基因组比较杂交的制作方法

专利名称：基因组比较杂交的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因组比较杂交的方法以及适合于基因组比较杂交的与固体基质连接的核酸。
背景技术：
染色体异常往往与遗传紊乱、变性疾病和癌症有关。染色体异常可有几种类型，包括额外的单个染色体或缺少的单个染色体、额外的部分染色体或缺少的部分染色体、断裂和染色体重排。染色体重排包括易位(从一个染色体上的一片转移至另一个染色体上)、双着丝粒(具有两个着丝粒的染色体)、倒位(染色体片段极性的反转)、插入、扩增和缺失。
许多原因使得检测胞内染色体的异常是重要的，不限于检产前染色体异常和植入前的遗传诊断，以及测定一些癌症的核型。
产前诊断涉及对胎儿物质的遗传测试。这通常包括取出围绕胎儿的羊水并分析羊水中细胞的染色体异常情况。产前诊断对于检测具有明显的染色体错误的胎儿是重要的。可检测到的染色体异常的频率约是每250人出生中仅有一人，而涉及染色体物质缺失或添加的异常往往导致胎儿的死亡或严重的智力或身体缺陷。例如，染色体21具有三份拷贝而非通常的两份拷贝或染色体21上亚区的部分复制会导致唐氏综合症。
植入前异常诊断(PGD)涉及植入前测试胚胎或卵(卵母细胞)的遗传物质。该方法通常涉及从体外受精的胚胎中取出一个或多个细胞并分析来确定胚胎是否适合于植入。在染色体异常是衍生自母体的情况中，也可取出卵母细胞的极体并检测到存在染色体异常。
植入前遗传诊断染色体异常对于检测适合于植入的胚胎或卵母细胞是重要的。早期人类胚胎有很高频率的染色体错误，包括非整倍性、多倍性和镶嵌现象，并且这些染色体错误可能会造成体外受精胚胎植入显著的失败率。此外，当胚胎或卵母细胞可能含有遗传自双亲的已知的染色体异常时，也可进行植入前诊断来选择不具有已知的染色体异常的胚胎或卵母细胞。
全染色体或染色体片段的拷贝的缺失或增殖也经常发生于癌性细胞中，在许多情况中这些染色体异常有助于细胞获得癌性表型。测定这种染色体异常不仅对于了解一些细胞如何从非癌性阶段发展到癌性阶段的遗传基础是重要的，而且在一些情况下对诊断和治疗具体的癌症提供有用的信息。
细胞遗传或荧光原位杂交法(FISH)技术常规用于检测染色体异常。然而，现在基因组比较杂交(CGH)提供了一种克服常规细胞遗传和FISH方法的许多局限性的强有力方法。CGH涉及用一种荧光染料标记的参考核酸群和用第二种荧光染料标记的样品核酸群与参考基因组(例如人中期染色体扩散)的全部或部分进行比较性、多染料的杂交。对参考基因组中各位置得到的荧光强度的比较确定了样品群中染色体序列的拷贝数。
虽然CGH改进了常规的细胞遗传和FISH技术，它仍有许多与CGH相关的缺陷，包括进行分析所需时间的长度。例如，完成具有中期扩散的标准CGH至少需要72小时，并且如果在取自胚胎的单细胞上进行PGD，然后胚胎在植入前必须基序冷冻保存以提供充足的时间来完成该过程。
本发明涉及鉴定一种进行基因组比较杂交的改进方法以及适合于基因组比较杂交的核酸阵列。
本说明书出于描述本发明各种方面的目的引用一些参考文献。然而，说明书中引用的任何参考文献均不构成现有技术。特别要理解的是，文中参考的任何文献在澳大利亚或任何其它国家均不构成本领域公知知识的一部分。对参考文献的讨论表明了其作者宣称的内容，申请人保留质疑文中所引用的任何文献的精确性和相关性的权利。
发明概述本发明提供将具有第一个核型的细胞的至少一条染色体或其一部分与具有第二个核型的细胞的对应染色体或其一部分进行比较的方法，所述的方法包括以下步骤(a)从分离的染色体或分离的染色体的一部分扩增DNA；(b)将扩增的DNA与固体基质相连；(c)从具有第一核型的一个或多个细胞扩增DNA和从具有第二核型的一个或多个细胞扩增DNA；(d)用第一标记来标记扩增自具有第一核型的一个或多个细胞的DNA以及用第二标记来标记扩增自具有第二核型的一个或多个细胞的DNA，其中第一种和第二标记有可检测的不同；(e)将来自具有一种核型的一个或多个细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交，并将来自具有第二核型的一个或多个细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交；和(f)比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一种和第二标记的相对量。
本发明也提供一种在检测具有未知核型的细胞中染色体异常的方法，所述的方法包括以下步骤(a)从分离的染色体或分离的染色体的一部分扩增DNA；(b)将扩增的DNA与固体基质相连；(c)从具有未知核型的一个或多个细胞扩增DNA和从具有参考核型的一个或多个细胞扩增DNA；(d)用第一标记来标记具有未知核型的一个或多个细胞的扩增DNA以及用第二标记来标记具有参考核型的一个或多个细胞的扩增DNA，其中第一种和第二标记有可检测的不同；(e)将来自具有未知核型的一个或多个细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交，并将来自具有参考核型的一个或多个细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交；和(f)通过比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一标记的的相对量和与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第二标记的量来检测具有未知核型的细胞内染色体异常的存在。
本发明也提供一种与固体基质相连的核酸，其中所述核酸衍生自分离的染色体或分离的染色体的一部分并且所述的核酸排除了重复序列。
本发明也提供一种与固体基质相连的核酸阵列，其中所述阵列中的每个核酸衍生自分离的染色体或分离的染色体的一部分并且每个核酸排除了重复序列。
本发明也提供一种与固体基质相连的核酸，其中所述核酸衍生自分离的染色体或分离的染色体的一部分的随机引物扩增，并且所述的核酸排除了重复序列、非染色体序列或由于扩增而超表现的序列中的一种或多种。
本发明也提供一种与固体基质相连的核酸阵列，其中所述阵列中的每个核酸衍生自分离的染色体或分离的染色体的一部分的随机引物扩增，并且每个核酸排了重复序列、非染色体序列或由于染色体或其一部分扩增而超表现的序列中的一种或多种。
本发明也提供一种衍生自分离染色体或分离染色体的一部分的随机引物扩增的核酸，其中所述核酸排除了重复序列。
本发明起因于在单一的羊水细胞和淋巴细胞中检测三体性13和18的研究。尤其是，惊人地发现，通过用与固体基质相连的分离的染色体或其一部分的随机引物扩增的产物取代通常使用的中期扩散可显著提高在单细胞中用基因组比较杂交检测这种三体性。以这种方式进行的基因组比较杂交需要的时间比使用中期扩散基序常规方法需要的时间少(总共约30小时)。
说明书中使用的各种术语具有可被技术人员很好地理解的意义。然而，为了便于参考，现定义一些术语。
说明书中使用的术语“细胞”应理解为指一种体细胞、一种生殖细胞、一种任何倍性的细胞或其中具有一种或多种染色体(或一种或多种染色体的一部分)的任何细胞衍生体。细胞衍生体的例子包括与未受精卵母细胞相关的极体、在卵母细胞被精子受精时被卵母细胞逐出的极体、分离自细胞的核或核的一部分、线粒体或叶绿体。
文中使用的术语“核型”应理解为指细胞的染色体构成，其在单一种类的个体之间有变化。
在这方面，术语“未知的核型”应理解为指细胞内的一种或多种染色体的核型是未知的。术语“参考核型”应理解为指另一种细胞的核型要靠这种核型来测试的一种细胞的核型。具有参考核型的细胞可具有一种已知的核型(例如一种常规核型或一种具体的染色体的已知的缺失或增殖)或可具有一种或多种染色体的未知核型。具有未知核型的细胞是来自胎儿、胚胎、卵母细胞或癌症细胞，而具有参考核型的细胞是具有常规核型的相同类型的细胞或类似的细胞。
说明书中使用的术语“分离的染色体或分离的染色体的一部分”应理解为指一种分离的染色体或一种分离的染色体的任何部分。在这方面，染色体的一部分应理解为包括通过，例如显微切割或流式细胞术或含有染色体(基因组)DNA的任何克隆来分离的染色体的一部分。这种克隆的例子包括含有基因组DNA的BAC、YAC和P1克隆，或者具有基因组DNA克隆进合适载体的任何其它克隆。
在这方面，术语“染色体”也应理解为指存在于任何倍性(例如单倍体、二倍体或多倍体)的细胞中的染色体，包括性染色体、常染色体、线粒体染色体、叶绿体染色体或附加体。
说明书中使用的术语“扩增”或其变体应理解为指核酸序列的额外拷贝的生产。例如，可使用聚合酶链式反应(PCR)技术(基本上如Dieffenbach，C.W.和G.S.Dveksler所述，(1995).《PCR引物，一本实验室手册》(PCR Primer，a LaboratoryManual)，冷泉港出版社，Plainview，纽约)或通过其它扩增方法(例如在环形模板上进行滚环扩增，如Fire，A.和Xu，S-Q.所述，(1995)，Proc.Natl.Acad.Sci924641-4645)实现扩增。
在这方面，术语“随机引物扩增”应理解为指利用一种或多种引物的扩增，该引物基本上导致整个目标的扩增。例如，可使用一种或多种引物实现随机扩增，所述引物包括一种或多种随机核苷酸的序列、长度足够使引物在选择的条件下与靶核酸在随机位置杂交并用作聚合酶延长的引物的随机核苷酸序列。例如，引物可是包括随机序列的六个或多个毗邻核苷酸的延伸段的引物。
此外，可用固定序列的一种或多种引物实现随机扩增，但为能随机扩增目标，扩增反应的严谨性要足够低，特别是在扩增过程的早期循环中。
此外，将会意识到从一种或多种细胞中扩增DNA不仅包括扩增一种或多种细胞的整个染色体内含物，还包括扩增衍生自一种或多种细胞的分离的染色体或其任何部分。例如，扩增用于分析的DNA可通过显微切割或流式细胞术分离的单一染色体、通过显微切割分离的染色体的一部分或作为基因组DNA的克隆片段的染色体的一部分。
说明书中使用的与扩增的DNA相关的术语“连接”或其变体应理解为指任何形式的固定到固体基质上的扩增DNA，包括被动吸收到固体基质上、通过合适的化学基团使DNA与固体基质共价连接或使用特定的彼此具有高亲和力的化学基团将DNA固定到固体基质上(例如生物素和链霉抗生物素蛋白)。
说明书中使用的术语“固体基质”应理解为指能使核酸空间固定到支持物上并使核酸在杂交过程中在支持物上保持固定的任何固体支持物。固体支持物的例子包括玻璃、尼龙或其它类型的膜、过滤器和芯片。
在这方面，应理解的是该核酸无需永久固定在支持物上，并且如果需要该核酸可被固定在支持物上，然后在选择的条件下从支持物上移走核酸。
说明书中使用的术语“染色体异常”应理解为指可使用基因组比较杂交来杂交检测的部分染色体的任何变化或改变。
说明书中使用的术语“生殖细胞”应理解为指一种生殖的细胞、一种配子或可发育为生殖细胞的细胞。例如，生殖细胞包括精母细胞或卵母细胞。
说明书中使用的术语“重复序列”应理解为指基因组中存在多于一份拷贝的核酸中存在的任何序列。重复序列的每份拷贝与所有其它的拷贝无需相同，只要序列充分相似使得在使用杂交条件下相同的探针核酸片段能与每份拷贝形成稳定的杂交体。重复序列的例子包括简单重复的DNA(例如，Alu或Kpn元件)、卫星重复序列、小卫星重复序列、染色体特异的重复序列、微卫星重复序列、重复基因(例如，rRNA基因)、衍生自转座元件的序列(例如，具有DNA或RNA中间体的转座子)、衍生自病毒(例如，逆转录病毒)的多拷贝的元件、与着丝粒或端粒相关的重复序列或与异染色质相关的重复序列。
说明书中使用的术语“核酸”应理解为指一种单链或双链形式的、由脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的多核苷酸。
说明书中使用的与核酸相关的术语“分离的”应理解为指从至少一种其它成分(例如，核酸或多肽)分离的核酸，该成分在其天然资源中与所述的核酸一起存在。
说明书中使用的术语“非染色体序列”应理解为指核酸样品中的任何序列，该序列一般不出现在核酸样品的基因组的核苷酸序列中或不出现在一种或多种染色体或其一部分的核苷酸序列中。这种非染色体序列的例子包括衍生自载体或质粒的序列、或因制备而出现在核酸样品中的污染序列，例如细菌(例如，大肠杆菌)的序列。
说明书中使用的术语“由于扩增而超表现的序列”或“超表现序列”应理解为指相比于其它正常出现在目标中的序列，那些在目标扩增后出现的、被不成比例地扩增的序列。
附图简述

图1显示了如实施例2所述的人染色体(常染色体1-22；性染色体X、Y)的再扩增DNA文库的电泳。也显示了大小标记(λHindll，Puc19 Hpall)。
图2显示了如实施例3所述的人染色体的再扩增DNA文库的FISH结果。使用来自正常男性外周血的淋巴细胞的中期染色体扩散进行。使用SpectrumGreen-dUTP或SpectrumRed-dUTP通过DOP-PCR扩增来标记DNA探针。除了染色体21的DNA文库信号微弱外，所有其它均匀地上其整个靶染色体或q臂。
图3显示了如实施例4所述使用加载的384孔板描述预期的DNA阵列样式。
图4显示了如实施例4(ii)生产第二代阵列中所述的在大小选择之前、期间或之后再扩增的DNA文库的电泳结果。
图5显示了如实施例10所述的47、XX、+13(绿)细胞对46、XY(红)细胞的分析数据的图像和图示。
图6显示了如实施例10所述的47、XY、+18细胞对46、XX细胞的分析数据的图像和图示。
