专利名称：用于治疗癌症的多聚肽体的制作方法
技术领域：
本发明是关于结合表皮生长因子受体的多聚体分子。更具体地，本发明是关于一种结合表皮生长因子受体成员的分离并重组的融合多聚肽体(peptabody)，所述多聚肽体可应用于治疗受体表达与致病表型有关的疾病。所述疾病的实例如前列腺癌、膀胱癌、乳癌、头颈癌、黑素瘤。本发明还公开了编码所述分离并重组的融合多聚肽体的核苷酸、含有所述分离并重组的融合多聚肽体作为活性物质的试剂盒和药物组合物。最后，本发明提供了所述分离并重组的融合多聚肽体的制备方法，及其用于制备治疗或预防癌症的制剂的用途。
背景技术：
现有研究已经揭示了生长因子受体酪氨酸激酶在病因学和人类恶性肿瘤扩张方面所起的重要作用。这些生物受体通过跨膜结构域被锚定在表达它们的细胞的细胞膜中。细胞外结构域结合生长因子。生长因子与细胞外结构域的结合导致信号传递到细胞内激酶结构域。信号传导是造成细胞增殖和分化的原因。
所述表皮生长因子(EGF)受体家族的成员是重要的生长因子受体酪氨酸激酶。第一个被发现的EGF受体家族成员是表观分子量约165千道尔顿的糖蛋白。在Mendelsohn等的专利US 4943533中描述的糖蛋白是公知的EGF受体。EGF或转化生长因子α(TGF-α)结合EGF受体导致细胞生长。
生长因子受体EGF受体家族的另一成员叫做erbB-2，也是公知的HER2，或p185(Coussens等人，Science 230(1985)，1132-1139；Yamamoto等人，Nature319(1986)，230-234)。由c-erbB-2基因表达的受体ErbB-2与由人neu癌基因表达的蛋白相同。虽然ErbB-2与EGF受体的氨基酸序列不相同，但它们具有高度的同源性。ErbB-2已被认为是癌症治疗的高效靶标。培养的抗ErbB-2单克隆抗体赫赛汀(Herceptin)目前正临床应用于对ErbB-2过量表达的转移性乳癌的治疗，并已获得有利结果。
EGF受体家族的其它成员包括erbB-3/HER-3(Kraus等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)，9193-9197；Plowman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)，4905-4909)和erbB-4/HER-4(Plowman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)，1746-1750)。
在人体肿瘤上发现许多受体酪氨酸激酶数目异常高。例如许多表皮起源的肿瘤在它们的细胞膜上表达EGF受体水平增高。表皮生长因子受体(EGFR)在细胞生命中起了重要的作用如控制生长、增殖等。配体结合时发生受体激活，随后受体二聚化(2个受体结合)。虽然EGFR在维持正常细胞的功能和生存方面很重要，但是EGFR的表达显然表现出利于肿瘤细胞的生长和生存。包括基因扩增和ErbB变异在内的多种机制都能引发ErbB信号调节异常，增加受体转录、翻译或蛋白稳定性。表达EGF受体的肿瘤实例包括恶性胶质瘤、肺癌、乳癌、头颈癌和膀胱癌。肿瘤细胞膜上的EGF受体扩增和/或过量表达，伴随预后不良。
已经开发出多种以ErbB家族受体为靶标的方法，包括特异抗细胞外区域的特异单克隆抗体(MAbs)、酪氨酸激酶(TK)结构域(受体激活所需)抑制剂和反义疗法。
已将抗肿瘤抗原的培养抗体，特别是单克隆抗体作为潜在抗肿瘤剂进行研究。所述抗体可以通过许多机制抑制肿瘤生长。例如抗体可以通过抗体依赖性细胞毒细胞作用(ADCC)或补体依赖性细胞毒作用(CDC)免疫抑制肿瘤生长。
抗体选择性地和生长因子竞争与生长因子受体的结合，因此抑制表达所述受体的肿瘤生长。另一种方法中，毒素与产生的抗肿瘤抗原结合。抗体部分直接与肿瘤结合，肿瘤被毒素部分杀死。
虽然抗体和作为抗肿瘤剂的抗体片段的应用已经表现出前景，但仍然有很多缺点需要克服。例如，单克隆抗体是在杂交瘤中制备的。然而杂交瘤在商业生产上的应用效率低于其它表达系统诸如细菌。而且所述单克隆抗体通常产生于动物体内，而不是人体内。这样的单克隆抗体在人体内有免疫原性。这种免疫原性限制了所述单克隆抗体在人体治疗中的效力。
应用试剂阻断EGFR TK的激活是抑制EGFR代谢途径的第二种方法。抑制剂与用于结合TK结构域的三磷酸腺苷(ATP)竞争，激发自身磷酸化的减少。抑制剂的部分实例为Astra Zeneca(瑞典)的ZD1839、Novartis(瑞士)的PKI-166、Glaxo Smith Kline(英国)的GSK572016。
虽然MAbs和TK抑制剂在药理学和机理方面存在不同，但临床前研究表明二者都抑制细胞增殖，并且用标准治疗都具有附加的或协同的细胞毒作用。
反义技术作为振奋人心且前景广阔的癌症治疗策略已经出现，但是要达到临床应用的水平仍需进一步的研究开发。
几年前，一种颇具前景的名为“多聚肽体(peptabody)”的新型亲合力分子(avidity molecule)(Terskikh等人，1997″Peptabodya new type of highavidity binding protein″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(5)1663-8)被研制出来。
所述多聚肽体分子还作为包括多于2个单元的低聚物在WO 9818943(Kajava等人)中公开，其中每个单元包括能寡聚化的肽结构域和能结合受体(配体)的结构域；其中所述寡聚的结构域不是抗体或恒定区的功能抗体片段。还描述了所述低聚物的用途和合成。所述多聚化结构域由部分人软骨低聚基质多肽(cartilage oligomeric matrix polypetide，COMP)组成。所述COMP与铰链区或间隔区(spacer)(人IgA的19个氨基酸)融合。所述多聚肽体的结合结构域是短肽配体，位于铰链的羧基末端(C-terminal)部分。相对于单克隆抗体而言，所述五聚体分子在有效受体靶向方面有2个主要优点-通过协同结合，使其对靶受体的亲合力大大增强；-受体的交联可以在靶细胞上引发强的生物学效应。
多聚肽体分子的概念允许其与高水平表达靶标的细胞紧密结合，而靶分子的密度低不利于所述多聚肽体结合。
由于单体多肽链长度短，因此低聚物可化学合成。肽配体的氨基末端(N-terminal)位置允许首先合成核心分子(如五聚化结构域和连接体)，然后分开样品，继续在氨基末端合成不同的肽序列。这样，短肽的低聚化就绕过了折叠问题，并且克服了先前相关络合蛋白(如单链Fv片段)低聚化过程中遇到的表达困难。
合成与ErbB-2受体特异性反应的五聚体多聚肽体分子的尝试最近已有报道(Houimel等人，(1997)″Selection of peptides and synthesis of pentamericPeptabody molecules reacting specifically with ErbB-2 receptor″Int.J.Cancer2001；92748-755)。已从噬菌体展示库中筛选出结合ErbB-2细胞外结构域蛋白(ECD)的六肽，并已将其用于构建上述五聚多聚肽体分子。然而尚未发现表明所述多聚肽体诱导细胞凋亡的证据。观测到的抑制增殖作用可能归因于部分拮抗效应，或与上述抗ErbB-2单克隆抗体(anti-ErbB-2 MAb)的情况相同，归因于受体二聚化的抑制作用(Harwerth等人，″Monoclonalantibodies against the extracellular domain of E rbB-2 receptor function as partialligand agonist″J.Biol.Chem.1992；26715160-7)。由于筛选出的所述六肽与其配体的亲合力相对较弱，因此建议生成更长的肽分子。但是由于制备的复杂性，至今未见报道此种类型的重组融合多聚肽体分子。
近期的研究表明，过量表达表皮生长因子受体(EGF-R、erbB-1)的肿瘤与临床效果不佳相关(Mendelsohn J(2002)″Targeting the epidermal growthfactor receptor for cancer therapy″J.Clin.Oncol.201S-13S)。因此持续存在改进抗肿瘤剂(anti-tumor agent)如“多聚肽体”的需求。所述多聚肽体可被高效廉价制备，在人体中没有或几乎没有免疫原性，能以增强的亲合力与所述表皮生长因子受体成员特别是ErbB-1结合。所述ErbB-1在肿瘤细胞中表达数目很高。本发明的目的是提供一种兼具上述技术优点的新的抗肿瘤剂。
发明内容
上述目的和能从前述内容显然得出的其它目的已经通过制备新的重组融合多肽达到。所述多肽很有潜力作为抗肿瘤剂。一方面，本发明的目的是提供一种分离并重组的融合多聚肽体，该多聚肽体结合表皮生长因子受体成员，有助于抑制特定肿瘤细胞生长。本发明还公开了编码所述分离并重组的融合多聚肽体的核苷酸、含有所述分离并重组的融合多聚肽体作为活性物质的试剂盒和药物组合物。最后，本发明提供了所述分离并重组的融合多聚肽体的制备方法及其用于制备用于治疗或预防癌症的制剂的用途。
本领域技术人员通过阅读随后的具体实施方式
和权利要求将更了解本发明的其它目的和优点。所述具体实施方式
参照下述解释性附图进行描述。
图1显示所述多聚肽体的概念图解和因而发生的亲合力作用；左边部分对应低受体表达水平的细胞多聚肽体结合其中一个单体，没有激活EGFR途径；右边部分对应高受体表达水平的肿瘤细胞EGFR的募集导致细胞死亡；图2显示抗-EGFR(anti-EGFR)多聚肽体的构建和制备；图示多聚肽体单体包括不同的部分增强子(细菌系统中增加产品的序列)、组氨酸尾(6×His)、hCOMP(49个氨基酸的人软骨低聚基质多肽)、铰链(19个氨基酸的人IgA)和hEGF(全长人表皮生长因子)；未关联的多聚肽体氨基酸序列和EGF的petabody氨基酸序列也被列出；图3对应多聚肽体单体(mp-IRR、mp-EGF)和多聚肽体五聚体(P-IRR和P-EGF)的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色；图4表示peptaboday和Mab-425与人A431癌症细胞系结合的酶联免疫吸附测定(ELISA)分析；图5显示peptaboday EGF和Mab-425在人A431癌症细胞系上的竞争分析；在多聚肽体EGF浓度增加的情况下加入浓度固定的Mab-425(2.5纳摩尔/升)；图6显示表皮样癌细胞A431在不同浓度的多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)存在下治疗一天、两天和三天后的存活能力测试；通过存活细胞与空白对照存活细胞的比率计算抑制百分率(％)；图7为用多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)治疗两天后，无血清DMEM培养基体外培养的表皮样癌细胞A431的照片；图8显示人前列腺癌细胞DU145在不同浓度的多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)存在下治疗一天、两天和三天后的存活能力测试；通过存活细胞与空白对照存活细胞的比率计算抑制百分率(％)；图9为用多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)治疗两天后，无血清DMEM培养基体外培养的前列腺癌细胞DU145的照片；图10显示人前列腺癌细胞LNCaP在不同浓度的多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)存在下治疗一天、两天和三天后的存活能力测试；通过存活细胞与空白对照存活细胞的比率计算抑制百分率(％)；图11为用多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)治疗两天后，无血清DMEM培养基体外培养的前列腺癌细胞LNCaP的照片；图12显示人前列腺癌细胞PC-3在不同浓度的多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)存在下治疗一天、两天和三天后的存活能力测试；通过存活细胞与空白对照存活细胞的比率计算抑制百分率(％)；图13为用多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)治疗两天后，无血清DMEM培养基体外培养的前列腺癌细胞PC-3的照片；图14显示人乳癌细胞MCF-7在不同浓度的多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)存在下治疗一天、两天和三天后的存活能力测试；通过存活细胞与空白对照存活细胞的比率计算抑制百分率(％)；图15为用多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)治疗两天后，无血清DMEM培养基体外培养的乳癌细胞MCF-7的照片；图16显示人正常