(IC50＞100μg/ml)，但DBTRG-05MG及G5T/VGH GBM细胞对紫杉醇敏感(分别为IC50＝61.0±3.3μg/ml及IC50＜0.1μg/ml)。然而，紫杉醇在血管内皮细胞引发非常高的细胞毒性(IC50＜0.1μg/ml)，大大高于由AS-C及BP所引发的。用AS-C或BP处理后，可在72小时期间内于不同时间点，观察到GBM细胞(DBTRG-05MG)脱离且漂浮于培养基。GBM细胞脱离及漂浮的细胞量随时间增加，且随着剂量增加(在BP的情况中，于3小时观察到)。
在进行AS-C或BP处理后的GBM细胞脱离及漂浮可归因于肿瘤细胞的型态改变。在上述试验中，使用BCUN(卡姆斯丁)作为系统对照。
实施例2在GBM细胞中，AS-C与BP增加细胞周期停止于G0/G1时期脑肿瘤细胞株DBTRG-05MG及G5T/VGH与稀释剂培养在生长培养基。在各测试组及对照组，添加DMSO且含量低于0.02％(v/v)。在AS-C及BP的处理中，分别添加70μg/ml的AS-C及400μM的BP。将所有样品培养48小时。细胞周期分布的分析是使用碘化丙啶(propidium iodide；PI)将DNA染色进行。简言之，用胰蛋白？使2×106个细胞脱离(detachment)。离心脱离的细胞及漂浮死亡的细胞且以10ml的冷1×PBS(Life Technologies公司)清洗二次。吸取上清液，将细胞还悬浮于0.8ml的1×PBS后，添加200μl的PI溶液(50μg/mlPI+0.05mg/ml RNase A；Sigma Chemical公司)，将细胞于4℃冷藏隔夜。在DNA分析前，细胞至少避光于室温2小时。染色后，使用FACScan(Becton Dicklinson Immunocytometry System，San Jose，California，USA)及CellQuest分析软件在20,000总细胞数中检测及定量DNA。G0/G1时期设闸于M1(×2)；G2/M时期设闸于M2(×2)；总细胞设闸于M3；S时期为M3-(M1(×2)+M2(×2))；次G1时期(凋亡细胞)设闸于M4。
细胞周期分析显示，在GBM细胞中，70μg/ml的AS-C及400μM的BP增加细胞周期累积于G0/G1时期(＞90％)。图1显示在AS-C处理12小时至48小时后，显著增加细胞周期累积在G0/G1时期同时减少S时期(p＜0.05，p＜0.005)。
实施例3AS-C及BP诱发GBM细胞凋亡凋亡细胞的死亡是使用原位细胞死亡检测套组(In Situ Cell DeathDetection Kit，POD(Roche，Germany))分析。DNA染色质的型态特征的变化是使用于定量。操作步骤是根据制造商的指示进行。简言之，将细胞培养在培养皿且分别以AS-C(70μg/ml)及BP(5至800μg/ml)处理72小时后分析。在AS-C及BP处理组中，收集悬浮细胞。在对照组中，收集脱离及漂浮细胞。尔后，在室温下，在生理盐水包复的载玻片上，使用3.7％甲醛固定细胞15分钟，以1×PBS清洗一次后，且以3％H2O2降低内生性过氧化？的活性后培养于冷渗透溶液(permeabilization solution；0.1％Triton X-100+0.1％柠檬酸钠)。细胞以1×PBS再清洗一次后，于37℃下，与原位末端标记法(terminaldeoxynucleiotidyl transferase(TdT)-介导的dUTP缺口标示(nickslabeling)(TUNEL)反应混合物培养60分钟。之后，细胞以1×PBS清洗一次，使用碘化丙啶(PI)复染(counterstain)以进行细胞计数。在凋亡的定量中，结果以荧光显微镜(Nikon，Kawasaki，Japan)审视。