图7是如实施例11所述的代表实验的图像之一。
图8显示了如实施例12所述的用核型47、XY、+18对46、XX单细胞进行的分析实验的图像。
图9显示了分离成纤维细胞的方法。成纤维细胞悬浮液通过显微镜载玻片上建立的4个池稀释到在1×PCR缓冲液#3池中仅有约100个细胞的点。这100个细胞在该池内洗涤数次，然后转移至0.5ml无菌的PCR管中。从#3池中吸出1×PCR缓冲液(＜0.3μl)并用作阴性对照。
图10中上面一幅显示了100个成纤维细胞(47、XY、+18、Cy3)对正常男性基因组DNA(46、XY、Cy5)的阵列CGH实验的结果。图10中下面一幅显示了100个成纤维细胞(47、XY、+18、Cy3)对5到10个单一正常男性细胞的合并混合物(46、XY、Cy5)的阵列CGH实验的结果。
图11中上面一幅显示了DOP-PCR扩增的Cot-1 DNA的琼脂糖电泳。图11中下面一幅显示了用Cy3-dUTP标记的单一女性细胞对用Cy5-dUTP标记的多于5个单一男性细胞的合并混合物的阵列CGH实验的结果，该实验使用140μl的DOP-PCR扩增的Cot-1 DNA代替70μg市售的Cot-1 DNA(Invitrogen)。
图12显示了从IVF形成的卵裂阶段胚胎的单一裂球产生的Cy3标记的DOP-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。三个供研究用的冷冻胚胎中的每一个均存在四个裂球并且所有的四个裂球解离导致总共12个分离的单一裂球。预扩增每个细胞的DNA，然后通过DOP-PCR用Cy3标记。每个样品的起点显示于每条泳道的上面。DNA标记是SPP-1/EcoR1(M1)和pUC19/Hpall(M2)。要注意的是，每个标记的产物在1％琼脂糖凝胶上得到从300bp到2,500bp的成片条带并在约450bp和600bp处含有两个特异的条带。
图13的上面一幅显示了DOP-PCR扩增的BAC的DNA的琼脂糖电泳。样品的起点显示在每条泳道的上面1(RP-11-265k23)、2(RP-11-849)、3(RP-11-354m20)、4(RP-11-280F22)、5(RP-11-113m14)、6(RP-11-70E19)、7(RP-11-10P15)和8(RP-11-506P9)。DNA标记是SPP-1/EcoRI(M1)和pUC19/Hpall(M2)。图13的下面一幅显示了DOP-PCR扩增的除去重复序列的BAC的DNA的琼脂糖电泳。样品的起点显示在每条泳道的上面1(RP-11-265k23)和2(RP-11-354m20m、RP-11-280F22、RP-11-113m14、RP-11-70E19、RP-11-10P15和RP-11-506P9的混合物)。DNA标记是SPP-1/EcoR1(M1)和pUC 19/Hpall(M2)。
图14的上面一幅显示了扩展的长模板PCR扩增产物的琼脂糖电泳。样品的起点显示在每条泳道的上面。DNA标记是SPP-1/EcoR1(M1)。图14的下面一幅显示了使用扩展的长模板PCR扩增产物作为模板的DOP-PCR产物的琼脂糖电泳。DYS基因座的起点显示在每条泳道的上面。DNA标记是SPP-1/EcoR1(M1)和pUC19/Hpall(M2)。
图15的上面一幅显示了Cy3标记的女性单细胞SEP-PCR产物的琼脂糖电泳。使用四种不同的条件进行PCR扩增并且四种单细胞分别在每种条件下扩增。每个样品的起点显示在每条泳道的上面。DNA标记是SPP-1/EcoR1(M1)和pUC19/Hpall(M2)。要注意的是，每个标记的产物在1％琼脂糖凝胶上得到从300bp到2,500bp的成片条带并在约450bp和600bp处含有两个特异的条带。图15的下面一幅显示了Cy5标记的男性单细胞SEP-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。使用四种不同的条件(细节见上文)进行PCR扩增并且四种单细胞分别在每种条件下扩增。每个样品的起点显示在每条泳道的上面。DNA标记是SPP-1/EcoR1(M1)和pUC19/Hpall(M2)。要注意的是，每个标记的产物在1％琼脂糖凝胶上得到从300bp到2,500bp的成片条带。
发明详述如上所述，本发明的一个实施形式是提供将具有第一个核型的细胞的至少一条染色体或其一部分与具有第二个核型的细胞的对应染色体或其一部分进行比较的方法，所述的方法包括以下步骤(a)从分离的染色体或分离的染色体的一部分扩增DNA；(b)将扩增的DNA与固体基质相连；(c)从具有第一核型的一个或多个细胞扩增DNA和从具有第二核型的一个或多个细胞扩增DNA；(d)用第一标记来标记具有第一核型的一个或多个细胞的扩增DNA以及用第二标记来标记具有第二核型的一个或多个细胞的扩增DNA，其中第一种和第二标记有可检测的不同；(e)将来自具有第一核型的一个或多个细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交，并将来自具有第二核型的一个或多个细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交；和
(f)比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一种和第二标记的相对量。
本发明的这种实施形式使得具有第一核型的细胞中的一种或多种染色体或一种或多种染色体的区域的拷贝数可与具有第二核型的细胞中的对应的染色体或区域相比。这样，本发明的这种实施形式可用于，例如产前遗传诊断、植入前遗传诊断、性别测定或选择或测定癌性或其它体细胞的核型。
本发明的这种实施形式的方法优选用于胚胎或卵母细胞的植入前诊断染色体异常、或产前诊断胎儿的染色体异常。
具有第一核型的细胞优选是未知核型的，而具有第二核型的细胞优选是已知核型的。例如，具有第一核型的细胞在特定的染色体位置可具有未知的染色体异常，而具有第二核型的细胞在对应的染色体位置可具有已知的正常染色体。
在这方面，本发明的这种实施形式在检测细胞内总的染色体区别(例如缺失、复制或扩增)中是有用的。可用本发明检测的病症的例子包括三体性21、13和18，并且也可用于检测缺少染色体，例如特纳综合症(45，XO)。
应该明白的是，本发明可用于比较具有第一核型的细胞和具有第二核型的细胞中的所有染色体。然而，依赖连接在固体基质上的扩增DNA，本发明也可用于在细胞之间比较一种或多种具体染色体的部分。
待比较的染色体可是有任何倍性(单倍体、二倍体或多倍体)的细胞中的任何染色体，包括性染色体、常染色体、线粒体染色体、叶绿体染色体或附加体。染色体优选性染色体或常染色体。最优选的染色体是常染色体。
类似地，待比较的分离染色体的一部分可是在有任何倍性(单倍体、二倍体或多倍体)的细胞中存在的任何染色体的一部分，包括性染色体、常染色体、线粒体染色体、叶绿体染色体或附加体。染色体的一部分优选性染色体或常染色体的一部分。染色体的一部分最优选常染色体的一部分。
具有第一核型的细胞可是任何细胞，只要其核型(第一核型)与另一种细胞的核型(第二核型)进行比较。具有第一核型的细胞可是真核细胞或原核细胞。优选的细胞是真核细胞。更优选的细胞是动物或人的细胞。最优选的细胞是人的细胞。
具有第一核型的细胞优选胎儿细胞、衍生自胚胎的细胞、生殖细胞、癌性细胞或任何其它类型的体细胞，该体细胞具有与其它细胞的核型相比较的核型。具有第一核型的细胞更优选胎儿细胞、胚胎细胞(包括裂球)或生殖细胞。最优选的细胞是胚胎细胞或卵母细胞。
胎儿细胞的例子包括取自围绕胎儿的羊水的胎儿细胞、取自母体循环的胎儿血细胞或取自母亲生殖道(例如，宫颈或阴道灌洗)的胎儿细胞。在这方面，胎儿血细胞不同于成熟的血细胞，它是有核的并可从母体循环中分离。
就胚胎细胞而言，可从胚胎中取出少量的细胞(通常是一个或两个细胞)。在该方法中，通过卵裂阶段胚胎活检取出胚胎中一个或多个细胞。该方法一般在发育的第三天，当胚胎处于6-8个细胞阶段进行。活检由两个阶段组成。在此时，首先一般用酸性台氏液或非接触性激光在围绕胚胎的透明带中开个孔。孔一旦开好，就可从胚胎中取出细胞。
就生殖细胞(例如卵母细胞或精细胞)而言，生殖细胞可直接分析。此外，就筛选母体异常而言，可从卵母细胞分离极体。
就癌性细胞或任何其它体细胞而言，可通过合适的本领域已知方法从受试者获得一个或多个细胞，例如细胞的直接活检或从血液中分离。
在这方面，更精确地测定核型无需大量细胞，并且在某些情况中，优选分离相对小量(例如1到20个细胞)的细胞。
具有第二核型的细胞可是任何细胞，只要其核型是要与具有第一核型的细胞的核型进行比较。具有第二核型的细胞优选与具有第一核型的细胞的类型相同或类似。
在本发明的各种实施形式中，分离的染色体可是通过本领域已知的方法基本上从其它染色体纯化得到的任何染色体。例如，可通过如Meltzer等所述的显微切割((1992)Nature Genetics124-28)分离染色体。此外，可通过如Telenius等所述的流式细胞术((1992)Genes，Chromosomes & Cancer4257-263)分离染色体。
就显微切割而言，首先处理细胞迫使它们进入中期并用极细的针分离出完整的染色体。就流式细胞术而言，染色体可用具体的染色体染色试剂染色并通过分选和每个染色体相关的荧光程度来分离染色体。
在本发明的各种实施形式中，分离染色体的一部分可是分离的染色体的任何部分，该染色体的核型与另一个细胞中相同染色体的对应部分比较。
染色体的一部分可通过合适的已知方法分离，包括从上述的中期染色体中显微切割特定的染色体条带。
此外，染色体的一部分可是通过将基因组DNA片段克隆进合适的载体分离的染色体的克隆片段。分离大的和小的基因组片段及其克隆进载体的方法基本上描述于Sambrook，J，Frisch，E.F.和Maniais，T.《分子克隆实验室手册》(MolecularCloningALaboratory Manual)，第二版.冷泉港实验室出版社，纽约，(1989)。例如，为生产用于克隆进载体(例如，YAC)的大基因组片段，用限制性内切酶部分消化基因组DNA并将得到的片段克隆进载体。然后可用合适的本领域已知方法纯化具有克隆的插入DNA的分离载体。适合用于克隆大基因组片段的载体的例子是YAC载体、BAC载体、P1载体或粘粒。
在本发明的各种实施形式中，从分离的染色体或分离的染色体的一部分扩增DNA可通过允许生产该DNA其它拷贝的本领域已知的合适方法实现。例如，就通过显微切割或流式细胞术分离的完整染色体而言，或通过显微切割分离的其一部分而言，该DNA可用基本上如Dieffenbach，C.W.和G.S.Dveksler((1995)，《PCR引物，实验室手册》(PCR Primer，a Laboratory Manual)，冷泉港出版社，纽约)所述的PCR技术扩增。
在这方面，如果核酸通过扩增方法生产，该核酸就可衍生自扩增产物，并且包括衍生自扩增方法、接着在扩增后经过一次或多次处理的核酸。
就克隆进环形载体的染色体的一部分而言，扩增可通过如PCR扩增或使用如Fire，A.和Xu，S-Q所述的滚环扩增((1995)，Proc.Natl.Acad.Sci924641-4645)实现。
从分离的染色体或分离的染色体的一部分的扩增DNA优选导致基本上整个目标的扩增。
因此，在本发明各种实施形式中，分离染色体或分离染色体的一部分的扩增优选随机引物扩增来实现基本上整个目标的扩增。
可使用一种或多种合适的引物从分离的染色体或分离的染色体其一部分扩增DNA。如上所述，优选使用一种或多种引物导致分离的染色体或分离的染色体的一部分的随机扩增。
使用的一种或多种引物优选是包括随机序列的一个或多个核苷酸的寡核苷酸。一种或多种引物更优选是包括随机序列的一个或多个毗邻核苷酸的寡核苷酸。一种或多种引物更优选是包括随机序列的6个或更多毗邻核苷酸的寡核苷酸，例如DOP引物(简并寡核苷酸引物)。一种或多种引物最优选是具有以下核苷酸序列的引物5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′；其中NNNNNN代表简并序列。“N”是任何核苷酸，即N代表DNA序列中四种可能的核苷酸，分别是“A”(腺嘌呤)、“T”(胸腺嘧啶)、“C”(胞嘧啶)、“G”(鸟嘌呤)。这样，简并序列含有各种核苷酸序列的混合物包括在“N”位置处A、T、C和G的所有可能的组合。
如果需要，简并序列的核苷酸序列也可偏向于特定的核苷酸组成，例如富含GC或AT。
在使用DOP引物通过显微切割或克隆进载体而分离的染色体或染色体的一部分上进行扩增的情况下，基本上可如Telenius等(Genomics，18718-725，(1992))所述进行扩增。简言之，在低严谨条件下进行循环数量少(例如，5轮)的扩增，而在较高的严谨条件下进行循环数量多(例如，35轮)的第二阶段扩增。
此外，随机引物扩增可通过以下步骤进行使用一个或多个固定序列的引物并在低严谨条件下进行循环数量少的扩增，这使得一个或多个引物在整个目标上随机引发合成，然后在更严谨条件下进行通常循环数量较多的第二阶段扩增。
此外，为说明可能会给实现基本上整个目标的随机引物扩增带来困难的小染色体的区域，区域特异性引物也可与允许随机扩增的其它引物联用。例如，对染色体21和22的区域特异的引物可与DOP引物联用。
因此，在本发明优选的实施形式中，从分离染色体或分离染色体的一部分扩增DNA还包括扩增特异性的染色体区域。