肌细胞在不同浓度的多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)存在下治疗一天、两天和三天后的存活能力测试；通过存活细胞与空白对照存活细胞的比率计算抑制百分率(％)；图17为用多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)治疗两天后，无血清DMEM培养基体外培养的肌细胞的照片；图18显示不同的人癌细胞系(A431人表皮样癌，MCF-7人乳癌，DU-145人前列腺癌，UM-UC-3和T24人膀胱癌，Na8人黑素瘤)在不同浓度的多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)存在下治疗一天、两天和三天后的存活能力测试；通过存活细胞与空白对照存活细胞的比率计算抑制百分率(％)；图19对应荧光激活细胞分类术(FACS)通过磷脂结合蛋白V(AnnexinV)染色方法测定的多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)对人体A-431表皮样癌细胞凋亡作用；表皮样A-431癌细胞分别用10纳摩尔/升的p-EGF和10纳摩尔/升p-IRR治疗0分钟(T0)、30分钟(T30)、60分钟(T60)、180分钟(T180)或360分钟(T360)；用FACS分析磷脂结合蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)结合的变化其中图19A为p-EGF(粗线)和p-IRR(细线)诱导细胞凋亡的对比；图19B为多聚肽体诱导细胞凋亡的时间曲线；图20对应在非还原或还原条件下多聚肽体的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，MDP01多聚肽体EGF，MDP03多聚肽体GBP，MDP00未关联的多聚肽体；图21对应用3-(4，5)-双甲基-乙-噻唑-(2，5)-二甲基溴化四氮唑蓝(MTT)法对癌细胞的细胞毒性定量分析；癌细胞与浓度为2微克/毫升的多聚肽体或特异EGFR单克隆抗体孵育；图22显示未关联的多聚肽体的氨基酸序列和蛋白质序列MDP00；起始密码子ATG(甲硫氨酸)和终止密码子TAA(*)用斜体表示，增强子肽用粗体表示，His尾加下划线表示，人软骨低聚基质多肽(COMP)用正常字体表示，铰链区(人)用斜体加粗体表示；图23显示多聚肽体EGF的氨基酸序列和蛋白质序列MDP01；起始密码子ATG(甲硫氨酸)和终止密码子TAA(*)用斜体表示，增强子肽用粗体表示，His尾加下划线表示，人软骨低聚基质多肽(COMP)用正常字体表示，铰链区(人)用斜体加粗体表示，表皮生长因子(EGF)用斜体加下划线表示；图24显示多聚肽体GBP的氨基酸序列和蛋白质序列；MDP03；起始密码子ATG(甲硫氨酸)和终止密码子TAA(*)用斜体表示，增强子肽用粗体表示，His尾加下划线表示，人软骨低聚基质多肽(COMP)用正常字体表示，铰链区(人)用斜体加粗体表示，生长结合肽(GBP)用斜体加下划线表示；图25是关于融合不同增强子的decabody(十聚体)的产量；显示了用细菌系统生产的decabody产量，所述decabody十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后用考马斯亮蓝染色；A)对应不溶性片段，B)对应可溶性片段；图26是关于融合不同增强子的多聚肽体的产量；显示了用细菌系统生产的多聚肽体的蛋白质印迹分析；用抗尿素细菌提取物的抗-His抗体进行检测；图27显示pQE-09质粒图谱。
具体实施例方式
为便于理解本发明，这里提供以下详细说明。
正如WO 9818943(Kajava等人)所公开的，“多聚肽体”是一种使用多聚化概念诱导异常细胞信号的高亲合力分子。上述文献在此一并引入参考。所述多聚化结构域由部分人软骨低聚基质多肽(COMP)和能结合受体(配体)的结构域(结合结构域)组成。所述COMP融合在铰链区或间隔区(spacer)(优选含有来自人IgA的19个氨基酸)。相对于单克隆抗体而言，所述多聚肽体在靶向有效受体方面有2个主要优点1)通过协同结合，使其对靶受体的亲合力大大增强；2)紧密交联受体可以引发对靶细胞的强的生物学效应，诱导对细胞生长和/或凋亡的抑制(见图1)。多聚肽体分子的概念允许其与高水平表达靶标的细胞紧密结合，而低密度的靶分子不利于所述多聚肽体结合。“Decabody”在同样的原理上构建，不同之处是Decabody具有10个臂和10个结合结构域。因此，本发明的保护范围还包括Decabody分子，即使所述分子不常被明确提及。
“ErbB受体”成员为属于ErbB受体家族的受体蛋白酪氨酸激酶，包括EGFR、ErbB3和ErbB4受体以及将来鉴定出的该受体家族的其它成员。ErbB2受体不包括在此定义之内，因此根据本发明，ErbB2受体不是分离并重组的融合多聚肽体的靶标。ErbB受体一般包括可以结合ErbB配体的细胞外结构域；亲脂性跨膜结构域；保守的细胞内酪氨酸激酶结构域和具有几个可以被磷酸化的酪氨酸残基的羧基末端信号结构域。ErbB受体可以是“天然序列”的ErbB受体或其“氨基酸序列变体”。优选ErbB受体是天然序列的人ErbB受体。
术语“ErbB1”、“表皮生长因子受体”和“EGFR”可以互换使用，均指例如Carpenter等人在Ann.Rev.Biochem.56881-914(1987)中公开的EGFR，包括天然产生的同种型或其变异型(如缺失变异体EGFR，Humphrey等人，PNAS(USA)874207-4211(1990))。术语erbB1指编码所述EGFR蛋白产物的基因。
符号“ErbB2”和“HER2”可以互换使用，均指所述人HER2蛋白(例如Semba等人，PNAS(USA)826497-6501(1985)和Yamamoto等人Nature 319230-234(1986)(Genebank accession number X03363))。术语“erbB2”指编码人ErbB2的基因，“neu”指编码鼠p185的基因。如上面所定义的，ErbB2受体不是本发明的分离并重组的融合多聚肽体的靶标，因此不在本发明的范围内。
“ErbB3”和“HER3”指公开的受体多肽(例如US 5183884和US 5480968及Kraus等人，PNAS(USA)869193-9197(1989))。
术语“ErbB4”和“HER4”指公开的受体多肽(例如EP 599274、Plowman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，901746-1750(1993)和Plowman等人，Nature，366473-475(1993))，包括同种型及其变异型(如WO99/19488公开的)。
“ErbB配体”意指结合和/或激活ErbB受体的多肽。基于结合和激活不同ErbB受体同源或异源二聚体的能力，EGF配体的家族可以分为三组(Lopez-Torrejon等人，2002”Human betacellulin structure modelled fromother members of EGF family″J.Mol.Model.8131-44)。第一组包括EGF、双调蛋白(amphiregulin)和转化生长因子αTGFα，该组可以直接与EGFR结合。第二组包括神经调节素-1(heregulin)，需要结合ErbB-3或ErbB-4形成的异源二聚体。第三组是双特异性配体，因为它们结合EGFR或ErbB-4，该组包括β动物纤维素、结合肝素的表皮生长因子(heparin-binding epidermalgrowth factor)和表皮调节素(Epiregulin)。
本文特别关注的所述ErbB配体是天然序列人ErbB配体，如表皮生长因子(EGF)(Savage等人，J.Biol.Chem.2477612-7621(1972))；转化生长因子α(TGF-α)(Marquardt等人，Science 2231079-1082(1984))；公知为神经鞘瘤(schwanoma)或角质细胞自分泌生长因子的双调蛋白(amphiregulin)(Shoyab等人，Science 2431074-1076(1989)；Kimura等人，Nature 348257-260(1990)；和Cook等人.Mol.Cell.Biol.112547-2557(1991))；β动物纤维素(Shing等人，Science 2591604-1607(1993)；和Sasada等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1901173(1993))；肝素结合-表皮生长因子(HB-EGF)(Higashiyama等人，Science 251936-939(1991))；表皮调节素(Epiregulin)(Toyoda等人，J.Biol.Chiem.2707495-7500(1995)；和Komurasaki等人，Oncogene 152841-2848(1997))；神经调节素-1(heregulin)(见下文)；神经调节素-2(neuregulin-2)(NRG-2)(Carraway等人，Nature 387512-516(1997))；神经调节素-3(neuregulin-3)(NRG-3)(Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.949562-9567(1997))；神经调节素-4(neuregulin-4)(NRG-4)(Harari等人.Oncogene 182681-89(1999)))或cripto(CR-1)(Kannan等人，J.Biol.Chem.272(6)3330-3335(1997))。结合EGFR的ErbB配体包括EGF、TGF-α、双调蛋白(amphiregulin)、β动物纤维素、HB-EGF和表皮调节素(epiregulin)。结合ErbB3的ErbB配体包括神经调节素-1(heregulin)。能结合ErbB4的ErbB配体包括β动物纤维素、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和神经调节素-1。病毒EGF-样配体(EGF-like ligands)如牛痘生长因子(VGF)、兔纤维瘤生长因子(SFGF)或粘液瘤生长因子(MGF)也包括在本发明范围内。
“天然序列”多肽是指含有与天然来源的多肽(如ErbB受体或ErbB配体)相同氨基酸序列的多肽。所述天然序列多肽可以从自然界分离得到，或者可以用重组或合成的方式制备。因此所述天然序列多肽可以具有天然产生的人体多肽、鼠科多肽或者任何其它哺乳动物种的多肽的氨基酸序列。
所述“片段”指一类序列，该类序列与能与表皮生长因子受体(EGFR)结合的多肽相应序列在长度上至少共有50％的氨基酸。所述序列只要显示出与其来源的天然序列相同的性质就可以使用。优选与能与EGFR结合的单独多肽序列在长度上共有氨基酸大于70％的序列；更优选共有氨基酸大于80％的序列；尤其优选共有氨基酸大于90％的序列。
本发明还包括上述能与表皮生长因子受体(EGFR)结合的序列的变体。所述术语“氨基酸序列的变体”或“变体”是指一种具有氨基酸序列的多肽，该多肽在一定程度上不同于天然序列多肽；该多肽是天然序列经过保守氨基酸取代变化而来的氨基酸序列；因此一个或多个氨基酸可被其它特性与之相同的氨基酸取代。氨基酸序列变体通常与下列两种结合结构域具有至少约70％的同源性。所述结合结构域是指天然ErbB配体的至少一个受体结合结构域，或天然ErbB受体的至少一个配体的结合结构域。优选与所述受体或配体结合结构域同源性至少约为80％的氨基酸序列变体，更优选同源性至少约为90％的氨基酸序列变体。氨基酸序列变体包括天然氨基酸序列中氨基酸序列特定位点中的取代、缺失、和/或插入。保守的氨基酸取代在这里定义为例如下列5组中任意一组范围内的互换I.小分子脂肪族的非极性或弱极性残基丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)II.带正电的极性残基组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)
III.带负电的极性残基及其酰胺残基天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)IV.大分子芳香族残基苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)V大分子脂肪族非极性残基甲硫氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)、半胱氨酸(Cys)。
所述同源性定义为，在为获得最大同源百分比而进行必要的排列序列和引入间隙后氨基酸序列变体中不变的残基的百分率。排列的方法和计算机程序为本领域公知。所述计算机程序之一为授权给Genentech，Inc的“Align 2”，其用户说明文件已于1991年12月10日上交华盛顿D.C.20559的美国版权局(United States Copyright Office)。