当与未处理的细胞相比时，几乎所有在AS-C及BP处理组的GBM细胞都发现有进行中的凋亡。以AS-C处理的细胞凋亡由荧光显微镜检测(400x)，使用原位TUNEL染色及点化丙啶细胞复染，且明在视野下观察。同样地，在GBM细胞中，BP诱发的细胞凋亡是使用TUNEL方法及使用碘化丙啶作为复染剂而估算。在估算前，GBM细胞暴露至BP(5至800μM)48小时。结果示于图2。可发现，与未处理的细胞相比(对照组)，在BP处理组的GBM细胞的凋亡率较高。
实施例4AS-C及BP经由多个代谢途径诱发细胞凋亡细胞凋亡分子的西方墨点分析DBTRG-05MG细胞(人类GBM细胞)使用AS-C(70μg/ml)处理0、6、12、24及48小时。在另一测试中，DBTRG-05MG细胞使用BP(400μM)处理0、1.5、3、6、12、24及48小时。细胞小粒(cell pellets)还悬浮在溶解缓冲液(10nM Tris-HCl，pH7.5，1mM EGTA，0.5％CHAPS，10％(v/v)甘油，5mM β-2-巯乙醇及0.1mM苯基甲基磺酰基氟化物)且在冰上培养30分钟后，在4℃下，13000×rpm离心20分钟。使用BCA蛋白质分析套组(Pierce，Rockford，IL)，根据制造商的指示测定全细胞溶解物的蛋白质浓度。细胞溶解物(20μg/lane)在10至12％的SDS-PAGE(Bio-Rad，Hercules，CA)进行电泳。转移蛋白质至聚伸乙烯基氟化物(PVDF)膜(Amersham Lifesciences，Piscataway，NJ)。在室温下，使用5％脱脂牛奶作为封阻剂(blocking agent)遮蔽该膜1小时后，在室温下，分别与下述抗体培养2小时Fas(FL-335)、Fas-L(C-178)、caspase3(H-277)、caspase 8(H-134)、caspase 9(H-170)、Bax(B-9)、p16(F-12)、p21(F-5)、p53(DO-1；1/100稀释)(Santa Cruz Biotechnology公司，CA，USA)、phospho-p53(Ser15；1/2000稀释)及phospho-Rb(Ser795；1/2000稀释)(Cell signaling Technology，MA，USA)。检测抗体识别，是将膜分别与结合有(conjugated)辣根过氧化酶(horseradish peroxidase)的抗-老鼠、抗-兔子、抗-山羊的IgG二级抗体(1/1000稀释；Santa CruzBiotechnology公司，CA，USA)，在室温培养1小时，且使用ECL Plus化学冷光系统(Amersham，Arlington Heights，IL)识别。对于每一测试样品，作为系统对照组的SDS-PAGE胶体皆为二重复制备，含有同量蛋白质；并使用科麻西蓝(comassie blue)染色该对照组电泳胶。另一电泳胶则用于西方墨点分析法。带(band)的强度是使用GS-800 CalibratedImaging Densitometer(Quantity One 4.0.3软件；Bio-Rad)以密度测定法分析。结果显示，AS-C显著增加GBM细胞的Fas表现(1至159倍)，对Fas-L则无影响。此外，检测死亡受体诱发的凋亡相关的caspase-8的活化。结果显示procaspase-8的量，在AS-C处理6小时后，仅些微增加，活化的caspase-8的量，在AS-C处理6小时后，大幅增加(参见图3A)。
测定p53及Rb蛋白质的磷酸化作用且结果显示AS-C在处理6小时后增加磷酸化的p53蛋白质。再者，总p53蛋白质量在6小时增加之后逐渐减低。然而，磷酸化的Rb蛋白质在6小时减低，且在AS-C处理12小时后成为无法检测。该结果显示，AS-C可启动踪细胞周期确认点机制。依序测定在AS-C处理的GBM细胞中，p16、p21及Bax的量，且发现所有该三种蛋白质在AS-C处理后皆增加(参照图3B)。