其它合适的用于扩增分离的染色体或分离染色体的一部分的技术包括引物延伸预扩增PCR(PEP-PCR)，这种技术基本上如Zhang等((1992)，Proc Natl.Acad.Sci895847-5851)所述进行；连接介导的PCR可基本上如Klein等((1999)ProcNatl.Acad.Sci964494-4499)所述进行；或alu-PCR可基本上如Nelson等((1989)Proc.Natl.Acad.Sci.866686-6690)所述进行。
就在环形载体中克隆的基因组插入体上使用滚环扩增而言，滚环扩增可在本领域已知的合适的条件下进行，例如Fire，A.和Xu，S-Q在(1995)，Proc.Natl.Acad.Sci924641-4645中所述。
在本发明的各种实施形式中，从分离的染色体或分离染色体的一部分扩增的DNA在与固体基质连接之前还优选要经过大小选择。与固体基质连接的扩增DNA的大小优选小于10kb。与固体基质连接的扩增DNA的大小更优选小于3kb。
大小选择可通过本领域已知的合适方法进行。例如，扩增的DNA可在琼脂糖凝胶上进行电泳，并分离大小150到3000bp的DNA。
在本发明优选的实施形式中，与固体基质连接的核酸是分离的染色体或分离染色体的一部分的随机引物扩增产物，其中核酸已经过大小选择。
在这种情况中，与固体基质相连的随机扩增DNA的体积优选小于10kb。与固体基质相连的随机扩增DNA的大小更优选小于3kb。例如，随机扩增的DNA可在琼脂糖凝胶上进行电泳，并分离大小150到3000bp的DNA。
在其它的优选实施方案中，本发明的各种实施形式中从分离的染色体或分离染色体的一部分扩增DNA排除了重复序列、非染色体序列或由于扩增而超表现的序列中的一种或多种。本领域大量的已知方法可用于排除这种序列的扩增DNA。
重复序列是要扩增的靶序列中存在于多于一份拷贝中的序列。非染色体序列是染色体或其一部分中一般不存在的序列，例如衍生自载体或质粒的序列、或存在于要扩增的最初靶样品中的污染序列，例如细菌的序列(例如，衍生自大肠杆菌的序列)。由于染色体扩增而超表现的序列指相比于其它正常出现在目标中的序列，那些在目标扩增后出现的、被不成比例地扩增的序列。
重复序列和/或非染色体序列可在扩增前或后除去。例如，可分离染色体DNA并除去重复序列和/或非染色体序列。此外，首先可用合适的引物扩增DNA，再从核酸的扩增库中除去重复的DNA序列和/或非染色体序列。
重复序列的例子包括简单重复的DNA(例如，Alu或Kpn元件)、卫星重复序列、小卫星重复序列、染色体特异性的重复序列、微卫星重复序列、重复基因(例如，rRNA基因)、衍生自转座元件的序列(例如，具有DNA或RNA中间体的转座子)、衍生自病毒(例如，逆转录病毒)的多拷贝的元件、与着丝粒或端粒相关的重复序列或与异染色质相关的重复序列。
大量本领域已知的方法可用于除去重复序列。例如，在许多基因组(例如人基因组)中，重复DNA的主要部分包含于一些种类的高度重复序列(例如，Alu)中。为除去这种重复序列，可使用一种封闭方法。这些方法主要基于互补核酸链的杂交率随浓度增加而增加的事实。所以，如果核酸片段的混合物被变性并在允许杂交的条件下孵育，高浓度时出现的序列比其它序列更快变为双链。然后该双链核酸可用本领域已知的方法直接除去这些序列而除去。
例如，单链和双链核酸对羟基磷灰石具有不同的结合特性。这种特性提供了通常用于核酸分级的基础。包含具有特定程度重复的序列的基因组DNA组分可通过以下方式获得使基因组DNA变性、在合适的条件下使之重缔合、然后用羟基磷灰石分离。这种技术描述于Britten等.，“通过重缔合分析重复DNA序列”(Analysis of Repeating DNA Sequences by Reassociation)，Methods in Enzymology22363-418(1974)。
可用于排除扩增DNA的重复序列的这种序列的例子包括人Cot-1 DNA和含有DNA的Alu-重复序列。
此外，可进行与固定化核酸的反应。例如，最小剪切的人基因组DNA与重氮纤维素等支持物结合。适当地切成片段的扩增DNA与固定化DNA进行杂交至Cot值约为1到100。然后，未与固定化核酸结合的物质可与固体基质相连。
就从基因组克隆中排除的重复序列而言，重复序列也可从基因组DNA的克隆中排除(例如，在克隆过程中除去)，得到的排除了重复序列的克隆用于扩增。此外，在克隆扩增后可以上述方式排除重复序列。
类似地，非染色体序列可在靶序列扩增之前或之后排除。可以和上述排除重复序列相似的方式，在与目标或扩增DNA的杂交反应中过量使用非染色体序列来排除非染色体序列，或通过将非染色体序列与固体支持物相连并使用这些序列来排除这些序列的DNA。
在排除由于扩增而超表现的序列的情况中，这些序列可通过与上述类似的方法从靶序列中排除或在扩增后排除超表现序列。应该明白的是，需要了解被超表现的实际序列，并且这取决于使用的引物和扩增的靶序列的性质。
使用相同引物扩增重复序列来源从而同时排除超表现序列和重复序列，该引物用于从分离的染色体或分离染色体的一部分扩增DNA。然后，扩增的重复核酸可用于排除超表现和重复序列的扩增DNA。例如，可在Cot-1 DNA上进行DOP-PCR，并且得到的扩增产物用于从分离的染色体或分离染色体的一部分除去扩增的DNA。
在本发明的各种实施形式中，固体基质是能使核酸空间固定到支持物上并使核酸在杂交期间和以后在支持物上保持固定的任何固体支持物。固体支持物的例子包括玻璃、尼龙或其它类型的膜、过滤器和芯片。
扩增的DNA可通过合适的本领域已知的方法与各种形式的固体基质相连，包括被动吸附或共价连接。例如，扩增的DNA可通过以下方式经被动吸附与玻璃基质相连将样品点样在PolysineTM显微镜载玻片(Menzel-Glaser，德国)上，然后通过脱水、快干、通过紫外交联固定并使用琥珀酸酐化学封闭来处理载玻片。就共价连接而言，扩增的DNA可通过本领域已知的合适方法与固体基质相连。
优选多种扩增的DNA与固体基质相连来产生沉积DNA的阵列。这种阵列可以本领域已知的任何所需的方式生产，包括扩增DNA的机器人沉积。生产阵列的方法的例子基本上描述于美国专利5,486,452；5,830,645；5,807,552；5,800,992和5,445,934。
可在固体基质上沉积任何适量的DNA。沉积核酸的量可从约0.05nl到5.0nl的核酸溶液，该核酸的浓度为0.15-1μg/μl。例如，就1,000DNA沉积/cm的密度而言，沉积的个体量约是0.2nl到2.0nl的1μg/ml溶液。DNA可以允许核酸沉积的任何的溶剂提供。
具有沉积DNA的阵列可以任何排列方式。例如，DNA可位于阵列的一个部分或分散在其它沉积的核酸中。优选两维阵列的一致性。
阵列还优选包括各种控制核酸，例如具体表达基因或基因组序列的拷贝数已知的打点核酸。例如，可使用从细胞系中提取的具有1份或多份特定染色体拷贝的基因组DNA，或也可使用从单细胞扩增DNA的整个DOP-PCR产物。
有待分析的细胞数目不受具体限制，可从单个细胞(例如分离自胚胎)到大量的细胞(例如分离自组织活检或血液)。例如，本发明的方法可应用于对分离自胚胎或卵母细胞的极体的单细胞进行PGD，胎儿细胞的产前诊断或测定通过活检分离自受试者或从血液中分离的癌性细胞或其它体细胞的核型。
在产前诊断的情况中，例如，有待分析的细胞的数目也不受具体限制，优选少于500个细胞，更优选少于400个细胞，最优选少于100个细胞。合适的范围是50-400个细胞。
具有第一核型的一个或多个细胞的扩增DNA优选是从1到20个细胞扩增的DNA。
在本发明优选的实施形式中，有待分析的细胞是单细胞或少量的细胞，其范围是2到20个细胞。
要从中提取和扩增DNA的具有第一核型的细胞数目优选与要从中提取和扩增DNA的具有第二核型的细胞数目相同或相似。例如，在对分离自胚胎或卵母细胞的极体的单细胞进行PGD的情况中，优选使用另一来源的单细胞作比较。
在本发明的各种实施形式中，为从细胞中获取DNA用于扩增，可使用本领域已知的合适方法来裂解细胞并取得DNA。例如，用氢氧化物水溶液处理细胞，接着中和裂解细胞并使得提取的DNA直接扩增。
扩增优选导致基本上整个提取的DNA的扩增。因此，DNA的扩增优选随机引物扩增。
因此，从具有第一核型的一个或多个细胞和具有第二核型的一个或多个细胞扩增DNA优选随机引物扩增。
在本发明的各种实施形式中，从细胞扩增DNA可用一个或多个合适的引物进行。如上所述，一些使用一个或多个引物可导致DNA的随机扩增。
为从一个或多个细胞中扩增DNA，可用一个或多个合适的引物通过本领域已知的合适方法(PCR)扩增提取的DNA。
用于扩增的所述一个或多个引物优选包括随机序列的一个或多个核苷酸的寡核苷酸。所述的一个或多个引物更优选包括随机序列的一个或多个毗邻核苷酸的寡核苷酸。所述的一个或多个引物还要优选包括随机序列的6个或更多毗邻核苷酸的寡核苷酸，例如DOP引物(简并寡核苷酸引物)。所述的一个或多个引物最优选是具有以下核苷酸序列的引物5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′；其中NNNNNN代表简并序列。“N”是任何核苷酸，即N代表DNA序列中四种可能的核苷酸，分别是“A”(腺嘌呤)、“T”(胸腺嘧啶)、“C”(胞嘧啶)、“G”(鸟嘌呤)。这样，简并探针序列含有各种探针的混合物包括在“N”位置处A、T、C和G的所有可能的组合。
如果需要，简并序列的核苷酸序列也可偏向于特定的核苷酸组成，例如富含GC或AT。
在使用DOP引物扩增的情况中，扩增基本上可如Telenius等((1992)Genomics18718-725，(1992))所述进行。简言之，在低严谨条件下进行循环数量少(例如，5轮)的扩增，而在更严谨条件下进行循环数量较多(例如，35轮)的第二阶段扩增。
此外，随机引物扩增可通过以下步骤进行使用一个或多个固定序列的引物并在低严谨条件下进行循环数量较少的扩增，这使得一个或多个引物在整个目标序列上引发随机合成，然后在更严谨条件下进行循环数量较多的第二阶段扩增。
其它扩增提取的DNA的合适技术包括引物延伸预扩增PCR(PEP-PCR)，这种技术基本上如Zhang等((1992)，Proc Natl.Acad.Sci895847-5851)所述进行；连接介导PCR，该技术基本上如Klein等((1999)Proc Natl.Acad.Sci964494-4499)所述进行；或alu-PCR，该技术基本上如Nelson等((1989)Proc.Natl.Acad.Sci.866686-6690)所述进行。
扩增可在本领域已知的合适条件下进行。例如，为通过PCR扩增从分离自血液的单一淋巴细胞的基因组DNA，通过以下方式实现单细胞的裂解用裂解缓冲液(200mM KOH，20mM二硫苏糖醇)于65℃处理10分钟，然后用pH8.3的300mMKCl、900mM Tris-HCl中和。可向裂解和中和溶液中加入合适的PCR缓冲液、Taq聚合酶并按以下步骤进行扩增95℃5分钟的初始变性步骤；然后以94℃1分钟、30℃1.5分钟和72℃3分钟(上升幅度为每4秒1℃将温度从30℃升至72℃)为循环条件进行8轮低严谨扩增；然后以94℃1分钟、30℃1.5分钟和72℃3分钟以及每轮循环加14秒的延伸步骤为条件进行26轮的高严谨扩增。然后可进行72℃10分钟的延伸步骤来完成扩增。
从具有第一核型的一个或多个细胞提取的DNA和从具有第二核型的一个或多个细胞提取的DNA优选用相同的引物扩增，并优选也在相同的条件下扩增。以此种方式，扩增反应得到的延伸产物的质量与数量是可比较的。
从具有第一核型的一个或多个细胞扩增的DNA和从具有第二核型的一个或多个细胞扩增的DNA均优选排除重复序列。排除扩增自细胞的DNA的方法如前述的从分离的染色体或分离染色体的一部分中排除重复序列的相关方法。
重复序列优选是Cot-1序列。
也可期望将具有第一核型的细胞中的特定染色体区域或基因与具有第二核型的细胞中的相同区域或基因进行比较。
所以，可在反应混合物中存在的其它引物中加入一种特定的引物或一组特定的引物。此外，该特定的引物或一组特定的引物也可用作仅有的引物来扩增提取的DNA。
用于扩增染色体的特定区域的引物的例子是小染色体(例如，染色体21和22)的引物。在这种情况中，优选将这种引物加入随机扩增基因组DNA的一组引物中，例如DOP引物。
在需要扩增特定的染色体区域、特定的基因座、或一个或多个特定的基因的情况中，针对特定区域的引物可单独使用或与其它引物联用，例如随机扩增基因组DNA的DOP引物。例如，可扩增染色体区域来分析染色体异常，包括涉及各种疾病(例如地中海贫血、杜兴肌营养不良、X-连锁疾病(X-linked disorders)和血友病)的区域。应该理解的是，本发明的方法在检测主要的染色体异常(例如缺失和增殖)中有用，并且扩增的特定基因座需要携带这种异常使其可被本发明的方法检测。
合适的扩增特定的染色体区域的引物可从已知的核苷酸序列鉴定。在扩增人的特定染色体区域的情况中，合适的引物可通过商业化的Celera核苷酸序列数据库或来自NCBI的公开可用的核苷酸序列数据库来选择。
例如，囊性纤维化基因(CFTR)的外显子11可使用嵌套式PCR方法扩增。第一轮可使用以下引物5′-TGAAATAATGGAGATGCAATGTTC-3′；和5′GCACAGATTCTGAGTA ACCATAAT3′第二轮可使用以下引物5′-CAACTGTGGTAAAGCAATAGTGT-3′；和5′-TACCAAATCTGGATACTATACCAT-3′