所述多聚肽体的“增强子”序列是位于所述分离并重组的融合多聚肽体或decabody氨基末端部分的肽序列，有效增加多聚肽体或decabody在原核或真核系统中的产量。
这里用到的“启动子”是指调节基因表达的核苷酸序列。“启动子序列”是指能在细胞内结合RNA聚合酶并起始下游(3’方向)编码序列转录的DNA调控区。在启动子序列中可以找到转录起始位点(用核酸酶S1作图方便定义)和负责结合RNA聚合酶的蛋白结合结构域(共有序列)。真核细胞启动子经常但不总是包括“TATA”框和“CAT”框。原核启动子除包括-10和-35共有序列之外，还包括SD序列(Shine Dalgarno sequence)。
当将一段核苷酸序列置于和其它核苷酸序列的功能关系中时，则该核苷酸序列为“可行连接”(operably linked)。例如，如果前序列或分泌前导的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该DNA与多肽DNA是可行连接；启动子如果影响序列的转录，则该启动子与编码序列是可行连接；或者核糖体结合位点如果能定位利于翻译，则该核糖体结合位点与编码序列是可行连接。如果所述位点不存在，可以按照常规惯例应用合成的寡聚核苷酸接合体或连接子。
术语“分离”和“纯化”指本发明重组融合多聚肽体的状态；或编码本发明重组融合多聚肽体的核苷酸，按照本发明会达到的状态。多聚肽体分子和核苷酸不含或基本不含它们天然联合的材料。所述材料如可从自然环境中发现，或从通过重组DNA技术在体内或体外制备它们的制备环境(如细胞培养)中发现的其它多肽或核苷酸。
术语“将纯化DNA引入到真核和原核宿主细胞中”或“转染”指任何过程，其中带有或不带有伴随物质的细胞外DNA进入宿主细胞。术语“细胞转染”或“转染细胞”指已经引入了细胞外DNA的细胞，因此细胞具有细胞外DNA。所述DNA可以被引入到细胞中，因此该核苷酸可作为染色体的组成部分或额外的染色体元件被复制。
术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”这里可以互换应用，指引入有一个或多个本发明的DNA或载体的真核或原核细胞。很容易理解所述术语不仅指特定主细胞，还指该细胞的后代或潜在后代。由于变异或环境影响，后代可能发生特定变化，因此事实上所述后代可能与亲代细胞不同，但是仍然包括在这里所用术语的范围之内。
“真核细胞”是指来自于真核有机体的任何哺乳动物或非哺乳动物细胞。为了不受实施例限定，能在细胞培养条件下维持并随后被转染的任何真核细胞都包括在本发明范围之内。特别优选的细胞类型包括干细胞、胚胎干细胞、中华仓鼠卵巢细胞(CHO)、非洲绿猴肾细胞(COS)、仓鼠肾细胞(BHK21)、鼠成纤维细胞(NIH3T3)、宫颈癌细胞(HeLa)、小鼠成肌细胞(C2C12)、癌细胞和初生分化或未分化细胞。其它合适的宿主细胞为本领域技术人员公知。
诱导“凋亡”或“坏死”的多聚肽体诱导细胞程序性死亡，所述细胞程序性死亡通过磷脂结合蛋白V(annexin V)的结合、DNA的碎裂、细胞的皱缩、内质网的膨胀、细胞的碎裂、和/或膜状小泡(凋亡小体)的形成进行检测。所述细胞通常过量表达ErbB受体。所述细胞优选为肿瘤细胞，如乳腺、前列腺、卵巢、胃、子宫内膜、唾腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰腺或膀胱细胞。所述细胞可以是体外的SK-BR-3、BT474、Calu 3细胞、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3细胞。可以用多种方法来评价与细胞凋亡有关的细胞事件。例如，磷脂酰丝氨酸(PS)翻转可通过磷脂结合蛋白结合检测；DNA片段可以通过DNA电泳衡量；细胞核/染色体浓缩连同DNA碎裂均可通过亚二倍体细胞增加测得。
“治疗”是指治疗性治疗和防范或预防性措施。所述需要治疗对象包括已经发生失调和需要防止失调发生的对象。因此这里所述接受治疗的哺乳动物可以是已诊断为有失调，或者倾向于失调或容易失调。
用于治疗目的的“哺乳动物”指任何分类为哺乳动物的动物，包括人类、驯化动物、畜牧动物、动物园的动物、运动场的动物或宠物动物，如狗、马、猫、牛、猴等等。哺乳动物优选为人。
术语“治疗有效量”指药物治疗哺乳动物体内疾病或紊乱的有效量。在治疗癌症的情况下，治疗有效量的药物可以减少癌细胞的数量、减小肿瘤体积、抑制(即减慢到某种程度，优选停止)癌细胞渗透到周围器官、抑制(即减慢到某种程度，优选停止)肿瘤转移、一定程度上抑制肿瘤生长、和/或将一种或几种癌症的相关症状减轻到一定程度。所述药物在某种程度上抑制肿瘤细胞的生长和/或杀死存在的肿瘤细胞，它可以是抑制细胞生长的物质和/或细胞毒素。短语“治疗有效量”用在这里表示足够的预防量，优选减少率至少约30％，优选至少50％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％，靶细胞块、癌细胞团或肿瘤在生长、或发展、或有丝分裂能力、或其它病理特征方面，出现临床上有意义的变化。
术语“癌症”和“癌症的”指或描述哺乳动物的生理状况，其典型特征在于失控的细胞生长。癌症的实例包括但不仅限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤)、神经内分泌瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。更具体的癌症实例包括鳞状细胞癌(如鳞状上皮细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺部腺癌和肺部鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、胃(gastric)或胃部(stomach)癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳癌、结肠癌(colon cancer)、直肠癌(rectal cancer)、结肠直肠癌(colorectal cancer)、子宫内膜或子宫癌、唾腺癌、肾(kidney)或肾脏(renal)癌、前列腺癌、阴门癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道癌以及头颈癌。
“ErbB表达癌”指包括在细胞表面出现ErbB蛋白的细胞的癌症。
“特征在于过度激活”ErbB受体的癌是指癌细胞中ErbB受体的激活程度大大超过同组织类型非癌细胞的受体激活水平的癌症。所述过度激活可能由癌细胞内的ErbB受体过度表达，和/或高出正常水平的可用ErbB配体激活ErbB受体引起的。所述过度激活作用可以引起癌细胞的恶性状态，和/或由癌细胞的恶性状态引起。在某些具体实施方式
中，癌症可以通过诊断或预后化验来检测是否扩大，和/或是否发生ErbB受体的过度表达，所述过度表达导致所述ErbB受体的过度激活作用。选择性地或补充地，癌症可以通过诊断或预后化验来检测是否扩大，和/或是否发生归因于受体过度激活的ErbB配体的过度表达。
“过度表达”ErbB受体的癌指，相对于同组织类型的非癌细胞而言，细胞表面的ErbB受体如ErbB1水平明显更高。所述过度表达可能归因于基因扩增、或转录或翻译的增强。ErbB受体的过度表达可以通过评测细胞表面ErbB蛋白的增加水平(如通过免疫组织化学法分析，IHC)，进行诊断或预后化验。
术语“包括”通常用于表示包括在内的意思，即允许有一种或几种特征或成分存在。
短语“药理上可接受”是指分子本体或组合物生理上可以耐受，在对人给药后，不产生典型的过敏或类似不良反应如胃不适、眩晕等。
术语多聚肽体的非人类(如啮齿动物)部分的“人源化”形式指其中含有源自非人类免疫球蛋白的最短序列的嵌合部分。所述多聚肽体特别是指人源化的软骨低聚基质多肽和免疫球蛋白多肽铰链区部分。
术语“嵌合”部分意指包括序列的功能部分的氨基酸序列，可用本领域技术人员公知的分子生物学方法得到。
“嵌合蛋白”指包括两段或两段以上多肽的蛋白质，所述多肽来源不同，即它们在自然条件下不会共存。
根据本发明，所述多肽是由单链DNA序列编码的分离并重组的融合多聚肽体。所述分离并重组的融合多聚肽体能结合表皮生长因子受体成员ErbB1、ErbB3或ErbB4，更优选结合ErbB1。本发明所述分离并重组的融合多聚肽体至少包括(a)人源化或人的软骨低聚基质多肽部分；(b)铰链部分和(c)表皮生长因子受体配体，该配体至少包括具有三维结构的模体。所述分离并重组的融合多聚肽体能诱导表达表皮生长因子受体的细胞的细胞死亡(调亡和/或坏死)。所述表达表皮生长因子受体的细胞优选癌细胞，更优选ErbB-表达癌细胞。所述ErbB-表达癌细胞更优选为其特征在于ErbB受体过度活化的细胞，或“过度表达”ErbB受体细胞。
“三维结构”或三级结构是蛋白质的总体3D结构，或者换句话说是蛋白质或多肽折叠的构象。蛋白质分子由一条长链氨基酸序列折叠成复杂的三维结构形成。通常由几何形状决定蛋白质的功能。
本发明表皮生长因子受体的配体包括长氨基酸序列，优选包括为复杂的多肽EGFR配体，更优选包括蛋白质。可以理解表皮生长因子受体的配体优选以其全长序列形式存在。表1显示以强亲和力和活性结合所述EGFR所需的最短氨基酸序列。所述序列包括至少10个氨基酸，优选20个氨基酸，更优选20个以上氨基酸。在EGF多肽配体的情况下，已经显示出高效EGFR活化作用要求的最小EGF区是结构模体，该模体包括了由蛋白质折叠产生的三个位点环。
EGF和所有所述生长因子家族的其它成员都具有特征性的6个保守半胱氨酸残基间隔，排列了3个二硫键。与两个保守甘氨酸残基的结合提供了适合的ErbB受体结合所必需的三维结构支架(Campbell等人，1990.Biochem.Pharmacol.40，35-40)。除了线性氨基末端(N-terminal)区、线性羧基末端(C-terminal)区和第四和第五半胱氨酸之间的单氨基酸铰链区之外，这些分子在它们的半胱氨酸间隔基础上还可以被分为三个成环区，称为A-环(A-loop)(Cys6-Cys20)、B-环(B-loop)(Cys14-Cys31)和C-环(C-loop)(Cys33-Cys42)(Stortelers等人，2002.Biochemistry，41(13)，4292-4301)。高亲合力结合要求适合的配体三维结构与EGF受体结合结构域的特定残基相结合。
所述分离并重组的融合多聚肽体识别细胞表面的EGFR分子，所述细胞优选真核细胞，更优选脊椎动物细胞，更优选哺乳动物细胞，如人体细胞。所述结合是对细胞表面确定结构的特异性结合。结合还以高亲合力发生，优选结合常数为5-10纳摩尔/升，更优选为9纳摩尔/升。
更优选地，本发明所述分离并重组的融合多聚肽体为全部来源于人或是人源化的多聚肽体。特别的是所述人软骨低聚基质多肽和铰链区部分是人源化的或全部来源于人。例如，能够低聚的所述肽结构域(COMP，即人源化的或人的软骨低聚基质多肽部分)和能结合表皮生长因子受体成员的结构域通过间隔区(铰链区)相连，例如以使结合结构域具有更大的灵活性。例如，认为富含脯氨酸的间隔序列可以避免形成二级结构元件，结果稳定了三维结构。此外，因其脯氨酸残基在构象上的限制，通常认为此类间隔区刚性很强，有利于协同多价结合。因此本发明的优选实施方式中，能够低聚的人源化的或人的软骨低聚基质多肽和能结合表皮生长因子受体成员的表皮生长因子受体的配体，通过免疫球蛋白多肽的铰链区(间隔区)部分相连，该铰链区优选包括富含脯氨酸区域。铰链部分更优选是免疫球蛋白多肽的区域。
所述人源化的或人的软骨低聚基质多肽部分(COMP)是能低聚并且能自组装的肽结构域，由此它能自发五聚化。本发明优选实施方式中的低聚物是能在体内或体外低聚化的自组装分子。
本发明优选实施方式中，所述分离并重组的融合多聚肽体是多聚化的，即多聚肽体分子的二聚体或三聚体。
本发明所述分离并重组的融合多聚肽体的构建与现有技术不同铰链区部分优选免疫球蛋白多肽区域，位于所述人源化软骨低聚基质多肽部分的羧基末端，表皮生长因子受体的配体位于所述铰链区的羧基末端，并且增强子序列位于所述人源化软骨低聚基质多肽部分的氨基末端。此区别点能改进功效和提高产率。
优选地，本发明所述分离并重组的融合多聚肽体还包括增强子序列。所述增强子序列选自由YSFE、YSFED、YSFEDL、YSFEDLY、YSFEDLYR和YSFEDLYRR以及它们的片段、分子嵌合体和变体所组成的组中。已表明氨基末端增强子序列的存在，优选上述备选增强子能使产率提高20-100倍(见图25和26)。然而，本领域技术人员在不背离本发明范围的情况下也能选择其它合适的增强子序列。
表皮生长因子受体的配体选自下列组中