最后，也测定procaspase-9及procaspase-3的活化。在AS-C处理6小时后，procaspase-9及procaspase-3二者皆大幅活化。
在BP的情况中，结果显示BP 400μM大幅增加Fas的表现(由1.5小时5.2倍至48小时27.9倍)，压抑Fas配位体于GBM细胞的表现(参照图3d)。
也发现BP增加caspase-8的活化，在48小时增加至137.9，但procaspase-8减低(参照图3d)。
在BP-诱发细胞凋亡的粒线体途径的角色研究中，显示BP诱发Bax及AIF的表现，其分别在48小时增加16倍及2.4倍，且活化的caspase-9在48小时增加25.8倍而procaspase-9减低(参照图3e)。也发现caspase-3增加而procaspase-3减低(参照图3d)。
在BP-诱发细胞凋亡的细胞周期途径的角色研究中，显示BP增加p53、p21及p16的表现，其在48小时分别为1.4倍、2.3倍及3.1倍。增加的p53磷酸化作用在1.5小时为5.2倍且4在8小时为9.2倍，但降低的Rb磷酸化作用在48小时为0.2倍(参照图3f)。在此研究中，使用β-actin作为内对照(internal control)。
总结言之，可推论由BP压力诱发的细胞凋亡信号传导途径的略图模式，其由死亡受体、粒线体及细胞周期途径所组成。
实施例5动物研究使用RG2细胞(大鼠GBM)及DBTRG-05MG细胞(人类GBM)在动物试验以检测AS-C及BP的抗肿瘤活性。由实验室动物中心(中国台湾)获得雄性F344大鼠(230至260g)及雄性Foxnl nu/nu老鼠(10至12周龄)。所有步骤皆符合慈济大学实验动物中心的标准操作程序(中国台湾)。动物维持在无病原物条件下且使用标准实验室动物膳食加以喂食。分别制备DBTRG-05MG细胞(人类GBM)及RG2细胞(大鼠GBM)，在裸鼠进行异种移植(xenograft)及大鼠同种异体性(allogenics)。
于AS-C处理组试验1-AS-C以皮下注射投药对于带有皮下GBM肿瘤大鼠的存活率及肿瘤尺寸的影响将同样的F344大鼠分为两组(6/组)，在后背皮下植入1×106RG2细胞。动物由植入肿瘤细胞点的远距离处(＞2cm)，在肿瘤细胞植入第3、6及9日后，以皮下注射投药AS-C(500mg/kg/day)(处理组)，或载剂(50mg/ml聚乙二醇及100mg/ml Twenn-80在蒸馏水中；Standard Chem.& Pharm.，Tainan，)(对照组)。肿瘤尺寸以双角规形夹(caliper)测定且体积计算为L×H×W×0.52。在肿瘤体积超过25cm3时牺牲动物且以牺牲的天数作为动物的最后存活天数。
结果显示，与未处理组(对照组)相比，AS-C处理组对于肿瘤生长具有显著抑制作用(p＜0.05)(图4)。在第26天分别的肿瘤平均尺寸为对照组20.7±1.5cm3且处理组11.5±0.7cm3。与对照组相比，AS-C处理组的存活率显著延长(40±2.7天相对于30±2.1天；p＜0.0001)(图5)。
AS-C以剂量500mg/kg皮下注射，在大鼠未发现药物相关毒性，可由体重及存活器官的组织学分析加以左证。
试验2-AS-C由皮下注射投药与腹腔内注射投药对于带有皮下人类GBM肿瘤大鼠的肿瘤尺寸的比较影响将裸鼠分为两组(6/组)，植入s.c.5×106DBTRG-05MG细胞，且在肿瘤细胞植入5天后投药AS-C(i.p.500mg/kg/day)、AS-C(s.c.500mg/kg/day)或载剂(s.c.)。肿瘤尺寸以双角规形夹(caliper)测定且体积计算为L×H×W×0.52。在老鼠体内肿瘤体积超过1000mm3时牺牲动物且以牺牲的天数作为动物的最后存活天数。