合适的第一轮扩增条件包括来自从单细胞扩增DNA的1/10DOP-PCR混合物、50mM KCl、10mM Tris-HCl、pH8.3、100μM各种dNTP、2.5mM MgCl2和1U taq聚合酶，在具有热阀帽(hot bonnet)的MJ Researcher PTC-100PCR仪上按以下条件进行将反应试管置于96℃封闭并进行初始的94℃5分钟的变性步骤，以94℃30秒、62℃45秒、72℃45秒为循环条件，共进行30轮。第二轮PCR由3μl第一轮PCR的扩增产物、50mM KCl、10mM Tris-HCl、pH8.3、100μM各种dNTP、2.5mMMgCl2和1U taq聚合酶组成。在具有热阀帽(hot bonnet)的MJ Researcher PTC-100PCR仪上按以下循环条件进行以94℃30秒、52(℃45秒、72℃45秒，共进行30轮。扩增后，产物基本上如Hussey等((2000)，Mol.Hum.Repord.81136-1143)所述进行测序。
在本发明的各种实施形式中，可通过本领域已知的合适方法用合适的标记来标记扩增的基因组DNA。标记可在扩增后进行，或者可在扩增过程中进行或可作为初始扩增的一部分。
例如，扩增的基因组DNA的直接标记可通过将荧光部分连接到要引入的核苷酸上进行另几轮PCR来实现。其它间接标记的方法也是本领域已知的。此外，扩增的DNA可按基本上如Kirchhoff等((1998).Cytometry 31163-173)所述用标记的核苷酸使DNA进行缺口平移来标记。
从具有第一核型的一个或多个细胞的扩增DNA用第一标记来标记，而从具有第二核型的一个或多个细胞的扩增DNA用第二标记来标记，第二标记在检测时与第一标记不同。用于引入DNA并在检测时不同的标记的例子包括SpectrumGreen-dUTP和SpectrumRed-dUTP(均来自Vysis)，或Cy3-dUTP和Cy5-dUTP。
在本发明的各种实施形式中，为使扩增并标记的DNA与连接到固体基质上的DNA杂交，重复序列、非染色体序列或由于扩增产生的超表现序列优选不控制信号，而且优选从库中排除这些序列或需要抑制其杂交的能力。
这种序列可在扩增前或扩增后排除。例如，可提取基因组DNA并排除重复序列、非染色体序列或由于扩增产生的超表现序列。或者，可以首先用合适的引物扩增基因组DNA，然后从核酸的扩增库中排除这些序列。
大量本领域已知的方法可用于除去这些序列，和/或使这种序列丧失杂交能力。
例如，在许多基因组(例如人基因组)中，重复DNA的主要部分包含于一些种类的高度重复序列(例如，Alu)中。为除去这种重复序列，可使用已知封闭方法。这些方法主要基于互补核酸链的杂交率随浓度增加而增加的事实。所以，如果核酸片段的混合物被变性并在允许杂交的条件下孵育，高浓度时出现的序列比其它序列更快变为双链。然后可除去双链核酸，而剩余的可用在杂交中。封闭方法一般见Sealy等的Southern分析“从杂交探针中除去重复序列”(Removal of RepeatSequences form Hybridization Probes)，Nucleic Acid Research 131905(1985))所述的内容。
可用于排除扩增DNA的重复序列的这种序列的例子包括人Cot-1 DNA和含有DNA的Alu-重复序列。重复序列可通过本领域已知的方法直接除去这些序列。例如，单链和双链核酸对羟基磷灰石具有不同的结合特性。这种特性提供了通常用于核酸分级的基础。包含具有特定程度重复的序列的基因组DNA组分可通过在合适的条件下使之重缔合、然后用羟基磷灰石分离来获得。这种技术描述于Britten等.，“通过重缔合分析重复DNA序列”(Analysis of Repeating DNA Sequences byReassociation)，Methods in Enzymology22363-418(1974)。
此外，可进行与固定化核酸的反应。例如，最小剪切的人基因组DNA与重氮纤维素等支持物结合。适当地切成片段的扩增基因组DNA与固定化DNA进行杂交至Cot值约为1到100。
非染色体序列或超表现序列可通过与上述类似的方法除去。当非染色体序列和超表现序列在以下情况中用于除去DNA时，载体和/或污染序列用于排除这些序列的DNA。
超表现序列和重复序列可通过从一个或多个细胞扩增DNA并使用相同引物扩增重复序列源来一起排除，该引物用于从一个或多个细胞扩增DNA。然后，扩增的重复核酸可用于杂交反应。例如，可在Cot-1 DNA上进行DOP-PCR，如果存在超表现序列和重复序列，得到的扩增产物用于排除来自一个或多个细胞的扩增DNA。
在本发明的各种实施形式中，扩增和标记的DAN与连接在固体基质上的扩增DNA的杂交可通过本领域已知的合适方法进行。具有第一核型的来自一个或多个细胞的扩增DNA与连接在固体基质上的DNA杂交，以及具有第二核型的来自一个或多个细胞的扩增DNA与连接在固体基质上的DNA杂交可同时进行或依次进行。
DNA在合适的条件下与连接在固体基质上的DNA杂交。杂交条件包括缓冲液、变性剂(例如甲酰胺)、盐添加剂和加速剂的选择。缓冲液优选pH约为6.8到约7.2，盐含量约1.5×SSC到约2.5×SSC，甲酰胺的含量约为40-50％。合适的条件包括约40到80℃的温度，约1到72小时的时间来充分对照背景检测基因组和表达的信号，优选12-24小时。如果需要可使用杂交加速剂，例如葡聚糖硫酸酯。杂交后优选在比杂交的严谨性更高的条件下洗涤。
杂交过程中，也优选加入过量的未标记人重复序列DNA，例如Cot-1 DNA。杂交混合物中使用的未标记重复序列DNA的量一般为每ng总的标记基因组DNA约0.01到5.0μg。
杂交可在维持扩增和标记的DNA与连接在固体基质上的DNA接触的任何合适的设备中进行。
杂交后，使用任何合适的检测仪或阅读设备以及方法来检测和确定每个标记的荧光强度。
在本发明的各种实施方式中，成像设备和方法可利用数字图像处理算法，该算法用在数据分析、存储和显示来自成像设备的数字图像数据的编程计算机中。任何合适的数字图像处理、数据存储和显示软件可用于分析杂交的结果。
每个靶元件的荧光数据可自动比较来产生所用的检测时不同的标记之间的比值。
与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一种和第二标记的相对量的比较可用于检测具有第一核型的细胞在特定的染色体位置是否和具有第二核型的细胞具有相同的核型，或者检测具有第一核型的细胞在特定的染色体位置是否和具有第二核型的细胞具有不同的核型。
具有第一核型的细胞和具有第二核型的细胞在特定的染色体位置具有相同核型的话，与扩增的DNA杂交的第一种(例如绿色)和第二种(例如红色)标记的比值优选是常染色体为0.80(即，红色/绿色之比)、或性染色体为0.75(即，红色/绿色之比)，到常染色体为1.20(即，红色/绿色之比)、或性染色体为1.25(即，红色/绿色之比)。
此外，具有第一核型的细胞在特定的染色体位置和具有第二核型的细胞相比，缺乏染色体区域拷贝的话，与扩增的DNA杂交的第一种(例如绿色)和第二种(例如红色)标记的比值优选是常染色体大于1.20(即，红色/绿色之比)、或性染色体大于1.25(即，红色/绿色之比)。相反，具有第一核型的细胞在特定的染色体位置上和具有第二核型的细胞相比，具有额外染色体区域拷贝的话，与扩增的DNA杂交的第一种(例如绿色)和第二种(例如红色)标记的比值优选是常染色体小于0.80(即，红色/绿色之比)、或性染色体小于0.75(即，红色/绿色之比)。
本发明也提供一种在具有未知核型的细胞中检测染色体异常的方法，所述的方法包括以下步骤(a)从分离的染色体或分离的染色体的一部分扩增DNA；(b)将扩增的DNA与固体基质相连；(c)从具有未知核型的一个或多个细胞扩增DNA和从具有参考核型的一个或多个细胞扩增DNA；(d)用第一标记来标记具有未知核型的一个或多个细胞的扩增DNA以及用第二标记来标记具有参考核型的一个或多个细胞的扩增DNA，其中第一种和第二标记有可检测的不同；(e)将具有未知核型的一个或多个细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交，并将具有参考核型的一个或多个细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交；和(f)通过比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一标记的相对量和与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第二标记的量来测定具有未知核型的细胞内染色体异常的存在。
染色体异常可是利用基因组比较杂交检测的染色体中的任何变化或改变。可用本发明的这种实施形式检测的染色体异常的例子包括额外的单个染色体或缺失单个染色体、额外的部分染色体或缺失部分染色体、断裂和染色体重排(例如易位、双着丝粒、倒位、插入、扩增和缺失)。
本发明这种实施形式的方法优选用于染色体异常的胚胎或卵母细胞植入前诊断或胎儿的产前诊断。
就分离的染色体而言，该染色体优选通过显微切割或流式细胞术分离。就分离染色体的一部分而言，该分离染色体的一部分优选是染色体的克隆片段。来自分离的染色体的DNA或分离染色体的一部分的扩增DNA优选排除非染色体序列。
扩增来自分离的染色体或分离染色体的一部分的DNA优选随机引物扩增。随机引物扩增更优选包括使用简并寡核苷酸引物。最优选的是简并寡核苷酸引物由核苷酸序列5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′组成，其中N是任何核苷酸。
来自分离的染色体和分离染色体的一部分的扩增DNA优选排除了重复序列和/或由于DAN扩增而产生的超表现序列。
重复序列优选是Cot-1序列。
来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增DNA优选在连接到固体基质之前进行大小选择。来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增DNA更优选大小选择为小于10kb的DNA。来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增DNA更优选大小选择为小于3kb的DNA。
来自具有未知核型的一个或多个细胞的扩增DNA和来自具有参考核型的一个或多个细胞的扩增DNA优选是随机引物DNA扩增。扩增更优选包括使用简并寡核苷酸引物。最优选的是简并寡核苷酸引物由核苷酸序列5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′组成，其中N是任何核苷酸。
来自具有未知核型的一个或多个细胞的扩增DNA和来自具有参考核型的一个或多个细胞的扩增DNA优选均排除了重复序列。
重复序列优选是Cot-1序列。
具有未知核型的细胞可是待筛选其中是否存在染色体异常的任何细胞。可用本发明检测的染色体异常的例子包括三体性21、13和18，和检测缺失染色体，例如发生于特纳综合症(45，XO)中的。
染色体异常可与任何倍性(单倍体、二倍体或多倍体)的细胞中存在的任何染色体有关，包括性染色体、常染色体、线粒体染色体、叶绿体染色体或附加体。染色体异常优选存在于性染色体或常染色体。染色体异常最优选存在于常染色体。
具有未知核型的细胞可是真核细胞或原核细胞。优选细胞是真核细胞。更优选细胞是动物或人的细胞。最优选细胞是人的细胞。
具有未知核型的细胞优选胎儿细胞、衍生自胚胎(包括裂球)的细胞、生殖细胞、癌性细胞或任何其它类型的具有要筛选的染色体异常的体细胞。具有未知核型的细胞更优选胎儿细胞、胚胎细胞或生殖细胞。具有未知核型的细胞最优选胚胎细胞或生殖细胞。
因此，在优选的实施形式中，本发明也提供了一种在胚胎或生殖细胞内检测染色体异常的方法，该方法包括以下步骤(a)从分离的染色体或分离的染色体的一部分扩增DNA；(b)将扩增的DNA与固体基质相连；(c)从胚胎或生殖细胞中分离细胞；(d)从分离自胚胎或生殖细胞的细胞扩增DNA；(e)从具有参考核型的一个或多个细胞扩增DNA；(f)用第一标记来标记分离自胚胎或生殖细胞的细胞的扩增DNA以及用第二标记来标记具有参考核型的一个或多个细胞的扩增DNA，其中第一种和第二标记有可检测的不同；(g)将分离自胚胎或生殖细胞的细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交，并将具有参考核型的一个或多个细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交；和(h)通过比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一标记的相对量和与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第二标记的量来检测胚胎或生殖细胞内染色体异常的存在。
在检测染色体异常中，更精确地测定特定染色体异常的存在无需大量细胞，并且在某些情况中，优选分离单细胞或相对少量的细胞。