(a)表皮生长因子多肽或其片段或其变体，(b)生长阻断肽(growth blocking peptide)或其片段或其变体，(c)转化生长因子α(TGF-α)多肽或其片段或其变体，(d)浆细胞扩散肽或其片段或其变体，(e)麻痹肽(paralytic peptide)或其片段或其变体，(f)作用于心脏的肽(cardioactive peptide)或其片段或其变体，(g)双调蛋白多肽(amphiregulin polypeptide)或其片段或其变体，(h)结合肝磷脂的表皮生长因子样多肽(heparin-binding epidermalgrowth factor-like polypeptide)或其片段或其变体，(i)β动物纤维素多肽(betacellulin polypeptide)或其片段或其变体，或(j)病毒EGF样多肽(viral EGF-like polypeptide)或其片段或其变体。
很容易理解它们的嵌合部分也应该予以正视。表皮生长因子受体的配体片段也可用，只要它们表现出与其起源的天然序列相同的性质。
表1 显示融合有本发明所述分离并重组融合多聚肽体的各种EGF受体的配体
为了更好的分离，本发明所述分离并重组的融合多聚肽体还包括聚组氨酸尾序列。所述分离可以通过亲和层析或其它任何本领技术人员公知的适合的技术完成。为了亲和层析纯化，可以使用任何特异结合所述分离并重组的融合多聚肽体或聚组氨酸尾序列的抗体。其它亲和分子如Ni2+-次氮基三乙酸交联琼脂糖珠，和特异结合聚组氨酸尾序列的亲和分子也包括在本发明范围内。
此外，所述分离并重组的融合多聚肽体氨基末端优选被至少一个添加功能结构域或效应区(effector region)附加物修饰，如标记、酶或细胞毒区域、或增加额外结合性质的区域，所述结合性质包括例如与金属原子或其它能用于亲和层析中的结构化合物的结合。所述效应区域可以通过本领域公知的常规化学技术连接到本发明所述分离并重组的融合多聚肽体上。
所述效应区域的例子包括诊断目的的可探测的分子或检测部分(detection moiety)，例如酶或具有特定结合性质的肽，如链霉抗生物素或辣根过氧化物酶。检测部分还包括化学部分(chemical moiety)，如可通过结合特定同类可探测部分(moiety)检测到的生物素，如标记的抗生物素蛋白(avidin)。
检测部分还包括荧光标记和核磁共振显像计算机断层显像领域惯用的标记。已知的许多荧光材料可用作标记。例如，所述标记包括荧光素、若丹明、金胺、德克萨斯红(Texas Red)、AMCA蓝(AMCA blue)和萤光黄(LuciferYellow)。
所述分离并重组的融合多聚肽体可以带有放射性标记作为检测部分，例如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、121I、124I、125I、131I、111ln、211At、198Au、67Cu、225Ac、213bu、99Tc和186Re。当使用放射性标记的时候，目前公知的可用计算方法也可以应用于特异性结合成分的定性和定量。例如所述标记在酶上时，可以通过本领域公知的目前常用的任何检测技术完成检测，所述技术包括比色技术、分光光度技术、荧光分光光度技术、电流计技术或气体定量分析技术。
所述放射性同位素标记的分离并重组的融合多聚肽体，在体外诊断技术和体内放射显像技术中很有用处。具体地说，所述放射性同位素标记的分离并重组的融合多聚肽体在放射性免疫治疗，特别是癌症治疗方面用处很大。在此方面更进一步讲，所述放射性同位素标记的分离并重组的融合多聚肽体可用于放射免疫导向外科技术，其中它们可以在外科去除上述细胞前、去除时和去除后，识别并指示出癌细胞、癌症前期的细胞、肿瘤细胞和过度增殖细胞的存在和/或位置。
在体内显像的实例中，本发明所述分离并重组的融合多聚肽体可以结合显像剂(imaging agent)胜于结合放射性同位素。所述显像剂包括但不仅限于磁共振成像加强剂，其中例如所述分离并重组的融合多聚肽体分子通过鳌合基团(chelating group)而负载上大量顺磁性离子。所述鳌合基团的实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、卟啉、聚胺冠醚和聚肟(polyoximes)。
顺磁性离子的实例包括钆、铁、锰、铼、铕、镧、钬和铒。
所述效应区域优选包括细胞毒素，即能抑制细胞生长或造成细胞破坏的多肽。所述细胞毒素可以是细菌细胞毒素，如从白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)得到的白喉毒素、从绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)得到的外毒素A、从炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)得到的炭疽毒素、从志贺菌属(Shigella)得到的志贺氏毒素(Shigatoxin)、从大肠埃希氏菌(Escherichia coli)得到的志贺样毒素(Shiga-like toxin)、从百日咳杆菌(Bordetella pertussis)得到的百日咳毒素(pertussis toxin)、或它们的有毒区域。优选的细菌细胞毒素为从绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 25313-25363)得到的外毒素A或其毒素区域，如结构域II、结构域Ib和/或结构域III。
另一方面，细胞毒素也可以来自植物。植物细胞毒素的实例是蓖麻毒蛋白(ricin)(Lamb等人，Eur.J.Biochem.148，265-270(1985))、相思豆毒蛋白(abrin)(Wood等人，Eur.J.Biochem.198，723-732(1991))、核酶钝化蛋白如皂角素(saporin)(Benatti等人，Eur.J.Biochem.183，465-470(1989))、美洲商陆抗病毒蛋白(Kataoka等人，Plant Mol.Biol.20，879-886(1992))、白树素(gelonin)(Nolan等人，Gene 134，223-227(1993))或天花粉蛋白(Shaw等人，Gene 97，267-272(1991))。
更优选的实施方式中的效应区域包括核糖核苷酸酶，特别是从哺乳动物中得到的核糖核苷酸酶，如牛胰腺核糖核酸酶A(Carsana等人，Nucleic AcidsRes.16，5491-5502(1988))、人血管生成素(Kurachi等人，Biochemistry 24，5494-5499(1985))、或人嗜曙红细胞来源的神经毒素(Rosenberg等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，4460-4464(1989))。最优选所述核糖核苷酸酶来自人。
其它细胞毒素药物也可以使用如5-氟尿嘧啶、或蓖麻毒蛋白，以及酶如细菌羧肽酶或硝基还原酶，所述酶能够将药物前体在肿瘤的位点转化成活性药物。
可将本发明所述分离并重组的融合多聚肽体通过任何合适的途径为需要治疗的病人给药，通常通过注射到血流或脑脊液中，或直接注射到肿瘤所在位点或靠近肿瘤的位点。准确的给药剂量取决于许多因素，包括多聚肽体是用于诊断还是用于治疗、肿瘤的大小和位置、多聚肽体的准确属性和连接在所述分离并重组的融合多聚肽体上的可探测或功能标记的属性。当使用放射性核素(radionuclia)疗法时，合适的最大单剂量为约45毫居里/平方米(mCi/m2)至约250毫居里/平方米。优选剂量在15-40毫居里范围内，更优选的剂量范围是20-30毫居里或10-30毫居里。
本发明的另一个主题是编码上文定义的所述分离并重组的融合多聚肽体的分离和纯化的DNA分子，及包括至少一个拷贝的所述分离纯化的DNA分子的载体。
这里能用的DNA是任何多脱氧核苷酸，例如包括双链DNA、单链DNA、其中一条或者两条单链都由两个或两个以上片段组成的双链DNA、其中一条或者两条单链都含有连续的磷酸三酯主链的双链DNA、包含一个或多个单链部分和一个或多个双链部分的DNA、两条DNA链完全互补的双链DNA、两条DNA链只有部分互补的双链DNA、环状DNA、共价闭合DNA、线性DNA、共价交联DNA、cDNA、化学合成DNA、半合成DNA、生物合成DNA、天然分离出的DNA、酶解后的DNA、剪切后的DNA、标记过的DNA例如放射性标记的DNA和荧光染料标记的DNA、包含一个或多个非自然发生种的核酸的DNA。编码所述分离并重组的融合peptaboby或其一部分的DNA序列，可以通过例如磷酸三酯法或通过自动合成法的标准化学技术和PCR法合成。根据本发明，编码所述分离并重组的融合peptaboby分离和纯化的DNA序列也可以用酶技术合成。因此，在预先确定的识别序列处断裂核酸分子的限制酶，可以用于从含有所述核酸序列的较大核酸分子中分离该核酸序列。所述核酸序列例如编码所述分离并重组的融合peptaboby或其一部分的DNA(或RNA)。
本发明还包括了上述序列的变体，所述变体是通过保守核苷酸取代而不同于所提及序列的核苷酸序列，其中的一个或多个核苷被具有相同特征的其它核苷所取代。
所述载体能在真核细胞、原核细胞复制或在真核细胞和原核细胞中复制。它可以是能整合到宿主细胞基因组中的载体(例如λ噬菌体)或存在于染色体外的载体(例如质粒)。优选载体是质粒。
此外，所述载体可以是表达载体，即其分离和纯化的DNA序列可操作地与启动子连接的载体。这意味着，连接后的编码本发明的所述分离并重组的融合多聚肽体的分离和纯化的DNA序列在适合的调控序列控制下允许表达，即插入的所述分离和纯化的DNA序列得到复制和翻译。适合原核宿主细胞的表达载体描述于Sambrook等人，Molecular Cloning；a LaboratoryManual，2nd Edition(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press中，特别是在第1-4章和第17章中。适合表达哺乳动物细胞中克隆基因的载体在Sambrook等人第16章有描述。适合的载体可以选择或构建，包括适当的调控序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸序列、标记序列和其它合适的序列。
多种宿主/表达载体组合都可以应用于表达本发明所述的DNA序列。例如有用的表达载体可以由染色体片段、非染色体片段和合成的DNA序列组成。合适的载体包括SV40的衍生物和公知的细菌质粒如大肠杆菌质粒colE1、pCR1、pBR322和pMB9以及它们的衍生物；质粒如RP4；噬菌体DNA，如噬菌体X(phage X)众多的衍生物(如NM989)和其它噬菌体(如M13和单链丝状噬菌体DNA)；酵母质粒如2u质粒或其衍生物；用于真核细胞的载体如可用于昆虫和哺乳动物细胞中的载体；源于质粒和噬菌体DNA组合的载体如经修饰应用于噬菌体DNA的质粒或其它表达控制序列，等等。
多种表达控制序列(即控制可操作地连接于其上的DNA序列表达的序列)中的任意一种或几种均可应用于这些载体中以表达本发明所述的DNA序列。所述有用的表达控制序列例如包括猿猴病毒40(SV40)、细胞巨化病毒(CMV)、牛痘、多瘤病毒或腺病毒的早期或晚期启动子，lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、LTR系统，噬菌体X(phage X)的主要调控子和启动子区域，fd外壳蛋白控制区域，3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶启动子(如Pho5)，酵母杂交因子启动子和其它已知的控制原核或真核细胞或它们的病毒的基因表达的序列，以及它们的各种组合。
本发明表达载体的具体实例为大肠杆菌载体pMS238-5-TGF、pMS238-5-225、pMS238-225-5、pMS240-5-225、pMS242-5-5 KDEL、pMS238-5-5和pMS246-5-5 KDEL。表达载体优选为pQE-09(图27)。编码本发明多肽的质粒片段的核苷酸序列及其对应的氨基酸序列如图2、图23、图24和图7所示，同时附上的SEQ ID N°1和SEQ ID N°2为多聚肽体EGF(p-EGF)；SEQ ID N°3和SEQ ID N°4为p-GBP。
本发明的另一个主题是能表达如上所述分离和纯化的DNA分子的宿主细胞，尤其是被稳定转化的具有含有所述DNA分子的表达载体的宿主细胞。
多种单细胞的宿主细胞有利于表达本发明的DNA序列。所述宿主可以包括公知的真核和原核宿主，如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌(Pseudomonas)、枯草杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)的菌株，真菌如酵母，和动物细胞如CHO、YB/20、NSO、SP2/0、RI.I、B-W和L-M细胞、非洲绿猴肾细胞(如COS1、COS 7、BSC1、BSC40和BMT10)、昆虫细胞(如Sf9)以及组织培养的人类细胞和植物细胞。所述宿主细胞优选为细菌细胞，更优选为大肠杆菌细胞。