结果显示，与未处理组相比，以AS-C i.p.(500mg/kg)及AS-Cs.c.(500mg/kg)处理组显著压抑肿瘤生长(p＜0.005)。肿瘤尺寸的平均值在第38天的对照组为849.9±150.1mm3，在AS-C i.p.(500mg/kg)处理组为295.5±25.3mm3，在AS-C s.c.(500mg/kg)处理组为155.1±56.4mm3。结果示于图7。
试验3-AS-C由皮下注射投药对于带有原位GBM肿瘤(颅内同种异体GBM)大鼠的肿瘤尺寸的影响AS-C对于原位肿瘤的毒性效果，是以RG2细胞测定。同种大鼠分为二组(6/组)，植入i.c.(纹状体)5×104RG2细胞，且在肿瘤细胞植入后第4、5、6、7及8天后，用AS-C(500mg/kg/day)或载剂s.c.处理。使用于慈济医院的具有回波平面造影功能(echo-planar imagingcapability)(Signa LX 3.8，General Electric，Wisconsin，USA)的3-T单位MRI(General Electric，Wisconsin，USA)测定及计算肿瘤体积。简言之，使用水合氯醛(400mg/ml，1ml/100g)将大鼠麻醉。使用快速旋转回波平面(fast spin echo)进行功能性MRI扫描，回波平面撷取序列的重复时间为6000msec，回波时间为102msec，基质影像为256×256，视域为5×5cm，且平面内分辨率为80μm。每只大鼠每19.5秒持续6.5分钟获得20片，每片为1.5mm厚。
在MRI影像数据中发现，与未处理组相比，处理组的肿瘤体积显著减少(p＜0.05)(图6)。平均肿瘤体积在第14及16天的对照组70.8±4.8mm3及126.4±11.1mm3，在AS-C处理组为46.2±3.6mm3及99.5±9.5mm3。
试验4-AS-C皮下注射投药对于带有异种移植人类GBM肿瘤的老鼠的肿瘤尺寸的细胞毒性在此试验中，使肿瘤生长至大尺寸以促进临床条件的肿瘤的手术移除为不可接受的选择。
如上所述，在裸鼠后背植入s.c.DBTRG-05MG细胞(5×106)。仅当肿瘤体积≥250mm3时，将带有肿瘤的老鼠以单一剂量的AS-C(500mg/kg)或载剂投药(s.c.)。在AS-C处理10天后，使用H&E组织染色测定在肿瘤的细胞毒性后，牺牲动物。观察组织切片且在光学显微镜50×及400×放大下照相。
组织学分析的照片显示，AS-C诱发核降解、空孔细胞质及肿瘤细胞块的肿瘤细胞死亡。相对地，对照组的肿瘤细胞生长良好且可见于AS-C处理组的细胞毒性作用，未在肿瘤块中发现。
BP处理组试验1-BP对于F344雄性大鼠中颅内(i.c.)大鼠同种异体GBM肿瘤的影响大鼠分为二组(6/组)，植入i.c.(纹状体)5×104RG2细胞，且在肿瘤细胞植入后第4、5、6、7及8天后5个剂量，随机以BP(300mg/kg/day)或载剂s.c.于后翼侧区域处理。用MRI测定及计算肿瘤体积。MRI是借由使用具有回波平面造影功能(echo-planar imaging capability)(SignaLX 3.8，General Electric，Wisconsin，USA)的3-T单位(General Electric，Wisconsin，USA)执行。简言之，使用水合氯醛(400mg/ml，1ml/100g)将大鼠麻醉。使用快速旋转回波(fast spin echo)进行功能性MRI扫描，回波平面撷取序列的重复时间为6000msec，回波时间为102msec，基质影像为256×256，视域为5×5cm，且平面内分辨率为80μm。每只大鼠每19.5秒持续6.5分钟获得20片＝(每片为1.5mm厚)。最后，测定及计算各组的全肿瘤尺寸(mm3)。