因此，在优选的实施形式中，本发明也提供了一种在具有未知核型的单细胞内检测染色体异常的方法，该方法包括以下步骤(a)从分离的染色体或分离染色体的一部分随机扩增DNA；(b)将扩增的DNA与固体基质相连；(c)从具有未知核型的单细胞随机扩增DNA和从具有参考核型的一个或多个细胞扩增DNA；(d)用第一标记来标记具有未知核型的单细胞的扩增DNA以及用第二标记来标记具有参考核型的一个或多个细胞的扩增DNA，其中第一种和第二标记有可检测的不同；(e)将具有未知核型的单细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交，并将具有参考核型的一个或多个细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交；和(f)通过比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一标记的相对量和与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第二标记的量来测定具有未知核型的单细胞内染色体异常的存在。
具有参考核型的细胞可是其核型要与具有未知核型的细胞比较的任何细胞。具有参考核型的细胞优选与具有未知核型的细胞是同一种的，也优选与具有未知核型的细胞是同一型的或类似型的。
具有参考核型的一个或多个细胞优选是与具有未知核型的一个或多个细胞是同一型的。
在本发明的这种实施形式中，有待分析的细胞数目不受具体限制，其范围可从单细胞(例如分离自胚胎)到大量的细胞(例如分离自组织活检或血液)。例如，本发明的方法可应用于对分离自胚胎或卵母细胞的极体的单细胞进行PGD，胎儿细胞的产前诊断或测定通过活检分离自受试者或从血液中分离的癌性细胞或其它体细胞中染色体异常的存在。
在产前诊断的情况中，例如，有待分析的细胞的数目也不受具体限制，优选少于500个细胞，更优选少于400个细胞，最优选少于100个细胞。合适的范围是50-400个细胞。
具有未知核型的一个或多个细胞的扩增DNA优选扩增自1到20个细胞的DNA。在本发明优选的实施形式中，有待分析的细胞是单细胞或少量的细胞，其范围是2到20个细胞。
要从中提取和扩增DNA的具有未知核型的细胞数目优选和要从中抽提和扩增DNA的具有参考核型的细胞数目相同或相似。例如，在对分离自胚胎或卵母细胞的极体的单细胞进行PGD的情况中，优选使用另一来源的单细胞作比较。
在一个实施方案中，也可期望具有未知核型的细胞中的染色体异常可用具有参考核型的细胞中的相同区域来检测。在这种实施形式中，可将一种特定的引物或一组特定的引物加入来自具有未知核型的细胞和具有参考区域的细胞的提取DNA中。
出于，例如随机扩增提取的DNA的目的，可在反应混合物的中存在的其它引物中加入特定的引物或一组引物。此外，特定的引物或一组引物也可用作仅有的引物来扩增提取的DNA。
用于在特定区域检测染色体异常的引物的例子是扩增小染色体的特定区域的引物(例如，染色体21和22)。在这种情况中，优选将这种引物加入随机扩增基因组DNA的一组引物中，例如DOP引物。
在需要扩增特定的染色体区域、特定的基因座、或一个或多个特定的基因的情况中，针对特定区域的引物可单独使用或与其它引物联用，例如随机扩增基因组DNA的DOP引物。例如，可扩增染色体区域来分析染色体异常，包括涉及各种疾病(例如地中海贫血、杜兴肌营养不良、X-连锁疾病和血友病)的区域。应该理解的是，本发明的方法在检测主要的染色体异常(例如缺失和增殖)中有用，并且扩增的特定基因座需要携带这种异常使其可被本发明的方法检测。
所以，从具有未知核型的一个或多个细胞扩增DNA和从具有参考核型的一个或多个细胞扩增DNA也可包括扩增相同的特定染色体区域。
从具有未知核型的一个或多个细胞的扩增DNA用第一标记来标记，而从具有参考核型的一个或多个细胞的扩增DNA用第二标记来标记，第二标记在检测时与第一标记不同。用于引入DNA的检测不同的标记的例子包括SpectrumGreen-dUTP和SpectrumRed-dUTP(均来自Vysis)，或Cy3-dUTP和Cy5-dUTP。
比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一种和第二标记的相对量可用于检测具有未知核型的细胞在特定的染色体位置上是否和具有参考核型的细胞一样具有染色体异常。
就检测缺乏染色体区域的拷贝而言，与扩增DNA杂交的第一种(例如绿色)和第二种(例如红色)标记的比值优选是常染色体大于1.20(即，红色/绿色之比)、或性染色体大于1.25(即，红色/绿色之比)。相反，就检测染色体区域的额外拷贝而言，与扩增DNA杂交的第一种(例如绿色)和第二种(例如红色)标记的比值优选是常染色体小于0.80(即，红色/绿色之比)、或性染色体小于0.75(即，红色/绿色之比)。
在另一优选的实施形式中，本发明提供了一种胚胎的植入前遗传诊断的方法，该方法包括以下步骤(a)从分离的染色体或分离染色体的一部分随机扩增DNA；(b)将扩增的DNA与固体基质相连；(c)从具有未知核型的一个或多个胚胎细胞随机扩增DNA和从具有参考核型的一个或多个细胞扩增DNA；(d)用第一标记来标记具有未知核型的一个或多个胚胎细胞的扩增DNA以及用第二标记来标记具有参考核型的一个或多个细胞的扩增DNA，其中第一种和第二标记有可检测的不同；(e)将具有未知核型的一个或多个细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交，并将具有参考核型的一个或多个细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交；(f)通过比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一标记的相对量和与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第二标记的量来测定具有未知核型的胚胎细胞内染色体异常的存在；和(g)通过一个或多个胚胎细胞中不存在染色体异常来确定胚胎或卵母细胞植入的适合性。
在另一优选的实施形式中，本发明提供了一种卵母细胞的植入前遗传诊断的方法，该方法包括以下步骤(a)从分离的染色体或分离染色体的一部分随机扩增DNA；
(b)将扩增的DNA与固体基质相连；(c)从具有未知核型的卵母细胞的极体随机扩增DNA和从具有参考核型的一个或多个细胞扩增DNA；(d)用第一标记来标记具有未知核型的卵母细胞的极体的扩增DNA以及用第二标记来标记具有参考核型的一个或多个细胞的扩增DNA，其中第一种和第二标记有可检测的不同；(e)将具有未知核型的卵母细胞的极体的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交，并将具有参考核型的一个或多个细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交；(f)通过比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一标记的相对量和与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第二标记的量来测定具有未知核型的卵母细胞的极体内染色体异常的存在；和(g)通过卵母细胞的极体中不存在染色体异常来确定卵母细胞植入的适合性。
在另一优选的实施形式中，本发明提供了一种胎儿的出生前诊断的方法，该方法包括以下步骤(a)从分离的染色体或分离染色体的一部分随机扩增DNA；(b)将扩增的DNA与固体基质相连；(c)从具有未知核型的一个或多个胎儿细胞随机扩增DNA和从具有参考核型的一个或多个细胞扩增DNA(d)用第一标记来标记具有未知核型的一个或多个胎儿细胞的扩增DNA以及用第二标记来标记具有参考核型的一个或多个细胞的扩增DNA，其中第一种和第二标记有可检测的不同；(e)将具有未知核型的一个或多个胎儿细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交，并将具有参考核型的一个或多个细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交；和(f)通过比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一标记的相对量和与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第二标记的量来测定胎儿内染色体异常的存在；本发明也提供一种连接在固体基质上的核酸，其中所述核酸衍生自分离的染色体或分离染色体的一部分并且所述核酸排除了重复序列。
本发明的这种实施形式提供一种与固体基质相连的核酸，该核酸不仅在基因组比较杂交中有用，还可在任何基于杂交的系统中用作检测核酸的靶。
就分离的染色体而言，该染色体优选由显微切割或流式细胞术分离。
就分离的染色体的一部分而言，该染色体的一部分优选由显微切割或流式细胞术分离，或是染色体的克隆片段。
与固体基质相连的核酸可是衍生自分离的染色体或分离染色体的一部分的任何核酸。该核酸可从分离的染色体或分离染色体的一部分直接衍生。例如来自一种或多种分离的染色体的DNA可排除重复序列并直接与固体基质相连，或者来自含有基因组DNA的一个或多个克隆的DNA可排除重复序列并直接与固体基质相连。
此外，与固体基质相连的核酸可是分离的染色体或分离染色体的一部分扩增的产物。
与固体基质相连的核酸优选是分离的染色体或其一部分的DNA的扩增产物。重复序列可再次在扩增前或扩增后从DNA中排除。
在从分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增DNA的情况中，优选导致基本上整个目标序列的扩增。因此，扩增分离染色体或分离染色体的一部分优选随机引物扩增。
在优选的实施形式中，本发明提供一种与固体基质相连的核酸，该核酸衍生自分离的染色体或分离染色体的一部分的随机引物扩增，其中该核酸排除了重复序列。
可使用一种或多种合适的引物来扩增分离的染色体或分离染色体的一部分的DNA。如上所述，使用的一种或多种引物优选可导致分离的染色体或分离染色体的一部分的DNA随机扩增。
使用的一种或多种引物优选包括随机序列的一个或多个核苷酸的寡核苷酸。一种或多种引物更优选包括随机序列的一个或多个毗邻核苷酸的寡核苷酸。该一种或多种引物还要优选包括随机序列的6个或更多毗邻核苷酸的寡核苷酸，例如DOP引物(简并寡核苷酸引物)。该一种或多种引物最优选包括以下核苷酸序列的引物5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′；其中NNNNNN代表简并序列。“N”是任何核苷酸，即N代表DNA序列中四种可能的核苷酸，分别是“A”(腺嘌呤)、“T”(胸腺嘧啶)、“C”(胞嘧啶)、“G”(鸟嘌呤)。这样，简并序列含有各种核苷酸序列的混合物包括在“N”位置的A、T、C和G所有可能的组合。
如果需要，简并序列的核苷酸序列也可偏向于特定的核苷酸组成，例如富含GC或AT。
在使用DOP引物在由显微切割分离得到的分离的染色体上或分离染色体的一部分上进行扩增的情况中，基本上可如Telenius等((1992)，Genomics，18718-725)所述进行扩增。简言之，在低严谨条件下进行循环数量少(例如，5轮)的扩增，而在更严谨条件下进行循环数量较多(例如，35轮)的第二阶段扩增。
此外，随机引物扩增可通过以下步骤进行使用一种或多种固定序列的引物并在低严谨条件下进行循环数量少的扩增，这使得该一个或多个引物在整个目标序列上随机引发合成，然后在更严谨条件下进行循环数量较多的第二阶段扩增。
此外，为说明可能会给实现随机引物扩增带来困难的小染色体的区域，区域特异性引物也可与其它允许随机扩增的引物联用来。例如，对染色体21和22的区域具有特异性的引物可与DOP引物联用。
其它用于扩增分离的染色体或分离染色体的一部分的合适技术包括引物延伸预扩增PCR(PEP-PCR)，这种技术基本上如Zhang等((1992)，Proc Natl.Acad.Sci895847-5851)所述进行；连接介导PCR基本上如Klein等((1999)Proc Natl.Acad.Sci964494-4499)所述进行；或alu-PCR基本上如Nelson等((1989)Proc.Natl.Acad.Sci.866686-6690)所述进行。
在环形载体中的克隆基因组插入体上使用滚环扩增的情况中，滚环扩增可在本领域已知的合适条件下进行，例如Fire，A.和Xu，S-Q在(1995)，Proc.Natl.Acad.Sci924641-4645中所述的。
大量本领域已知的方法可用于排除扩增的DNA重复序列。
如上所述，重复序列可在扩增前或扩增后除去。例如，可分离染色体DNA并除去重复序列。或者，首先可用合适的引物扩增DNA再从核酸的扩增库中除去重复DNA序列。
重复序列的例子包括简单重复的DNA(例如，Alu或Kpn元件)、卫星重复序列、小卫星重复序列、染色体特异性重复序列、微卫星重复序列、重复基因(例如，rRNA基因)、衍生自转座元件的序列(例如，具有DNA或RNA中间体的转座子)、衍生自病毒(例如，逆转录病毒)的多拷贝的元件、与着丝粒或端粒相关的重复序列或与异染色质相关的重复序列。
大量本领域已知的方法可用于除去重复序列。例如，在许多基因组(例如人基因组)中，重复DNA的主要部分包含于一些种类的高度重复序列(例如，Alu)中。为除去这种重复序列，可使用一种封闭方法。这些方法主要基于互补核酸链的杂交率随浓度的增加而增加的事实。所以，如果核酸片段的混合物被变性并在允许杂交的条件下孵育，高浓度出现的序列比其它序列更快变为双链。然后该双链核酸可用本领域已知的方法直接除去这些序列而除去。