可以理解的是，并不是所有的载体、表达控制序列和宿主表达本发明DNA序列的功能都一样好。相同表达系统的所有宿主功能也不会等同。然而，在不背离本发明范围的情况下，本领域技术人员无需大量的试验，就能够选择合适的载体、表达控制序列和宿主，完成想得到的表达。例如选择表达载体，必须考虑宿主，因为载体需要在宿主中行使功能。载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力、任何所述载体编码的其它蛋白如抗生素标记的表达，也要予以考虑。
选择表达控制序列时，通常要考虑许多因素，例如包括表达系统的相对强度、控制能力、以及与要表达的特定DNA序列的相容性，特别是有关潜在二级结构。通过考虑与所选载体的相容性、分泌特性、正确折叠蛋白质的能力、发酵条件以及对由要表达的DNA序列编码的产物宿主的毒性和纯化表达产物的容易程度可以选择合适的单细胞宿主。
考虑上述因素和其它因素后，本领域技术人员能构建多种载体/表达控制序列/宿主的组合，所述组合将在发酵时或在大规模的动物培养过程中表达本发明所述DNA序列。
宿主细胞被转化以制备上述多聚肽体的表达或克隆载体，并在经过适当改良以诱导启动子、筛选转化株、或扩增多聚肽体产品的常规营养基中培养。用于制备本发明所述分离并重组的融合peptaboby的宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售可得的培养基如汉氏F10(Ham′s F10)(Sigma)、最低基本培养基(Minimal Essential Medium，MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)以及达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)(Sigma)均适宜培养宿主细胞。此外，任何描述于Ham等人，Meth.Enz.5844(1979)、Barnes等人，Anal.Biochem.102255(1980)、US 4767704、US 4657866、US 4927762、US 4560655、或US 5122469、WO 90/03430或WO 87/00195的培养基都可以用作宿主细胞的培养基。任何所述培养基都可以补充必要的激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸，HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素GENTAMYCIN(TM)药)、微量元素(定义为通常存在的终浓度在微摩尔范围内的无机化合物)和葡萄糖或等价能量源。还可以含有本领域技术人员公知的适当浓度的任何其它的必需补充物。所述培养条件如温度、pH等为先前用于筛选表达宿主细胞的培养条件，该培养条件对本领域普通技术人员而言是显而易见的。
本发明的另一个主题是含有药剂有效量的上述定义的分离并重组的融合peptaboday作为活性物质的药物组合物，所述活性物质选择性地与医药上可接受的载体、稀释剂和辅料联合使用。本发明优选的药物组合物包括药物适合的载体、稀释剂和辅药。所述适合的载体、稀释剂和辅药应该无毒并且应该不影响活性成分的功效。所述药物组合物优选用作用于制备用于治疗或预防癌症、用于抑制细胞增殖的药剂的试剂，更优选用作抗肿瘤试剂即抑制肿瘤生长的试剂。
所述药物组合物可以是任何合适的形式，例如溶液、悬浮液、粉剂、冻干物、油膏或酊剂的形式。所述组合物能以任何合适的方法给药，如通过注射(全身的或局部的)或外用。所述载体或其它材料的精确属性有赖于给药的途径，所述途径包括口服、外用或者通过注射如静脉内注射、皮内注射。
口服给药的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉剂或液体形式。片剂可以包括固体载体如明胶或辅料。液体药物组合物通常包括液体载体如水、乳油(petroleum oil)、动物油或植物油、矿物油或合成油。
还可以含有生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖类溶液或二元醇如乙二醇、丙二醇、或聚乙二醇。
对于静脉内注射、或病痛位点注射而言，活性成分存在于以注射用药物可接受的水溶液剂型中，该剂型无热原、具有适宜的pH值、等张性和稳定性。例如本领域相关技术人员利用等张载体如氯化钠注射液、林格注射液(Ringer′s Injection)和乳酸钠林格注射液能够制备合适的溶液。
防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其它添加剂作为必需成分也包括在内。
药剂有效量取决于具体接受治疗的病人、治疗的疾病和给药的方法。再者，药剂有效量有赖于具体使用的多肽、特别是所述多肽是否额外还含有细胞毒性成分。治疗通常包括药物组合物的多次给药，通常间隔几小时、几天或几周。单位剂量的所述多肽药剂的药剂有效量通常在0.001纳克到100微克每千克接受治疗病人体重的范围内。
根据本发明，通过将具有所需纯度级别的药剂有效量的上述定义的分离并重组的融合多聚肽体，以冻干制剂或水溶液形式与所选择的药物适合的载体、赋形剂或稳定剂混合制备用于储存所用的药物组合物(Remington′sPharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))。适合的载体、赋形剂或稳定剂在应用剂量和浓度下对受试者无毒，包括缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)、氯化己烷双胺(hexamethonium chloride)、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苯索氯铵(benzethonium chloride)、苯酚、丁基苄基醇(butyl orbenzyl alcohol)、对羟基苯甲酸烷基酯(alkyl parabens)如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚)；低分子量多肽(少于约10个残基)；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；鳌合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)；糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子如钠；金属络合物(如锌蛋白络合物(Zn-protein complexes))；和/或非离子表面活性形剂如吐温TWEEN(TM)、PLURONICS(TM)或聚乙二醇(PEG)。
药物组合物或制剂还可以包括一种以上作为治疗特殊指征所必需的活性化合物，优选那些具有互补活性而又不互相起反作用的化合物。例如，药物组合物还可以根据需要在一种制剂中进一步含有可结合EGFR、ErbB2(如结合ErbB2上不同抗原决定簇的抗体)、ErbB3、ErbB4或血管内皮因子(VEGF)的抗体。显然药物组合物可以单独给药，或者根据治疗条件选择性地或附加地与其它治疗、疗法或药剂或同时或顺次结合。优选药物组合物还包括化疗剂、细胞毒素剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、EGFR-靶向药物、抗血管生成剂、抗癌剂、免疫调节剂和/或保心药。所述分子适合以达到既定目的所需的有效量的组合形式存在。
更常见的抗癌剂可以是酪氨酸激酶抑制剂或级联磷酸化作用抑制剂、翻译后调节子、细胞生长或分裂抑制剂(如抗有丝分离剂)、或信号转导抑制剂。其它治疗或疗法可以包括给予适当剂量的疼痛减缓药物如非甾体类消炎药(non-steroidal anti-inflammatory drug)(如阿斯匹林、扑热息痛、布洛芬或酮洛芬)或麻醉剂如吗啡、或止吐剂。所述组合物可以与下列药物联合给药(或顺次(即在之前或之后)或同时)酪氨酸激酶抑制剂(包括但不仅限于AG1478和ZD1839、ST1571、OSI-774、SU-6668)阿霉素、替莫唑胺(temozolomide)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、亚硝基脲(nitrosoureas)、甲基苄肼(procarbazine)、长春新碱(vincristine)、羟基脲(hydroxyurea)、5-氟尿嘧啶(5-fluoruracil)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosinearabinoside)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、卡氮芥(carmustine)、环己亚硝脲(lomustine)和/或其它化疗试剂。因此所述试剂可以是抗EGFR特异性试剂、或酪氨酸激酶抑制剂如AG1478、ZD1839、ST1571、OSI-774或SU-6668，或是更常用的抗癌和抗肿瘤性转化试剂如阿霉素、顺铂、替莫唑胺、亚硝基脲、甲苄肼、长春新碱、羟基脲、5-氟脲嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、环磷酰胺、表鬼臼毒素、卡氮芥或环己亚硝脲。此外药物组合物还可以与下列药物结合给药激素如地塞米松，免疫调节剂如白细胞介素、肿瘤坏死因子(TNF)或其它刺激免疫应答并减小或消除癌细胞或肿瘤的生长因子或细胞因子。
活性成分或活性试剂也可以在胶质药物给药系统(如脂质体、白蛋白微球体、微乳、纳米微粒、纳米微胶囊)或粗乳状液中，通过例如凝聚技术或界面聚合技术，分别包埋于例如由羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯(poly-(methylmethacylate))微胶囊制得的微胶囊中。上述技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)。
可以制备出常释制剂。合适的常释制剂的实例包括含抗体的固体疏水聚合物半透性基质。所述基质的形态为成型粒子，如膜或微胶囊。常释制剂基质的例子包括聚酯、水凝胶(如聚甲基丙烯-2-羟乙酯、或聚乙烯醇)、聚交酯(US 3773919)、L-谷氨酸和[γ]乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、非可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOT(TM)(包括乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林的可注射用微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内给药的制剂必须无菌。此要求通过如无菌滤膜过滤可以很容易地达到。
可以预见，含有药剂有效量上述定义的分离并重组的融合多聚肽体作为活性物质的药物组合物，可以用于治疗多种疾病或紊乱。通常所述被治疗的疾病或紊乱是癌症。特别是本发明提供了治疗和预防癌症的方法。所述癌症表达表皮生长因子受体(ErbB-表达癌)，优选癌症的特征在于ErbB受体过度活化，或癌症“过度表达”所述ErbB受体。
这里接受治疗的癌症的实例包括但不仅限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤)、神经内分泌瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病或淋巴样恶性肿瘤。更具体的癌症实例包括鳞状细胞癌(如鳞状上皮细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺部腺癌和肺部鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、胃(gastric)或胃部(stomach)癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳癌、结肠癌(colon cancer)、直肠癌(rectal cancer)、结肠直肠癌(colorectal cancer)、子宫内膜或子宫癌、唾腺癌、肾(kidney)或肾脏(renal)癌、前列腺癌、阴门癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道癌、以及头颈癌。
这里接受治疗的癌症更优选是头部癌、颈部癌、膀胱癌或黑素瘤。
本发明还提供了一种诱导凋亡和/或坏死的方法，该方法包括使细胞与本发明所述分离并重组的融合多聚肽体接触。被接触细胞优选上述癌症细胞。
提供抑制细胞增殖的方法也是本发明的目的，包括使细胞与本发明所述分离并重组的融合多聚肽体接触。被接触细胞优选上述癌症细胞。