如上述使用MRI扫描及回波平面造影计算，结果显示，与未处理组相比，BP处理组的肿瘤体积显著减少(p＜0.05)(图8)。在图8的各栏表示平均值±SE(*p＜0.05；**p＜0.001)。平均肿瘤体积在第14及16天的对照组分别为69.9±4.81mm3及126.43±11.07mm3；在BP处理组分别为46.6±1.8mm3及91.68±8.3mm3。MRI造影数据显示，与对照组相比，BP处理组的原位肿瘤体积具有较小区域。
试验2-BP对于压抑裸鼠体内s.c.异种移植人类GBM肿瘤的生长及老鼠存活率的影响动物(Foxnl裸鼠)分为六组(6/组)，皮下植入(s.c.)1×106DBTRG-05MG细胞，且在肿瘤细胞植入后第4、5、6、7及8天后5个剂量，随机以BPs.c.(70、150、300、500、800mg/kg/day)或载剂s.c.在远离肿瘤植入点处(＞2cm)处理。每2天测定肿瘤尺寸及计算肿瘤体积。肿瘤超过1000mm3时牺牲动物。未牺牲的动物检测肿瘤3个月。存活率达200天。
结果显示，与未处理组相比，BP-处理组具有显著的肿瘤生长压抑(图9；300mg/kg/day组的p＜0.005，且肿瘤生长抑制性的程度为剂量依附性。
图10的存活图的对数范围(Log-rank)(Mantel-Cox)比较显示，用BP处理的带有异种移植皮下人类GBM的裸鼠的存活期，延长至200天。
实施例7-AS-C对人类恶性肿瘤细胞的端粒酶活性的影响使用TRAP分析端粒酶活性端粒酶活性是使用揭示于文献改良的端粒酶重复扩增方法(telomere repeat amplification protocol；TRAP)进行分析。使成小粒(pelleted)的细胞溶解于200μl的冰冷溶解缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EGTA，0.5％CHAPS，10％[v/v]甘油，5mM β-2-巯乙醇及0.1mM苯基甲基磺酰基氟化物)且在冰上培养30分钟后，在4℃下，以13,000×g离心20分钟。上清液萃取物使用BCA蛋白质分析套组(Pierce，IL，USA)定量蛋白质。TRAP分析法是使用TRAPeze端粒酶检测套组(Intergen公司，Purchase，NY，USA)进行且步骤根据制造商的标准程序进行。简言之，将含有0.5μg蛋白质的萃取物的体积添加至50μl的含有0.1μg受质寡核？(TS)引子(5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’)、0.1μg的TSK1模板(内标准)、0.1μg的反义寡核？引子(RP)、2U TakaraTaq DNA聚合？(Takara Shuzo公司，Japan)、20mM Tris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl2，63mM KCl，0.005％(v/v)Tween 20，1mM EGTA，50μM的各脱氧核苷三磷酸盐(dNTPs)及1.25μCi的(γ32P)ATP、3000Ci/mmol(PerkinElmer Life Science，Boston，MA，USA)的反应混合物中。该反应混合物在94℃培养2.5分钟再在DNA热循环机(GeneAmpPCR System 2400，PerkinElmer公司，Norwalk，CT，USA)扩增30个循环的聚合？链锁反应于94℃30秒、59℃30秒及72℃90秒。TRAP产物解析于12.5％(v/v)非变性聚酰胺琼脂胶电泳(PAGE)于含有54mMTris-HCl，pH8.0，54mM硼酸及1.2mM EDTA的缓冲液中。电泳胶在滤纸上干燥1小时后，在-80℃使用增强板(intensifying screen)曝光于X-底片(Bio-Max MR，Kodak Rochester，NY，USA)。TRAP分析DNA阶梯产物的信号强度，是使用Bio-Profil Biolight造影分析软件V2000.01(Vulber Lourmat，France)定量及比较。