例如，单链和双链核酸对羟基磷灰石具有不同的结合特性。这种特性提供了通常用于核酸分级的基础。包含具有特定程度重复序列的基因组DNA组分可通过以下方式获得使基因组DNA变性、在合适的条件下使之重缔合、然后用羟基磷灰石分离。这种技术描述于Britten等.，“通过重缔合分析重复DNA序列”(Analysisof Repeating DNA Sequences by Reassociation)，Methods in Enzymology22363-418(1974)。
可用于排除扩增的DNA重复序列的这种序列的例子包括人Cot-1 DNA和含有DNA的Alu-重复序列。
此外，可进行与固定化核酸的反应。例如，最小剪切的人基因组DNA与重氮纤维素等支持物结合。适当地切成片段的扩增DNA与固定化DNA进行杂交至Cot值约为1到100。然后，未与固定化核酸结合的物质可与固体基质相连。
在优选的实施方案中，要与固体基质相连的、衍生自分离的染色体或其一部分的核酸还要排除非染色体序列。
非染色体序列是染色体或其一部分的核苷酸序列中一般不存在的序列，例如衍生自载体或质粒的序列、或存在于要扩增的最初靶样品中的污染序列，例如细菌的序列(例如，衍生自大肠杆菌的序列)。由于染色体扩增而超表现的序列指相比于其它正常出现在目标序列中的序列，那些在目标序列扩增后出现的、被不成比例地扩增的序列。
非染色体序列可用上述方式排除。在从扩增的核酸中排除非染色体序列的情况中，在与目标序列或扩增DNA的杂交反应中过量使用非染色体序列来排除非染色体序列，或通过将非染色体序列与固体支持物相连并使用这些序列来排除含有这些序列的DNA。
在另一个优选的实施方案中，要与固体基质相连的、衍生自分离的染色体或其一部分的随机扩增的核酸还要排除由于扩增而超表现的序列。
在排除扩增导致的超表现序列的情况中，目标序列可在扩增前通过与上述类似的方法从靶序列中排除或在扩增后排除超表现序列。应该理解的是，需要鉴定被超表现的实际序列，并且这取决于使用的引物和扩增的靶序列的性质。
使用相同引物扩增重复序列来源从而可同时排除超表现序列和重复序列，该引物用于从分离的染色体或分离染色体的一部分扩增DNA。然后，扩增的重复核酸可用于排除超表现和重复序列的扩增DNA。例如，可在Cot-1 DNA上进行DOP-PCR，并且得到的扩增产物用于从分离的染色体或分离染色体的一部分排除扩增的DNA。
在优选的实施形式中，本发明也提供了一种与固体基质相连的核酸，其中该核酸衍生自分离的染色体或分离染色体的一部分的随机引物扩增并且该核酸排除了重复序列、非染色体相连或由于染色体或分离染色体的一部分的扩增而超表现的序列中的一种或多种。
分离的染色体或分离染色体的一部分的核酸在与固体基质连接之前也要经过大小选择。与固体基质连接的扩增核酸的大小优选小于10kb。与固体基质连接的扩增核酸的大小更优选小于3kb。
大小选择可通过本领域已知的合适方法进行。例如，扩增的核酸可在琼脂糖凝胶上进行电泳，并分离大小在150到3000bp的DNA。
在本发明优选的实施形式中，与固体基质连接的核酸是分离染色体或分离染色体的一部分的随机引物扩增产物，其中该核酸进行过大小选择。
在这种情况中，与固体基质相连的随机扩增核酸的大小优选小于10kb。与固体基质相连的随机扩增核酸的大小更优选小于3kb。例如，随机扩增的DNA可在琼脂糖凝胶上进行电泳，并分离大小在150到3000bp的DNA。
核酸可通过本领域已知的合适方法与固体基质相连，包括被动吸附或共价连接。例如，扩增的DNA可通过以下方式经被动吸附与玻璃基质相连将样品点样在PolysineTM显微镜载玻片(Menzel-Glaser，德国)上，然后通过脱水、快干、通过紫外交联固定并使用琥珀酸酐化学封闭来处理载玻片。就共价连接而言，核酸可通过本领域已知合适方法与固体基质相连。
优选多种核酸与固体基质相连来产生沉积核酸的阵列。这种阵列可用本领域已知的任何所需方式生产，包括核酸的机器人沉积。生产阵列的方法的例子基本上描述于美国专利5,486,452；5,830,645；5,807,552；5,800,992和5,445,934。
因此，在优选的实施形式中，本发明也提供一种与固体基质相连的核酸阵列，其中所述阵列中的每个核酸衍生自分离的染色体或分离染色体的一部分并且每个核酸排除了重复序列。
在另一个优选的实施方式中，本发明也提供一种与固体基质相连的核酸阵列，其中所述阵列中的每个核酸是分离的染色体或分离的染色体的一部分的随机引物扩增的产物，并且每个核酸排除了重复序列、非染色体序列或由于染色体或其一部分扩增而超表现的序列中的一种或多种。
也应该明白的是，所述的阵列无需由本发明的核酸构成，而是除了与固体基质相连的一种或多种本发明的核酸外还可包括其它靶核酸。
可在固体基质上沉积任何适量的核酸。沉积核酸的量可从约0.05nl到5.0nl的核酸溶液，该核酸的浓度为0.15-1μg/μl。例如，就1,000DNA沉积/cm的密度而言，沉积的个体量约是0.2nl到2.0nl的1μg/μl溶液。DNA可以允许核酸沉积的任何的溶剂提供。
具有沉积核酸的阵列可以任何阵列方式生产。例如，核酸可位于阵列的一个部分或分散在其它沉积的核酸中。优选两维阵列的一致性。
阵列也优选包括各种控制核酸，例如具体表达基因或基因组序列的拷贝数已知的打点核酸。例如，可使用从细胞系中提取的具有1份或多份拷贝的特定染色体基因组DNA，或也可使用从单细胞扩增的DNA的整个DOP-PCR产物。
在另一个实施形式中，本发明也提供一种用于比较具有第一核型的细胞的至少条种染色体或其片段与对应的具有第二核型的细胞的染色体或其片段的试剂盒，该试剂盒包括含有一种连接到固体基质上的核酸，其中该核酸衍生自分离的染色体或分离染色体的一部分并且核酸排除了重复序列。
在其它的实施形式中，本发明也提供一种用于比较具有第一核型的细胞的至少一条染色体或其片段与对应的具有第二核型的细胞的染色体或其片段的试剂盒，该试剂盒包括一种连接到固体基质上的核酸，其中该核酸是分离的染色体或分离染色体的一部分的随机引物扩增的产物并且核酸排除了重复序列、非染色体序列或由于扩增而超表现的序列中的一种或多种。
本发明的各种试剂盒也适用于检测细胞内的染色体异常。
因此，在另一个实施形式中，本发明也提供一种用于检测具有未知核型的细胞内的染色体异常的试剂盒，该试剂盒包括一种连接到固体基质上的核酸，其中该核酸衍生自分离的染色体或分离染色体的一部分并且核酸排除了重复序列。
在另一个实施形式中，本发明也提供一种用于检测具有未知核型的细胞内的染色体异常的试剂盒，该试剂盒包括一种连接到固体基质上的核酸，其中该核酸是分离的染色体或分离染色体的一部分的随机引物扩增产物并且核酸排除了重复序列、非染色体序列或由于染色体或其一部分扩增而超表现的序列中的一种或多种。
本发明也提供一种衍生自分离的染色体或分离染色体的一部分的随机引物扩增的核酸，其中所述核酸排除了重复序列。
本发明的这种实施形式的核酸可用作杂交的靶核酸，特别是可用作基因组比较杂交的靶核酸。
核酸优选衍生自包括使用简并寡核苷酸引物的随机引物扩增。核酸更最优选衍生自包括使用有以下核苷酸序列组成的简并寡核苷酸引物的随机引物扩增5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′，其中N是任何核苷酸。
在核酸是衍生自分离的染色体扩增的情况中，该分离的染色体优选通过显微切割或流式细胞术分离。
在核酸是衍生自分离的染色体的一部分扩增的情况中，该分离染色体的一部分优选通过显微切割或流式细胞术分离。此外，分离染色体的一部分可是染色体的克隆片段。在这种情况中，从克隆的基因组片段的随机引物扩增的核酸优选排除了非染色体序列。
该核酸也优选排除去了由于扩增而超表现的序列。
重复序列优选是Cot-1序列。
该核酸也是大小选择的。该核酸的大小选择优选小于10kb。该核酸的大小选择更优选小于3kb。
在优选的实施形式中，本发明也提供一种衍生自分离的染色体或分离染色体的一部分的随机引物扩增的核酸，其中所述的核酸排除了重复序列并且核酸是大小选择的。
优选实施方案的描述现在，参考体现本发明的上述的一般原理所做的实验。然而，要理解的是以下的描述并不限制上述说明的普遍性。
实施例1人染色体特异性的DNA文库完整的一套排除充分序列的、PCR可扩增的人染色体特异的染色探针由A.Bolzer和M.R.Speicher博士(人类学和人类遗传学研究所(Institut frAnthropologie and Humangenetik)，LMU慕尼黑，慕尼黑，德国)惠赠。
由于这些探针能均匀地对整个靶染色体(臂)染色，它们在本项目中选为人染色体的DNA文库。DNA文库通过对15种染色体(No.1、3、6、7、9、12、13、14、15、17、19、20、21、22和X)进行显微切割或对9种染色体(No.2、4、5、8、10、11、16、18和Y)进行流式分选产生。为避免在5种近端着丝粒染色体(13-15、21和22)的p臂之间的交叉杂交，仅将这些染色体的q臂显微切割入其对应的DNA文库(Guan等.，(1994)，Genomics22101-107)。
使用包括人Cot-1 DNA、染色体着丝粒特异性探针和aphoid区域特异性探针的扣除物(subtracter)进行亲和层析成功地从这些探针中进一步除去了重复序列。简言之，用生物素标记重复序列并允许与含有重复序列的文库杂交。杂交后，使用链霉抗生物素蛋白-磁性珠亲和层析来除去与生物素标记的重复序列结合的重复序列。如Craig等((1997)，Hum.Genet100472-474)和Bolzer等((1999)，Cytogenet.CellGenet.84233-240)所述，这些排除重复序列的DNA文库无需加入人Cot-1 DNA来抑制重复序列，就可在其对应的靶染色体(q臂)上获得高特异性的FISH信号。
实施例2制备人染色体特异性DNA文库通过高严谨循环条件的一次30-35轮的简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)成功地再扩增了如实施例1所述的人DNA文库，该循环条件基本上如Telenius等((1992)Genomics 13718-725)所述。
简言之，在体积为50μl的Minicycler(MJ Research，USA)中进行扩增，其中含有约50～100ng的源探针，Taq DNA聚合酶缓冲液(50mM KCl、10mM Tris-HCl[pH8.3]，Perkin Elmer，美国)，2.0μM引物6MW(5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′)，2.5mM MgCl2，0.25mM的各种dNTP和5U Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer，美国)。在95℃4分钟的初始变性步骤之后，以94℃1分钟，62℃1分钟和72℃3分钟，每轮加上10秒的延伸时间为循环条件，共进行30-35轮。最后在循环扩增结束时加上72℃10分钟的延伸步骤。
5μl的PCR产物在0.5×TBE(Tris，硼酸盐，EDTA)中用溴化乙锭预染色的1％琼脂糖凝胶上进行电泳并拍照。结果示于图1。
可以看到，使用高严谨循环条件的传统DOP-PCR通过一次30-35轮的DOP-PCR扩增成功地扩增了全套排除重复序列的人染色体特异性的DNA文库。在1％琼脂糖上展开30分钟后，所有的再扩增DNA文库的PCR产物形成主要小于1kb的成片条带。然而，成片条带的区别是明显的。11种不同的染色体(No.1、2、4、5、8、9、10、11、16、21和Y)的产物见到延伸至大于3kb的较宽的成片条带，仅有3种是获得自显微切割的探针(No.1、9和21)。
综合地优化DOP-PCR的循环条件未能去除PCR产物在大小上的差异，这些条件包括退火和延伸步骤的温度和持续时间，扩增循环的数量，模板的初始DNA量和MgCl2的盐浓度。
然后使用Ultrapure PCR纯化试剂盒(#12500-250，Mo Bio Laboratories，Inc.，CA，美国)纯化PCR产物。纯化的PCR产物可立即使用也可于-20℃储存1年而用FISH信号测定其特异性无任何可见的丧失。
实施例3使用再扩增的DNA文库进行荧光原位杂交使用来自正常男性的外周淋巴细胞的中期染色体进行FISH实验来确认再扩增的人染色体DNA文库的特异性。
荧光原位杂交按以下步骤进行SpectrumGreen-dUTP或SpectrumRed-dUTP(Vysis，美国)用于标记扩增的DNA文库。使用以上用于扩增DNA文库的源探针(实施例2)的相似DOP-PCR循环条件在体积为50μl的Minicycler(MJ Research，美国)中进行标记反应。
该实施例中唯一例外是使用低浓度的dNTPdGTP、dCTP和dATP分别是0.16mM，0.12mM的dTTP，以及加入了0.04mM的SpectrumGreen-dUTP或SpectrumRed-dUTP。使用Ultrapure PCR纯化试剂盒(#12500-250，Mo BioLaboratories，Inc.，CA，美国)纯化PCR产物。对于FISH实验，1μg纯化的标记产物与20μg人Cot-1 DNA(GIBICO，BRL)和50μg鲑精DNA(GIBICO，BRL)混合。用乙醇沉淀探针混合物并重悬于10μl杂交溶液中，该溶液由50％去离子甲酰胺，3×SSC，0.1％SDS，10％葡聚糖硫酸酯和5×Denhardt溶液组成。