为了预防和治疗疾病特别是癌症，所述分离并重组的融合多聚肽体适当的剂量取决于上述限定的所治疗疾病的种类、所述疾病的严重程度和进程、给予所述分离并重组的融合多聚肽体以预防还是以治疗为目的、前期治疗、病人的临床病史和对所述分离并重组的融合多聚肽体的应答，以及主治医生的判断力。所述分离并重组的融合多聚肽体适于给予初次给药或经过系列治疗的病人。根据所述疾病的严重程度和进程，给予病人的初始候选给药剂量约为1微克/千克至15毫克/千克(如0.1-20毫克/千克)的多聚肽体，例如或者通过一次或多次分别给药，或者通过连续输注。通常日剂量的变动范围可以是从1微克/千克到100毫克/千克或者更多，取决于上述提及的因素。根据病人状态经过几天或者更长时间反复给药，持续治疗直至想得到的疾病症状的抑制出现。所述分离并重组的融合多聚肽体的首选剂量在约0.005毫克/千克至约1.0毫克/千克范围内变动。这样一剂或多剂约0.05毫克/千克、2.0毫克/千克、4.0毫克/千克、或10毫克/千克(或它们的任何组合)可以给予病人。所述剂量可以间歇给药，如每周或每三周(如这样病人接受以从约2-20毫克/千克，如约六剂所述分离并重组的融合多聚肽体)。初始给予较高给药剂量，随后可以少给予一剂或多剂。典型的剂量方案包括初始给药剂量为约0.4毫克/千克所述分离并重组的融合多聚肽体，随后一周的维持剂量为约0.2毫克/千克所述分离并重组的融合多聚肽体。但是其它剂量方案也可以应用。治疗的过程很容易通过常规的技术和化验检测监控。
由于本发明所述分离并重组的融合多聚肽体具有高度的特异性，因此它们也可以用于基因治疗，如靶向活化或钝化特定受体；或如果连接有有毒化合物，可以用于破坏受体。基于使用上述事先转染以表达载体宿主细胞的细胞疗法，也包括在本发明范围之内。
本发明还预期了诊断癌症的方法，该方法包括对病人给予上述限定的分离并重组的融合多聚肽体，选择性地与适宜的药物载体、稀释剂和辅料结合给药。
本发明的另一个目的是提供病人表达表皮生长因子受体的癌症的诊断试剂盒，所述试剂盒包括上述限定的带有至少一个检测部分的分离并重组的融合多聚肽体，选择性地带有试剂和/或使用说明书。
体外评估EGFR的状态、特别是体外评估有关EGFR异常表达的诊断化验和试剂盒，可以用来诊断、估计和监控病人样本，所述样本包括那些已知患有或怀疑患有癌症、癌症前期状态、过度增殖细胞生长相关的状态的病人、或来自肿瘤样本。评估EGFR状态还有利于判定病人对临床试用药品的适应性；或有利于判定相对于不同的试剂而言，特定化学疗法制剂、或特别是本发明所述分离并重组的融合多聚肽体包括其组合物的给药情况。
本领域最常使用的所述标记或检测部分为放射性元素、酶、暴露在紫外光下发荧光的化学药品等。
本发明的另一个实施方式是提供病人表达表皮生长因子受体的癌症的治疗试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述分离并重组的融合多聚肽体，选择性地带有试剂和/或使用说明书。
本发明所述试剂盒还包括单独的药物剂型，该剂型包括附加的选自由化学疗法试剂、抗表皮生长因子受体抗体、放射免疫疗法试剂、以及它们的组合物组成的组的抗癌试剂。
通常，试剂盒包括容器、在容器上或关联在容器上的标签或包装嵌入物。适合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。所述容器可以用多种材料(如玻璃或塑料)形成。所述容器盛装治疗特定状态有效的组合物，有无菌通路出口(例如所述容器可以是静脉输液袋、或可用皮下注射针刺穿瓶塞的具塞小瓶)。组合物中至少一种活性成分是本发明所述分离并重组的融合多聚肽体。所述标签或包装嵌入物指明组合物应用于治疗的所述状态(如癌症)的选择。在一种实施方式中，所述标签或包装嵌入物指明含有与EGFR结合的本发明所述分离并重组的融合多聚肽体的组合物可用于治疗癌症，所述癌症表达ErbB受体，该受体选自由表皮生长因子受体(EGFR)、ErbB3和ErbB4组成的组，优选EGFR。此外，所述标签和包装嵌入物可以说明接受治疗的病人为患有癌症特征为ErbB受体过度活化的病人，所述ErbB受体选自EGFR、ErbB3或ErbB4。
所述试剂盒选择性地或附加地还可以包括另一个(或多个)盛装有药物适宜缓冲液的容器，所述缓冲液例如为抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲生理盐水、林格液和葡萄糖溶液。从商业角度和使用者的立场出发，所述试剂盒还可以包括其它物质，如其它的缓冲液、稀释剂、过滤器、注射针、注射器。
已经可以通过几种方法合成现有技术的多聚肽体。因为能结合受体(配体)的结构域在长度上相对较短，所以已经优选化学合成如通过固相合成现有技术的多聚肽体。
选择性地混合制备已有报道。发明单元的部分通过合适的宿主表达，并与化学合成部分连接。例如寡聚部分通过微生物合成，并通过化学合成延长加上能结合受体的结构域。
通过基因工程制备具有复杂结构和大小的配体如多肽或蛋白质尚未见报道。只有不大于六肽的配体能够作为融合蛋白通过表达发明单元得到。大多数配体以不可溶的形式制得，由此可见在发明单元上制备复杂结构的困难程度。
本发明所述分离并重组的融合多聚肽体优选通过基因工程方法制备。构建上述公开的表达载体包括构建用于编码所述分离并重组的融合多聚肽体完整的DNA序列的表达框，该序列在上述合适的宿主细胞中表达。适合的表达框可以通过基因工程标准技术制备。
除了用于合成想要的分离并重组的融合多聚肽体所必需的信息外，所述表达框可以附加地包括强制分泌所制备蛋白的信号序列。
本发明提供了制备本发明所述分离并重组的融合多聚肽体的方法，该方法包括如下步骤a)构建编码上述分离并重组的融合多聚肽体的分离纯化的DNA分子，b)在细胞系统中以适宜的条件使所述分离纯化的DNA分子得到表达，c)复性所述分离并重组的融合多聚肽体。
多聚肽体是通过软骨低聚基质蛋白的多聚化作用形成的多聚体分子。当单体在适宜条件(低变性条件)下混合在一起时自发发生多聚化作用。然而五聚体形成效率根据物理化学条件和单体的浓度可能发生变化。此外，配体特别是含有二硫键的配体的复杂性，可能引起多聚肽体聚集体和多聚体的形成。
如上所述，细胞表达系统或宿主细胞是真核或者原核细胞。优选细胞表达系统是原核细胞。
所述步骤b)的适宜条件为在10-40℃的温度下将细胞表达系统培养2-40个小时，优选在37℃下培养8-16小时。
此外，步骤c)是通过从细胞表达系统中提取所述分离并重组的融合多聚肽体，随后进行纯化和重折叠步骤完成的。
当重组融合多聚肽体分泌出来时，所述重组融合多聚肽体可以从培养基中提取和复性；当重组融合多聚肽体没有分泌出来，所述重组融合多聚肽体可以从细胞表达系统中提取，并通过本领域公知的技术如高效液相、凝胶电泳、亲和层析、超滤、离子交换等进行纯化得到。具体用于纯化重组融合多聚肽体的实际条件部分取决于以下因素如净电荷、疏水性、亲水性等等，具体条件对本领域技术人员而言是显而易见的。
任何特异性结合所述重组融合多聚肽体或所述组氨酸标签(His tag)的抗体都可以用于亲和层析纯化。其它亲和分子如Ni2+-次氮基三乙酸交联琼脂糖珠，和特异结合组氨酸尾的亲和分子也包括在本发明范围内。
纯化在还原剂存在下进行，结果导致杂质的去除。
重折叠步骤通过直接在重折叠缓冲液中稀释完成，所述重折叠步骤还包括系列透析。关键点是完成在复性液中快速稀释变性的多聚肽体。
为了避免聚集体形成，复性所述分离并重组的融合多聚肽体在低浓度下进行。优选直接在重折叠缓冲液中稀释至所述分离并重组的融合多聚肽体的终浓度在300纳摩尔/升以下，最优选如实施例4所示稀释至终浓度在100纳摩尔/升以下。
系列透析包括至少2个不同的透析，但是优选至少3个或4个甚至更优选如实施4例所示的至少5个不同的透析。然而，在不背离本发明范围的情况下，本领域技术人员能够选择其它透析顺序或透析系列。
所述重折叠步骤存在于所述分离并重组的多聚肽体浓缩前的氧化过程中。
根据本发明制备出来的所述多聚肽体非常稳定。所述多聚肽体分子的稳定性是指所述分子维持稳定的可溶形式而没有转换成不溶形式，或没有形成聚集体，或没有形成多聚肽体的多聚体，或丧失生物学活性。
本发明的另一个目的是提供具有蛋白合成增强活性的分离纯化的增强子序列。所述分离纯化的增强子序列优选选自由YSFE、YSFED、YSFEDL、YSFEDLY、YSFEDLYR和YSFEDLYRR以及它们的片段、它们的分子嵌合体和它们的变体所组成的组。
“蛋白合成增强活性”指所述分离纯化的增强子序列的活性，具体定义如下在适当的条件下被引入到真核或原核宿主细胞后，与没有转染所述增强子序列的细胞培养物相比，所述序列能够增加细胞中蛋白合成的水平。
所述增强子序列还增强其它类型重组蛋白的合成比如人激肽释放酶hK2(产量增加至少3倍)或人丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)抗胰凝乳蛋白酶(ACT)(产量增加至少2倍)，见实施例7。通常所述增加为1.5-100倍，优选增加3-10倍(还见图25、图26)。
除非特别说明，本领域技术人员可以意识到本发明允许改变和修饰。可以理解本发明包括所有不背离本发明精华或实质特征的改变和修饰。本发明还包括本说明书单独或共同提及或说明的所有步骤、特征、组合物和化合物、以及任何两个或多个步骤或特征的任意和所有组合。因此认为，本发明的公开在所有方面都进行了非限制性的详细说明，本发明的范围通过后附的权利要求书指明，所有在其意义范围内及等价范围之内的变化都确定为包括在内。
本说明书引用了大量参考文献，上述文献在此一并引入参考。
通过参考下列实施例，可以对上述描述进行更充分的理解。但是所述实施例是实施本发明的示例方法，并不用于限定本发明的范围。
实施例1抗EGFR多聚肽体的构建和制备所述编码人表皮生长因子的基因通过含有该全长基因的质粒PCR扩增，用合适的酶消化并插入到含多聚肽体基因的质粒中。多聚肽体在细菌体内制备，并通过在37℃下诱导过夜作为包涵体进入到细胞质内。大肠杆菌(E.coli)细胞室温下在变性溶液(8摩尔/升尿素)中裂解。离心之后，多聚肽体分子通过亲和层析纯化，并通过直接在重折叠缓冲液中稀释重折叠(见图3)。
多聚肽体EGF与肿瘤细胞表面EGF受体的结合结合化验用单克隆抗体Mab425(作为Retuximab用于治疗)、多聚肽体EGF和未关联的多聚肽体在A431细胞上进行。概括地，10000个细胞接种于96孔板培养基/10％胎牛血清(FCS)中培养10小时。去除培养基后，多聚肽体或单克隆抗体在不同的浓度下与贴壁细胞在冰上孵育90分钟。洗涤之后，用过氧化物酶偶联的多克隆抗Fab抗体(anti-Fab)或过氧化物酶偶联的抗(anti-His)单克隆抗体分别与MAb425和多聚肽体进行显色分析(见图4)。
对6.67纳摩尔/升的Mab425和递增用量的多聚肽体EGF(0.1-200纳摩尔/升)进行竞争性定量分析，证明Mab425和多聚肽体EGF竞争相同的结合位点，EGF受体(见图5)。
实施例2对不同癌细胞系的体外作用通过生存能力试验来测定多聚肽体对人类癌细胞的影响。概括地，2500个细胞被接种于96孔板，在含10％胎牛血清(FCS)的DMEM培养基中培养。一天以后，去除培养基，代之以含peptaboday的欧普特蒙(optimen)。在不同的时间，细胞板用MTT[3-(4，5)-双甲基-乙-噻唑-(2，5)-二甲基溴化四氮唑蓝]法显色估测细胞数。
表皮样瘤癌细胞A431图6显示人表皮样瘤癌细胞A431在不同浓度的多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)存在下治疗一天、两天和三天后的存活能力测试；抑制作用的百分率(％)通过存活细胞与空白对照存活细胞的比率计算得出。图7用多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)治疗2天后，无血清DMEM培养基体外培养的表皮样癌细胞A431照片。
人前列腺癌细胞DU145图8显示人前列腺癌细胞DU145在不同浓度的多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)存在下治疗一天、两天和三天后的存活能力测试；抑制作用的百分率(％)通过存活细胞与空白对照存活细胞的比率计算得出。图9用多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)治疗2天后，无血清DMEM培养基体外培养的前列腺癌细胞DU145照片。
人前列腺癌细胞LNCaP图10显示人前列腺癌细胞LNCaP在不同浓度的多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)存在下治疗一天、两天和三天后的存活能力测试；抑制作用的百分率(％)通过存活细胞与空白对照存活细胞的比率计算得出。图11用多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)治疗2天后，无血清DMEM培养基体外培养的前列腺癌细胞LNCaP照片。
人前列腺癌细胞PC-3图12显示人前列腺癌细胞PC-3在不同浓度的多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)存在下治疗一天、两天和三天后的存活能力测试；抑制作用的百分率(％)通过存活细胞与空白对照存活细胞的比率计算得出。图13用多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)治疗2天后，无血清DMEM培养基体外培养的前列腺癌细胞PC-3照片。