统计数据以平均值±SD或SE表示。统计显著性使用Student’s t-test分析。将p值＜0.05认为显著。存活使用对数范围(Mantel-Cox)测试比较。中间值存活时间由Kaplan-Meier分析计算。
权利要求
1.当归萃取物在制备治疗癌证药物中的应用。细胞增生及移转的方法，其特征在于，是包括使用有效量的当归的丙酮萃取物、氯仿萃取物、或己烷萃取物，或由该萃取物所纯化的活性成分，以抑制肿瘤组织中癌细胞的增生及移转。
2.一种抑制癌细胞端粒酶活性的方法，其特征在于，是包括使用有效量的当归的丙酮萃取物、氯仿萃取物、或己烷萃取物，或由该萃取物所纯化的活性成分，以抑制肿瘤组织中癌细胞的端粒酶活性。
3.一种诱发癌细胞的细胞凋亡的方法，其特征在于，是包括使用有效量的当归的丙酮萃取物、氯仿萃取物、或己烷萃取物，或由该萃取物所纯化的活性成分，以诱发肿瘤组织中癌细胞的细胞凋亡。
4.如权利要求1至3项中任一所述的方法，其特征在于，该由当归萃取物纯化的活性成分包括正-亚丁基苯酞。
5.如权利要求1至3项中任一所述的方法，其特征在于，该癌细胞是选自人类恶性神经胶母细胞瘤、结肠直肠癌、血癌、神经母细胞瘤、肝癌、乳癌、卵巢癌及肺癌所成组群者。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，该癌细胞是选自人类恶性神经胶母细胞瘤、结肠直肠癌、血癌、神经母细胞瘤、肝癌、乳癌、卵巢癌及肺癌所成组群者。
7.一种抑制癌细胞增生及移转的方法，其特征在于，是包括使用有效量的当归的丙酮萃取物、氯仿萃取物、或己烷萃取物，或由该萃取物所纯化的活性成分作为佐剂，与一种或以上的其它药剂合并使用，以抑制肿瘤组织中癌细胞的增生及移转。
8.一种抑制癌细胞端粒酶活性的方法，其特征在于，是包括使用有效量的当归的丙酮萃取物、氯仿萃取物、或己烷萃取物，或由该萃取物所纯化的活性成分作为佐剂，与一种或以上的其它药剂合并使用，以抑制肿瘤组织中癌细胞的端粒酶活性。
9.一种诱发癌细胞的细胞凋亡的方法，其特征在于，是包括使用有效量的当归的丙酮萃取物、氯仿萃取物、或己烷萃取物，或由该萃取物所纯化的活性成分作为佐剂，与一种或以上的其它药剂合并使用，以诱发肿瘤组织中癌细胞的细胞凋亡。
10.如权利要求7至9项中任一所述的方法，其特征在于，该由当归萃取物纯化的活性成分包括正-亚丁基苯酞。
11.如权利要求7至9项中任一所述的方法，其特征在于，该癌细胞是选自人类恶性神经胶母细胞瘤、结肠直肠癌、血癌、神经母细胞瘤、肝癌、乳癌、卵巢癌及肺癌所成组群者。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该癌细胞是选自人类恶性神经胶母细胞瘤、结肠直肠癌、血癌、神经母细胞瘤、肝癌、乳癌、卵巢癌及肺癌所成组群者。
全文摘要
本发明提供当归的丙酮萃取物、氯仿萃取物、或己烷萃取物，以及由其纯化所得的活性成份，例如正－亚丁基苯酞，可有效治疗癌症。
文档编号A61P35/00GK1943606SQ20051011354
公开日2007年4月11日 申请日期2005年10月8日 优先权日2005年10月8日
发明者罗箭宽, 韩鸿志, 张温良, 林欣荣, 程永荣, 蔡女满 申请人:财团法人佛教慈济综合医院