在80℃变性10分钟并在37℃预退火30分钟后，探针与变性的中期扩散染色体于37℃杂交过夜。杂交后，于60℃用2×SSC洗涤载玻片两次，10分钟；然后于60℃用0.1×SSC洗涤载玻片一次，5分钟。此后，于室温用0.1×SSC洗涤载玻片一次，5分钟，然后在水中简单冲洗数秒。于黑暗中空气干燥后，载玻片用含有防褪色介质的40μl DAPI溶液复染并用指甲膏密封的盖玻片覆盖。通过AHBT3显微镜(Olympus，东京，日本)使用(1)以蓝光激发绿色信号(2)以Triple激发红色信号，得到FISH信号并拍照。
如图2所示，除了染色体21的DNA文库发出微弱的信号外，所有其它标记均对其完整的靶染色体或q臂进行均匀的染色。
实施例4生产DNA阵列(i)人染色体DNA的PCR扩增文库的DNA阵列(第一代阵列)
使用南澳大利亚，阿德莱德大学(University of Adelaide，South Australia)的微阵列设备进行DNA阵列。
简言之，人染色体的所有再扩增DNA文库重悬在3×SSC的点样缓冲液中，其中DNA的终浓度约100ng/μl，然后将8μl的每种悬浮液加入384孔板的孔中。然后，使用微阵列仪(microarrayer)从此板的孔中取样并在PolysinTM显微镜玻璃载玻片(Menzel-Glaser，德国)上每份DNA样品点8份复制品。点好样的阵列载玻片的后处理包括脱水、快干、紫外交联固定和使用琥珀酸酐进行化学封闭。最后，以500rpm离心5分钟干燥后，阵列载玻片可立即使用或于黑暗中短时储存于载玻片盒中。
制造了30块阵列载玻片。如图3所示，两个复制阵列点样在每块载玻片上。每个阵列具有四个区。从左到右，每个阵列内四个区命名为第一区、第二区、第三区和第四区，每个区分别具有7列、7列、6列和6列。每列由单一人染色体的一个DNA文库的4个复制品组成。从左到右，对应于人染色体的DNA文库的列的次序分别是第一区、第二区、第三区和第四区的No.1-5-9-3-17-21-阴性、No.2-6-10-14-18-22-阳性、No.3-7-11-15-19-X-空白和No.4-8-12-16-20-Y-空白。
(ii)大小选择后人染色体DNA的PCR扩增文库的DNA阵列(第二代阵列)将实施例2所述的再扩增DNA文库在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳来生产具有大小选择产物的DNA阵列。染色后，如图4所示，从凝胶上切下大小范围是150-3000bp的DNA并分离。
然后将得到的大小选择的DNA连同前述的大小选择之前的原始DNA文库点样到阵列上，其中与前述的区别在于DNA是重悬于pH8.0的150mM磷酸钠中，其浓度约为170ng/μl。使用TeleChem的Stealth Micro Spotting Pins(目录SMP3)在每个点上点约0.6nl的量。使用的载玻片是从盒中直接取用的TeleChem(Sunnyvale，CA)的SuperAmine载玻片。进行微阵的阵列设备是位于新南威尔士大学的基因功能分析Clive & Vera Ramaciotti中心的微阵设备，该设备使用ChipWriter Pro(BioRad)微阵仪。
实施例5单细胞的分离与制备分离自正常男性或正常女性外周血的单淋巴细胞用作参考细胞，13和18三体性的妊娠羊水细胞培养物的单羊水细胞用作测试细胞。使用细胞遗传分析来确认46、XX和46、XY参考样品的正常核型。使用倒置显微镜和细拉长的玻璃移液管基本上如Hussey等((1999)Mol.Hum.Reprod.51089-1094)所述来选择单细胞并转移至0.5ml PCR管，这些单细胞可立即使用或冷冻一段时间。
实施例6随机扩增的第一轮DOP-PCR于65℃用5μl裂解缓冲液(200mM KOH、50mM二硫苏糖醇)处理10分钟，然后用5μl中和缓冲液(300mM KClI、900mM Tris-HCl、pH8.3、200mM HCl)中和获得单细胞的裂解。向10μl的单细胞裂解和中和溶液加入5μl的无K+PCR缓冲液(100mM Tris-HCl、pH8.3、1mg/ml明胶)，5μl的25mM MgCl2，4μl的2.5mM的各种dNTP，5μl的20μM DOP-PCR 6MW，5U的Taq聚合酶(Perkin Elmer，Norwalk，CT，美国)，以及超纯水(Biotech International，Perth，WA，澳大利亚)至体积为50μl。这些PCR管放入MJ Research Minicycler(波士顿，马萨诸塞州，美国)进行95℃5分钟的初始变性步骤。然后以94℃1分钟，30℃1.5分钟和72℃3分钟(上升幅度为每4秒1℃将温度从30℃升至72℃)为循环条件进行8轮的低严谨扩增；然后以94℃1分钟，62℃1分钟和72℃3分钟以及每轮循环加14秒的延伸步骤为条件进行26轮的高严谨扩增。最后在循环扩增结束时加上72℃、10分钟的延伸步骤。PCR产物准备好用于标记的强化第二轮DOP-PCR。
实施例7用于Cy3/Cy5标记的第二轮DOP-PCR5μl的第一轮DOP-PCR产物(1/10体积)转移到0.5ml新鲜的PCR管并进行用于Cy3-dUTP/Cy5-dUTP(PA 53022/PA 55022，Amersham Phamacia Biotech，美国)标记的第二轮DOP-PCR扩增。使用MJ Research Mimicycler(波士顿，WA，美国)进行体积为50μl的25轮扩增，并且循环条件与FISH实验(上述)中用于标记DNA文库的相似，除了用Cy3-dUTP或Cy5-dUTP取代SpectrumRed或SpectrumGreen。Cy3-dUTP或Cy5-dUTP均以0.04mM的浓度使用。然后使用UltracleanTMPCR清除试剂盒(#12500-250，Mo Bio Laboratories，Inc.，CA，美国)纯化PCR产物并用50μl的10mM Tris-HCl或H2O洗脱。5μl的PCR产物在0.5×TBE(Tris，硼酸盐，EDTA)中溴化乙锭预染色的1％琼脂糖凝胶上进行电泳并拍照。剩余的可立即用于微阵/CGH实验或于-20℃短时储存几周。
实施例8微阵/CGH分析等量(5～10μl)的Cy3标记的测试单细胞DOP-PCR产物和Cy5标记的参考单细胞DOP-PCR产物与70μg的人Cot-1 DNA(GIBICO，BRL)和20μg的鲑精DNA(GIBICO，BRL)混合。用乙醇沉淀所得到的DNA混合物并重悬于10μl杂交溶液中，该溶液含有50％去离子甲酰胺，2×SSC，0.1％SDS，10％葡聚糖硫酸酯和5×Denhardt溶液。杂交混合物加热至80℃10分钟使DNA探针变性，然后在37℃进行重复序列预退火180分钟。于37℃进行杂交17～20小时。杂交后洗涤包括用50％的甲酰胺/2×SSC、pH7.0于45℃洗涤3次，10分钟；2X SSC于45℃洗涤片两次，5分钟；1×SSC于室温洗涤一次，10分钟。最终，载玻片在水中简单洗涤数秒并于黑暗中空气干燥，然后尽可能立即扫描。
实施例9载玻片扫描和数据分析使用称为GenePix 4000B(Axon Instruments，Inc.，CA，美国)的双重激光扫描仪扫描微阵载玻片，该扫描仪可同时扫描Cy3(532nm处)和Cy5(635nm处)并实时产生比值图像。这些图像进一步用GenePix Pro 3.0.6.66(Axon Instruments，Inc.，美国)的软件分析。该软件计算所有DNA点在两种波长(Cy3/Cy5)处的信号强度和局部背景强度并产生大量的原始数据，其中5种不同的比值是最重要的中值比、平均值比、比值的中值、比值的平均值和回归比。该软件也通过使用全球标准化方法提供了5种比值各自的标准化因子，该方法基于所有分析特性的平均值是1.0的假定。标准化的比值可通过不同的阵列实验结合或比较。本项研究中选择中值比，而相同探针的所有合适点的标准化比值(Cy5/Cy3)的平均值最后用于最终的分析。1.0的标准化比值被认为测试与参考之间拷贝数无差异。比值变化大说明拷贝数的显著差异。本项研究使用小于0.8(常染色体)或0.75(性染色体)作为三体性的截断阈值以及大于1.2(常染色体)或1.25(性染色体)作为单体性的截断阈值来确定单拷贝变化的非整倍性。这些截断阈值的标准经常用在诊断基因组序列的单拷贝变化的基因组比较杂交中。
中值比的定义是每种波长的每个性能(DNA点)的中值强度减去中值背景的比值。以下是通过该软件确定中值比的标准化因子所使用的步骤1)确定每种性能的中值比的对数值；2)计算所有对数值的平均值(“Avglog”)；3)计算真实平均值(“TrueAvg”)。TrueAvg＝10^Avglog4)确定标准化因子(NF)。NF＝1/TrueAvg。
5)通过NF×中值比来计算标准化的中值比。
实施例10单细胞DNA微阵/CGH的结果47、XX、+13和47、XY、+18的单羊水细胞用作测试样品并用Cy3-dUTP(绿色)标记，而正常男性46、XY的单淋巴细胞用作参考样品并用Cy5-dUTP(红色)标记。杂交后洗涤之后，干燥阵列载玻片并立即用能产生单波长和双波长图像的GenePix 4000B扫描。这些图像可以24-字节的JPEG图像保存，也可默认为16-字节的无符号TIFF图像。整个CGH过程约需30小时。
图5是得自47、XX、+13对46、XY的单细胞微阵/CGH实验。基础分析表明在靶DNA点上有几个出现更绿或更红的染色体区域。然而，最终对靶染色体拷贝数的解释得自其对应的DNA点的比值(见图)。
类似地，图6是得自47、XX、+18对46、XY的单细胞微阵/CGH实验。该图给出最终对靶染色体拷贝数的解释获得自其对应的DNA点的比值。
16-字节的无符号TIFF图像是可由许多图形和图像程序阅读的标准未未压缩图形文件形式。这些图像用于提取数据。本项研究中使用GenePix Pro 3.0.6.66分析TIFF图像，该软件对每个微阵/CGH实验产生了综合的数据报表(Excel格式)。本项研究中选择的中值比来解释最终的结果，并且最终使用相同DNA探针的所有合适的DNA点的平均中值比。图5和6的图像中所有人染色体的平均中值比示于表1。
表1

表1中结果的图形说明见图6。
表1中的数据表明在单细胞微阵/CGH实验中，47、XX、+13对46、XY的点13、18、X和Y处的平均中值比分别是0.6470、0.9321、0.7328和1.568。
在47、XY、+18对46、XX的情况中，染色体13、18、X和Y的比值分别变为1.1038、0.6691、1.4254和0.6601。如果将0.75-1.25的截断阈值应用于确定染色体、三性体13和+18的单拷贝变化，加上染色体X和Y的拷贝数差异可正确地建立用于这两个单细胞微阵/CGH实验的所有测试和参考样品。
所有其它20种不同的染色体的预期的平均中值比应在截断阈值0.75-1.25内，因为这些染色体的拷贝数在测试样品与参考样品之间没有任何差异。表1中的数据表明其它20种染色体的大部分很好在该阈值范围内。47、XX、+13对46、XY的染色体21的平均中值比是1.2860，而47、XY、+18对46、XX的染色体5、10和18的平均中值比是1.47660、1.2996和0.72339。
实施例11使用具有大小选择的PCR扩增DNA的DNA阵列(第二代阵列)进行的CGH的重现性除了使用具有大小选择的DNA的第二代阵列外，实验方案与上述相同。该阵列也含有大小选择之前的原始DNA文库。等份的正常男性和正常女性细胞DOP-PCR反应产物用Cy3或Cy5标记并根据下表2中所述的组合进行杂交。
表2

(1)本项研究所用的所有单淋巴细胞包括10DH细胞和11NH细胞。
(2)使用超过一次的细胞包括DH1、NH9、DH13。
表2(续)

(1)这里使用的总单淋巴细胞包括10DH细胞和11NH细胞。
(2)使用超过一次的细胞包括DH1、NH9、DH13。
表2显示了使用我们的阵列的单细胞基因组比较杂交实验是高度重现的，所有的染色体(除了Y染色体)在14个实验中至少13个产生了完美的结果。大小选择的Y染色体点比非大小在先额的点更精确。对应于上述实验(NH7 1h)中的一个数据示于图7。表3显示了用计算机计算的比值
表3

实施例12使用具有大小选择的PCR扩增DNA文库的DNA阵列(第二代阵列)检测18三体性和性别的单细胞CGH使用上述的第二代阵列，将47、XY、+18的单羊水细胞用作对单淋巴细胞46、XX的测试样品。图8显示了与阵列杂交的结果。原始数据和标准化的比值示于图4。可以看到，成功地检测到存在18三体性。
表4

实施例13使用约100个细胞的样品阵列CGH(i)制备样品含有成纤维细胞系(47、XY、+18)的两个试管从液氮中解冻并立即于37℃孵育10分钟，用1×PBS洗涤两次，然后悬浮于500μl的1×PBS。
如图10所示使用倒置显微镜以20×10的放大率(CK2，Olympus，日本)在超冻(superfrost)显微镜的玻璃载玻片(Menzel-Glaser，德国)上进行细胞分选。简言之，载玻片以无菌的70％乙醇(Delta West Pty Ltd，澳大利亚)彻底洗涤并装在显微镜上。在载玻片的左侧吸取100μl RPMI培养基(Sigma)并加入1μl成纤维细胞悬浮液。在RPMI池的右侧依次形成另三个1×PCR缓冲液(50mMKCl，10mM Tris-HCl，pH8.3)较小池(约50μl)并分别命名为(从左到右)1×PCR缓冲液池#1、池#2和池#3(图10)。使用9”、挤压的、塞有棉花的玻璃巴斯德移液管从RPMI池中吸取成纤维细胞，然后将约500个细胞转移至1×PCR缓冲液池#1。使用新鲜的移液管将少于200个细胞转移至1×PCR缓冲液池#2。用新鲜的移液管从池#2中吸取约100个细胞并转移至1×PCR缓冲液池#3。用新鲜的移液管吸出这些细胞并在新鲜的位置慢慢地抽入和抽出吸管的末端。洗涤后使用最少量的PCR缓冲液将这些细胞吸入移液管的末端，然后转移进0.5ml无菌PCR管。立即使用分离的细胞。