人乳癌细胞MCF-7图14显示人乳癌细胞MCF-7在不同浓度的多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)存在下治疗一天、两天和三天后的存活能力测试；抑制作用的百分率(％)通过存活细胞与空白对照存活细胞的比率计算得出。图15用多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)治疗2天后，无血清DMEM培养基体外培养的乳癌细胞MCF-7照片。
人正常肌细胞对照图16显示人正常肌细胞在不同浓度的多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)存在下治疗一天、两天和三天后的存活能力测试；抑制作用的百分率(％)通过存活细胞与空白对照存活细胞的比率计算得出。图17用多聚肽体EGF(p-EGF)或未关联的多聚肽体(p-IRR)治疗2天后，无血清DMEM培养基体外培养的肌细胞照片。
对不同癌症细胞系的体外作用通过生存能力试验来测定多聚肽体对人类癌细胞的影响。概括地，2500个细胞被接种于96孔板，在含10％胎牛血清(FCS)的DMEM培养基中培养。一天以后，去除培养基，代之以含peptaboday的欧普特蒙(optimen)。在一天内的不同时间，测定10纳摩尔/升的多聚肽体对人癌细胞的作用(见图18)。细胞板用MTT[3-(4，5)-双甲基-乙-噻唑-(2，5)-二甲基溴化四氮唑蓝]法显色估测细胞数。
总之，可以观察到，相对于未关联的多聚肽体(p-IRR)(空白)而言，多聚肽体EGF(p-EGF)的存在对细胞生长有强抑制作用(见图7、图9、图11、图13和图15)。
实施例3细胞凋亡检测在DMEM培养基中孵育A-431癌细胞(在500微升细胞液每孔的5×105个细胞)。24小时以后，换以500微升含10纳摩尔/升的p-EGF或p-IRR且不含血清的OPTIMEM培养基。在0-360分钟之间的确定时间点(T0、T30、T60、T180、T360)，收集并合并贴壁细胞和悬浮细胞，用磷脂结合蛋白V-异硫氰酸荧光素(annexin V-FITC)凋亡检测试剂盒(Apotech瑞士)分析凋亡。所述试剂盒能检测到细胞膜外表面的磷脂酰丝氨酸。概括地，细胞用PBS缓冲液和着色缓冲液各洗涤一次，然后在室温下用50微升磷脂结合蛋白(annexin)V-FITC(5毫克/毫升)染色15分钟。着色细胞团用着色缓冲液和FACS缓冲液(1xPBS、5％FCS、0.02％NaN3)各洗涤一次，重悬于200微升FACS缓冲液中，用FACS计数分析。
30分钟后，多聚肽体EGF确定无疑地诱导了A431癌细胞的凋亡，然而多聚肽体IRR没有作用(见图19a和图19b)。
实施例4多聚肽体的制备和重折叠方案-在细菌中制备使用含有编码多聚肽体质粒的E.coli TG1菌株制备重组蛋白。经过过夜的预培养，新鲜培养开始于1/100预培养母液稀释剂，在37℃下250毫升补充有100微克/毫升氨苄青霉素(ampicilin)的2xTY培养基中培养。菌液OD值为0.6(600纳米)时，培养物用250纳摩尔/升的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导。
-纯化诱导16小时后，细菌通过离心收获，细胞团重悬于25毫升变性溶液(8摩尔/升尿素、1xPBS、10毫摩尔/升β-巯基乙醇，pH为7.4)中，室温下变性2个小时。10000克重力加速度下离心10分钟后不溶物质成团，上清混以250微升Ni2+-次氮基三乙酸交联琼脂糖珠(Qiagen)。室温下旋转2小时后，用洗涤液(5摩尔/升尿素、1xPBS、10毫摩尔/升β-巯基乙醇、20毫摩尔/升咪唑，pH为7.4)洗涤树脂3次。蛋白质在2.5毫升洗脱缓冲液(5摩尔/升尿素、1xPBS、10毫摩尔/升β-巯基乙醇、150毫摩尔/升咪唑，pH为7.4)中洗脱。
-重折叠●1.25毫克洗脱出的蛋白质在250毫升的重折叠缓冲液(50毫摩尔/升三(羟甲基)胺基甲烷(Tris)、50毫摩尔/升NaCl、10毫摩尔/升β-巯基乙醇、0.1％Triton-X100，pH＝8.2)快速稀释至终浓度低于5微克/毫升，然后在此条件下维持至少6小时。
●然后用下列的缓冲液(透析体积4升)顺序透析蛋白质●透析缓冲液150毫摩尔/升Tris、50毫摩尔/升NaCl、1毫摩尔/升β-巯基乙醇、0.1％Triton-X100，pH＝8.2，透析6小时。
●透析缓冲液250毫摩尔/升Tris、50毫摩尔/升NaCl、0.1％Triton-X100，pH＝8.2，透析过夜。
●透析缓冲液350毫摩尔/升Tris、50毫摩尔/升NaCl、0.01％Triton-X100，pH＝8.2，透析4小时。
●透析缓冲液450毫摩尔/升Tris、50毫摩尔/升NaCl、0.001％Triton-X100，pH＝8.2，透析4小时。
●透析缓冲液550毫摩尔/升Tris、50毫摩尔/升NaCl，pH＝8.2，沸水浴(bubbling bath)透析过夜。
●所述重折叠蛋白质用氮气搅拌细胞系统和超离心装置(Millipore)浓缩到最终体积250微升，在-80℃下保存。
实施例5材料启动子购自Microsynth(瑞士)。
分子生物学试剂(Taq聚合酶、连接酶、磷酸酯酶)购自Promega(德国)。
表达载体pQE-09和Ni2+-次氮基三乙酸交联琼脂糖(Ni-NTA)柱购自Qiagen(德国)。
抗-EGFR的多聚肽体的制备1)表达载体的制备表达载体pQE-09用Xhol和Notl限制酶消化。
2)多聚肽体GBP/多聚肽体EGF/未关联的多聚肽体编码生长抑制多肽(GBP)的合成基因用于构建多聚肽体GBP。所述GBP为昆虫生物起源的生长因子，由25个氨基酸组成，来自东方粘虫(Pseudaletia separata)的血淋巴。
编码人表皮生长因子的基因通过PCR含有此全长基因的质粒得到扩增。
GBP或EGF被插入包括Bglll/Notl消化的编码decabody分子质粒中。用PCR和特定引物扩增多聚肽体部分(软骨低聚基质蛋白-COMP-、铰链、配体)。结果所得产物为插入pQE-09表达载体进行消化。
3)多聚肽体GBP/多聚肽体EGF/未关联的多聚肽体的制备多聚肽体在细菌细胞质中作为包涵体被制备，并被重折叠成相应五聚化单体的稳定可溶形式。
-编码人表皮生长因子的基因通过PCR含有此全长基因的质粒得到扩增。
-GBP或EGF被插入包括编码根据本发明修饰的多聚肽体分子质粒中。
结果所得产物为它们插入pQE-09表达载体进行消化。
4)多聚肽体GBP/多聚肽体EGF/未关联的多聚肽体的制备和纯化通过37℃过夜诱导，多聚肽体在细菌细胞质中作为包涵体被制备。
大肠杆菌细胞在8摩尔/升的尿素中室温下裂解2小时。离心后，裂解物与Ni2+-次氮基三乙酸交联琼脂糖珠混合90分钟，多聚肽体分子通过咪唑/尿素溶液洗脱。
5)多聚肽体GBP/多聚肽体EGF/未关联的多聚肽体的重折叠多聚肽体分子通过直接在重折叠缓冲液(pH为8.3的50毫摩尔/升TrisHCl、0.01％Triton-X100、10毫摩尔/升β-巯基乙醇)中稀释到终浓度5微克/毫升(稀释必须高于100倍)，在pH为8.3的50毫摩尔/升Tris HCl和10毫摩尔/升的β-巯基乙醇中透析24小时，在pH为8.3的50毫摩尔/升Tris HCl中透析两天。
6)多聚肽体GBP/多聚肽体EGF/未关联的多聚肽体的最终纯化透析后的多聚肽体沉淀在阴离子交换柱上，并用盐梯度洗脱。
结果见图20。图20表示在非还原或还原条件下多聚肽体的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。MDP01对应多聚肽体EGF，MDP03对应多聚肽体GBP，MDP00代表未关联的多聚肽体。
多聚肽体抗EGFR(anti-EGFR)对肿瘤细胞的作用重折叠多聚肽体在不同的肿瘤细胞中进行测试(A431人表皮样癌细胞、DU145和PC-3人前列腺癌细胞)以评价它们的细胞毒作用。
结果见图21。图21表示用MTT[3-(4，5)-双甲基-乙-噻唑-(2，5)-二甲基溴化四氮唑蓝]法对癌细胞的细胞毒定量分析，癌细胞与浓度为2微克/毫升的多聚肽体或特异EGFR单克隆抗体孵育。MDP01和MDP03与EGF受体结合百分率大大高于MAb 425(数据未显示)，所述MAb 425为特异性结合EGF受体的单克隆抗体。多聚肽体存在下，在A-431和DU145癌细胞系中观察到细胞增殖的减少和细胞凋亡的增加，但是PC-3对MDP03较不敏感。
总之，多聚肽体表现出比单克隆抗体425更强的介导癌细胞死亡作用。
实施例6多聚肽体增强子序列过去开发出过各种不同类型的多聚肽体，但是它们中大多数产量非常低，而多聚肽体/decabody在产量上观察到了的巨大变化。
图25是关于融合到不同增强子的decabody的产量；显示了用细菌系统生产的decabody产量，所述decabody进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后用考马斯亮蓝染色；A)对应不溶性片段，B)对应可溶性片段；图26是关于融合以不同增强子多聚肽体的产量；显示了用细菌系统生产的多聚肽体的蛋白质印迹分析；检测用抗-His抗体对尿素细菌提取物进行。
实施例7用其它蛋白质对增强子序列在产量水平上进行评价。增强子序列(E0、E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7，见图25和图26)融合到人激肽释放酶2基因或人丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)α-1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)基因的氮末端部分，通过IPTG诱导后37℃下过夜培养衡量产量水平。增强子序列增加了人激肽释放酶hK2(至少3倍)和人丝氨酸蛋白酶抑制剂ACT(至少2倍)的产量。
序列表SEQUENCE LISTING<110>洛桑大学<120>用于治疗癌症的多聚肽体<130>P5496KAT<150>US 60/460,490<151>2003-04-04<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>417<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>多聚肽体EGF的DNA序列MDP01<400>1atgtatagct ttgaagatct ggctagccat catcatcacc atcatggaga cctgggcccg 60cagatgctgc gtgaactgca ggaaaccaac gctgctctgc aggacgttcg tgactacctg 120cgtcagctgg ttcgtgaaat caccttcctg aaaaacaccg ttatggaatg cgacgcttgc 180ggtatgcagc agactagtcc gcctactccg ccaactccgt ctccgtctac tccgccaact 240ccgtctccga gatccaattc tgactctgaa tgcccattgt ctcacgacgg ttactgcttg 300cacgacggtg tttgcatgta catcgaagct ctggacaaat acgcttgcaa ctgcgttgtt 360ggttacatcg gtgaacgttg ccaataccga gatctgaaat ggtgggaact gcgttaa417<210>2<211>138<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>多聚肽体EGF的蛋白序列MDP01<400>2Met Tyr Ser Phe Glu Asp Leu Ala Ser His His His His His His Gly1 5 10 15Asp Leu Gly Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala20 25 30
Leu Gln Asp Val Arg Asp Tyr Leu Arg Gln Leu Val Arg Glu Ile Thr35 40 45Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys Gly Met Gln Gln50 55 60Thr Ser Pro Pro Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr65 70 75 80Pro Ser Pro Arg Ser Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp85 90 95Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp100 105 110Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln115 120 125Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg130 135<210>3<211>333<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>多聚肽体GBP的DNA序列MDP03<400>3atgtatagct ttgaagatct ggctagccat catcatcacc atcatggaga cctgggcccg 60cagatgctgc gtgaactgca ggaaaccaac gctgctctgc aggacgttcg tgactacctg 120cgtcagctgg ttcgtgaaat caccttcctg aaaaacaccg ttatggaatg cgacgcttgc 180ggtatgcagc agactagtcc gcctactccg ccaactccgt ctccgtctac tccgccaact 240ccgtctccga gatctgaaaa cttttccggc ggctgcgtgg cgggctatat gcgtaccccg 300gatggccgtt gcaaaccgac cttttatcag taa 333<210>4<211>110<212>PRT<213>人工序列
<223>多聚肽体GBP的蛋白序列MDP03<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(110)<223>
<400>4Met Tyr Ser Phe Glu Asp Leu Ala Ser His His His His His His Gly1 5 10 15Asp Leu Gly Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala20 25 30Leu Gln Asp Val Arg Asp Tyr Leu Arg Gln Leu Val Arg Glu Ile Thr35 40 45Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys Gly Met Gln Gln50 55 60Thr Ser Pro Pro Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr65 70 75 80Pro Ser Pro Arg Ser Glu Asn Phe Ser Gly Gly Cys Val Ala Gly Tyr85 90 95Met Arg Thr Pro Asp Gly Arg Cys Lys Pro Thr Phe Tyr Gln100 105 110
权利要求
1.一种分离并重组的融合多聚肽体，该多聚肽体结合表皮生长因子受体成员，所述多聚肽体至少包括(a)人源化软骨低聚基质多肽部分或人的软骨低聚基质多肽部分；(b)铰链部分和(c)表皮生长因子受体的配体，该配体至少包括具有三维结构的模体，因此所述分离并重组的融合多聚肽体能诱导表达表皮生长因子受体的细胞死亡。
2.如权利要求1所述的分离并重组的融合多聚肽体，其中，所述表皮生长因子受体成员为ErbB1、ErbB3或ErbB4。
3.如权利要求2所述的分离并重组的融合多聚肽体，其中，所述表皮生长因子受体成员为ErbB1。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的分离并重组的融合多聚肽体，其中，所述分离并重组的融合多聚肽体完全为人的或人源化的。
5.如权利要求1-4中任意一项所述的分离并重组的融合多聚肽体，其中，所述分离并重组的融合多聚肽体是多聚化的。
6.如权利要求1-5中任意一项所述的分离并重组的融合多聚肽体，其中，所述铰链部分为免疫球蛋白多肽区域，该区域位于人源化的软骨低聚基质多肽部分的羧基末端。
7.如权利要求1-6中任意一项所述的分离并重组的融合多聚肽体，其中，所述表皮生长因子受体的配体位于铰链部分的羧基末端。
8.如权利要求1-7中任意一项所述的分离并重组的融合多聚肽体，该分离并重组的融合多聚肽体还包括增强子序列，其中，所述增强子序列位于人源化的软骨低聚基质多肽部分的氨基末端。
9.如权利要求8所述的分离并重组的融合多聚肽体，其中，所述增强子序列选自包括YSFE、YSFED、YSFEDL、YSFEDLY、YSFEDLYR和YSFEDLYRR的组中。
10.如权利要求1-9中任意一项所述的分离并重组的融合多聚肽体，其中，所述表皮生长因子受体的配体选自下面的组中(a)表皮生长因子多肽或其片段或其变体，(b)生长阻断肽或其片段或其变体，(c)转化生长因子α多肽或其片段或其变体，(d)浆细胞扩散肽或其片段或其变体，(e)麻痹肽或其片段或其变体，(f)作用于心脏的肽或其片段或其变体，(g)双调蛋白多肽或其片段或其变体，(h)结合表皮生长因子的肝磷脂样多肽或其片段或其变体，(i)β动物纤维素多肽或其片段或其变体，或(j)病毒表皮生长因子样多肽或其片段或其变体。
11.如权利要求10所述的分离并重组的融合多聚肽体，其中，所述表皮生长因子受体的配体以其全长序列的形式存在。
12.如权利要求1-11中任意一项所述的分离并重组的融合多聚肽体，其中，该多聚肽体还包括聚组氨酸标签序列。
13.如权利要求1-12中任意一项所述的分离并重组的融合多聚肽体，其中，该多聚肽体还包括至少一个效应区域。
14.如权利要求13所述分离并重组的融合多聚肽体，其中，所述效应区域包括细胞毒素。
15.如权利要求13所述分离并重组的融合多聚肽体，其中，所述效应区域包括检测部分。
16.如权利要求15所述分离并重组的融合多聚肽体，其中，所述检测部分为荧光的。
17.一种分离纯化的DNA序列，其中，所述DNA序列编码权利要求1-13中任意一项所述的分离并重组的融合多聚肽体。
18.一种载体，该载体含有权利要求17所述分离纯化的DNA序列的至少一个拷贝。
19.如权利要求18所述的载体，其中，该载体还包括可操作地与所述分离纯化的DNA分子连接的启动子。
20.一种原核或真核宿主细胞，该宿主细胞能表达权利要求17所述分离纯化的DNA分子。
21.一种药物组合物，该组合物包括含有药剂有效量的权利要求1-16中任意一项所述分离并重组的融合多聚肽体作为活性物质，所述活性物质选择性地与药物适合的载体、稀释剂和辅料结合。
22.权利要求21所述药物组合物用于制备治疗或预防癌症的制剂的用途。
23.如权利要求22所述的用途，其中，所述癌症选自由癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、白血病、淋巴样恶性肿瘤、鳞状细胞癌、鳞状上皮细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺部腺癌、肺部鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃或胃部癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾腺癌、肾或肾脏癌、前列腺癌、阴门癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道癌以及头颈癌组成的组中。
24.如权利要求23所述的用途，其中，所述癌为头部癌、颈部癌、膀胱癌或黑素瘤。
25.一种治疗或预防表达表皮生长因子受体的癌症的方法，所述癌症选自由癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、白血病、淋巴样恶性肿瘤、鳞状细胞癌、鳞状上皮细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺部腺癌、肺部鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃或胃部癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾腺癌、肾或肾脏癌、前列腺癌、阴门癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道癌、以及头颈癌组成的组中，其中，该方法包括给予治疗对象治疗有效量的权利要求21所述的药物组合物。
26.如权利要求25所述的方法，其中，癌症为头部癌、颈部癌、膀胱癌或黑素瘤。
27.一种诱导凋亡和/或坏死的方法，该方法包括使细胞与权利要求1-16中任意一项所述分离并重组的融合多聚肽体接触。
28.如权利要求27所述的方法，其中，所述细胞为癌细胞。
29.一种抑制细胞增殖的方法，该方法包括使细胞与权利要求1-16中任意一项所述分离并重组的融合多聚肽体接触。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述细胞为癌细胞。
31.一种诊断癌症的方法，该方法包括给予治疗对象权利要求15或16所述分离并重组的融合多聚肽体，所述多聚肽体选择性地与药物适合的载体、稀释剂和辅料结合。
32.一种用于治疗表达病人体内表皮生长因子受体的癌症的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-16中任意一项所述分离并重组的融合多聚肽体，并选择性地带有试剂和/或使用说明书。
33.如权利要求32所述的试剂盒，所述试剂盒还包括单独的药物剂型，所述剂型包括附加的抗癌试剂，所述试剂选自由化疗剂、抗表皮生长因子受体抗体、放射免疫疗法试剂、以及它们的组合物组成的组中。
34.一种用于诊断表达病人体内表皮生长因子受体的癌症的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求15或16所述分离并重组的融合多聚肽体，并选择性地带有试剂和/或使用说明书。
35.一种制备权利要求1-16中任意一项所述分离并重组的融合多聚肽体的方法，该方法包括如下步骤a)构建编码权利要求1-13任意一项所述的分离并重组的融合多聚肽体的分离纯化的DNA分子，b)在细胞系统中以适宜的条件使所述分离纯化的DNA分子得到表达，c)复性所述分离并重组的融合多聚肽体。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述细胞表达系统为原核细胞。
37.如权利要求35或36所述的方法，其特征在于，所述适宜的条件为在10-40℃的温度下将细胞表达系统培养2-40个小时。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述适宜的条件为在37℃下培养8-16小时。
39.如权利要求35-38中任意一项所述的方法，其特征在于，所述步骤c)是通过从细胞表达系统中提取所述分离并重组的融合多聚肽体，随后进行纯化和重折叠步骤来完成的。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述纯化在还原剂存在下进行，结果除去杂质。
41.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述重折叠步骤通过直接在重折叠缓冲液中稀释完成，所述重折叠步骤还包括系列透析。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述直接在重折叠缓冲液中的稀释使所述分离并重组的融合多聚肽体的终浓度在300纳摩尔/升以下。
43.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述系列透析包括至少2种不同的透析缓冲液。
44.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述重折叠步骤存在于所述分离并重组的融合多聚肽体浓缩前的氧化过程中。
45.一种具有蛋白合成增强活性的分离纯化的增强子序列，其特征在于，所述分离纯化的增强子序列选自由YSFE、YSFED、YSFEDL、YSFEDLY、YSFEDLYR和YSFEDLYRR以及它们的片段、它们的分子嵌合体和它们的变体所组成的组中。
全文摘要
本发明是关于一种分离并重组的融合多聚肽体，该多聚肽体结合表皮生长因子受体成员，有助于抑制特定肿瘤细胞生长。本发明还公开了编码所述分离并重组的融合多聚肽体的核苷酸、含有所述分离并重组的融合多聚肽体作为活性物质的试剂盒和药物组合物。最后，本发明还提供了所述分离并重组的融合多聚肽体的制备方法，以及所述分离并重组的融合多聚肽体用于制备治疗或预防癌症的制剂的用途。
文档编号C12N15/62GK1798770SQ200480015267
公开日2006年7月5日 申请日期2004年4月5日 优先权日2003年4月4日
发明者D·德佩尔特, S·克卢捷, J·P·马克, N·奥莱, O·法塔赫 申请人:洛桑大学