(ii)使用约100个细胞的阵列CGH约100个细胞的样品如实施例6和7所述用Cy3-dUTP标记。
进行以下的两个独立的阵列CGH实验(实验A和实验B)实验A在该实验中，使用100个成纤维细胞(48、XY、+18、Cy3)对正常男性基因组DNA(46、XY、Cy5)进行阵列CGH。该实验的结果示于图10(上幅)。如预期的一样，得到染色体18的预计比值＞1.25以及所有其它的21种常染色体的预计比值在0.75-1.25范围内。得到的X染色体的比值也在0.75-1.25范围内，这表明正确确定了测试成纤维细胞系的男性性别。
实验B在该实验中，使用100个成纤维细胞(48、XY、+18、Cy3)对5到10个单一正常男性细胞的合并混合物(46、XY、Cy5)进行阵列CGH。该实验的结果示于图10(下幅)。得到染色体18的预计比值＞1.25以及所有其它的21种常染色体的预计比值在0.75-1.25范围内。X染色体的比值也在0.75-1.25范围内，这表明正确诊断了测试成纤维细胞系的男性性别。
实施例14使用DOP-PCR扩增的Cot-1 DNA的阵列CGH(i)扩增Cot-1 DNA使用DOP-PCR在Minicycler(MJ Research，美国)中扩增体积为50μl的100ngCot-1 DNA(目录号，15279-011，Invitrogen)，其中含有5U Taq聚合酶(AppliedBiosystems)，和终浓度50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.3、0.1mg/ml明胶、2.5mMMgCl2、200μM的各种dNTP、2μM DOP-PCR 6MW引物(5′CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′)(Telenius等.，1992)。简单离心样品，于95℃变性5分钟，以94℃1分钟，30℃1.5分钟和72℃3分钟(在退火和延伸步骤之间的升温幅度为每4秒1℃)为循环条件进行8轮扩增；然后以94℃1分钟，62℃1分钟和72℃3分钟开始但每轮循环加14秒为条件进行29轮扩增，以及72℃10分钟的最终延伸步骤。5μl扩增产物在1％琼脂糖凝胶上展开(图11上幅)，剩余的进行纯化。
如泳道1所示，扩增的Cot-1 DNA是具有主要从250kp到2kb范围的成片条带。DNA标记是SPP-1/EcoR1(M1)和pUC 19/Hpall(M2)。
(ii)使用DOP-PCR扩增的Cot-1 DNA的阵列CGH的结果用Cy3-dUTP标记的女性单细胞对用Cy5-dUTP标记的5个男性单细胞的合并混合物的一个阵列CGH实验完全按照上述进行，除了使用140μl DOP-PCR扩增的Cot-1 DNA取代70μg Cot-1 DNA(目录号，15279-011，Invitrogen)。从该实验得到的所有24种染色体的比值示于图11的下幅，该图表明所有22种常染色体的比值均在0.75-1.25范围内，并且得到了X染色体的＞1.25的预期比值。然而，Y染色体的结果是不能允许的。
如预期的一样，所有22种常染色体的比值在0.75-1.25范围内，X染色体得到＞1.25的比值，该结果正确地表明测试单细胞的女性性别。
实施例15裂球阵列CGH分析1.材料与方法(i)制备单裂球使用的3个冷冻的人IVF胚胎得自IVF澳大利亚，Westmead，新南威尔士州，澳大利亚胚胎解冻、简单孵育、解聚并将每种细胞吸入聚合酶链式反应(PCR)试管。这些PCR试管置于干冰并通过邮政快递寄到我们实验室。从三个冷冻胚胎中得到总数为12个单裂球。
(ii)裂解单裂球使用5μl裂解缓冲液(200mM KOH，50mM二硫苏糖醇)于65℃单裂球裂解10分钟，然后使用5μl的中和溶液(300mM KCl，900mM Tris-HCl，200mM HCl，pH8.3)中和。
(iii)随机扩增单细胞的第一轮DOP-PCR第一轮DOP-PCR在Minicycler(MJ Research，美国)中进行，反应液体积为50μl，其中含有单细胞裂解和中和液(10μl)，5U Taq聚合酶(Applied Biosystems)和终浓度50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.3、0.1mg/ml明胶、2.5mM MgCl2、200μM的各种dNTP、2μM DOP-PCR 6MW 引物(5′CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′)(Telenius等.，1992)。简单离心样品，于95℃变性5分钟，以94℃1分钟，30℃1.5分钟和72℃3分钟(在退火和延伸步骤之间的升温幅度为每4秒1℃)为循环条件进行8轮扩增；然后以94℃1分钟，62℃1分钟和72℃3分钟开始以及每轮循环加14秒为条件进行26轮扩增，以及72℃10分钟的最终延伸步骤。
(iv)用于Cy3/Cy5标记的第二轮DOP-PCR第一轮DOP-PCR产物(5μl)在体积为50μl的反应液中标记，其中含有5U Taq聚合酶(Applied Biosystems)和终浓度50mM KCl，10mM Tris-HCl pH8.3，2.5mMMgCl2，160μM的各种dGTP、dCTP和dATP，120μM dTTP，40μM的Cy3-dUTP或Cy5-dUTP(Amersham Phamacia Biotech，美国)和2μM DOP-PCR 6MW引物。简单离心样品，于95℃变性4分钟，以94℃1分钟，62℃1分钟和72℃3分钟开始以及每轮循环加10秒为条件进行25轮扩增。最后加上72℃10分钟的延伸步骤。通常5μl各种DOP-PCR产物以0.5×TBE在1％琼脂糖凝胶上展开来检测扩增的质量，剩余的产物进行纯化。
(v)纯化Cy3-和Cy5-标记的产物Cy3-或Cy5-标记的DOP-PCR产物用UltraCleanTMPCR清除试剂盒(Mo BioLaboratories，美国)按照厂家的使用说明进行纯化。简言之，5体积的SpinBind(盐酸胍/异丙醇)加入PCR产物(45μl)，然后通过移液管抽吸彻底混合。PCR/SpinBind混合物转移至离心过滤元件并在微型离心机中以14,000rpm离心10-30秒。弃去收集管中的液流并向同一个离心过滤元件加入300μl SpinClean缓冲液(乙醇溶液)，然后以14,000rpm离心30-60秒。用新鲜的收集管取代含有液流的收集管并向同一个离心过滤元件的过滤膜上直接加入50μl的洗脱缓冲液(10mM Tris，pH8.0，无DNA酶)，然后以14,000rpm离心30-60秒。弃去离心过滤篮，收集管含有纯化的Cy3-后Cy5-标记探针。这些纯化的探针不含任何PCR反应成分，例如DOP-PCR 6MW引物、Taq聚合酶和Cy3-dUTP与Cy5-dUTP，并且可立即用于阵列CGH或在阵列CGH分析前于-20℃保存至少两个月。5μl各种纯化产物总是在1％琼脂糖上展开来检测标记和纯化的效率。
(vi)阵列CGH等体积(5～10μl)的各种Cy3-标记(测试)与Cy5-标记(参考)的DOP-PCR产物与70μg的人Cot-1 DNA(GIBCO，BRL)、20μg的剪切鲑精DNA(GIBCO，BRL)混合并用两体积的100％乙醇和1/10体积的3M NaAC(pH5.2)沉淀。得到的混合物置于-20℃两小时，然后于4℃以14,000rpm离心25分钟。得到的DNA沉淀用70％乙醇洗涤一次，然后于4℃以14,000rpm离心10分钟，在黑暗中空气干燥或于60℃烘箱中干燥，最后溶解于10μl杂交溶液(50％去离子甲酰胺、3×SSC、0.1％葡聚糖硫酸酯和5×Denhardt溶液)。80℃、10分钟变性和37℃80分钟预退火后，探针混合物涂布于阵列区域并用盖玻片覆盖。于37℃在潮湿孵育箱内杂交15～20小时。杂交后，载玻片浸在50％甲酰胺/2×SSC中直至盖玻片自动脱落(通常需要10分钟)。杂交后洗涤包括于45℃在50％甲酰胺/2×SSC中洗涤两次，每次10分钟；于45℃在2×SSC中洗涤两次，5分钟；于室温在1×SSC中洗涤一次，10分钟，和在MilliQ H2O中简单清洗三次。上述所有用于洗涤的溶液在洗涤之前均用0.22μm过滤器(MILLIPORE，美国)过滤。洗涤后，载玻片在黑暗中干燥，然后立即扫描，或者载玻片可在黑暗中于室温至少保存73天。
(vii)阵列扫描和数据分析GenePix4000B是一台完整的科学仪器，具有用于扫描载玻片的GenePix4000B扫描仪和用于数据分析的软件GenePix Pro(Axon Instruments，Union City，CA，美国)。GenePix 4000B激光仪于532nm(绿色)和635nm(红色)处激发。发射滤光器是575DF35(绿色；～557-592nm)和670DF40(红色；～650-690nm)。这些激光仪和过滤器是为Cy3和Cy5优选的。GenePix 4000B扫描仪同时扫描Cy3和Cy5，以10μm的分辨率全部扫描一块标准的显微镜载玻片(25mm×75mm)需要约5分钟(以5μm的分辨率进行全扫描需要不到12分钟)，而用户自定义的亚扫描需时更少。
阵列扫描简言之，预览扫描(40μm分辨率)用于在载玻片上定位阵列并设置包括光电倍增管(PMT)电压、扫描区域和激光功率在内的扫描参数。然后使用高分辨率(10μm)数据扫描以获得用于CGH分析的图像。光电倍增管(PMT)获得用于本项研究的范围在400-900的两个信道的电压，而两个信道的激光功率总数为100％水平。由GenePix4000B获得的基本数据是单波长图像，并且这些图像默认以16-字节灰度的TIFF(标签图像文件格式)保存于单个多重图像中，其中包括保存于TIFF和JPEG(联合图像专家组)格式的Cy5/Cy3比值图像。TIFF文件用于分析，而JPEG文件仅用于说明。
数据分析GenePix Pro 4.0.1.12软件用于分析TIFF图像。简言之，GenePix Pro使用GenePix阵列列表文件(GAL file)来定位所有性能的大小和位置。分析后，结果以GPR文件(GenePix结果格式)保存，该文件包括由图像获得和分析的一般信息以及从每种性能中析取出的包括40多种不同参数的数据组成的标题(header)。在该研究中，选择减去中等背景的像素强度的像素对像素(pixel-by-pixel)比值(Cy3/Cy5)的中值进行解释。
排除用于数据分析的点GPR文件的7种不同的参数在该项研究中用于数据过滤，包括1.Dia.性能指示器的直径(μm)2.＞％B635+2SD在1#波长(635nm，Cy5)处的性能像素百分率，具有的强度在背景像素强度之上多于两个标准偏差3.＞％B532+2SD在2#波长(523nm，Cy3)处的性能像素百分率，具有的强度背景像素强度之上多于两个标准偏差4.SNR6351#波长(635nm，Cy5)信-噪比，确定为(前景1的平均值-背景1的平均值)/(背景1的标准偏差)5.SNR5322#波长(532nm，Cy3)信-噪比，确定为(前景1的平均值-背景1的平均值)/(背景1的标准偏差)6.F635％Sat.波长#1(Cy5)处饱和的性能像素的百分率7.F532％Sat.波长#2(Cy3)处饱和的性能像素的百分率未能通过以下参数之一的点从分析中排除(1)Dia.＞50pm，(2)＞％B635+2SD＞70，(3)＞％B532+2SD＞70，(4)SNR635＞3.0，(5)SNR532＞3.0，(6)F635％Sat.＝O和(7)F532％Sat.＝O。这些参数的定义如Axon仪器所给予的。
比值标准化从8个合格的复制品计算每种染色体比值的平均值。然后假定每个阵列CGH杂交中所有常染色体的平均比值是1.0，使用所有常染色体的22个比值的平均值进行标准化。该标准化方法按生产商(Axon仪器)所述进行并可简单地描述为以下步骤均分每个染色体的所有包括点的比值的中值得到原始平均值确定每个比值的中值的原始平均值的对数值计算所有对数值的平均值(“Avglog”)计算真实平均值(“TrueAvg”)，TrueAvg＝＝10^Avglog确定标准化因子(NF)(NF＝1/TrueAvg)应用标准化因子将所有比值的中值的原始平均值重定标(比值的中值的标准化平均值＝NF×比值的中值的原始平均值)得到标准化的比值。
2.裂球阵列CGH的结果
(i)通过DOP-PCR的单裂球的随机扩增和标记如图12所示，DOP-PCR预扩增和用Cy3标记后，获得自供研究的3个冷冻VIF产生的卵裂阶段胚胎的所有12个裂球产生了令人满意的Cy3标记产物，这些产物在用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上进行大小分级分离后得到300bp到2500bp的条带，其中含有约为450bp和600bp的两个特异条带。
(ii)使用阵列CGH的单裂球染色体分析使用5-10个用Cy5标记的正常男性单细胞DOP-PCR产物的合并混合物作为参考物质进行阵列CGH分析。由于阵列的可用性有限，仅可分析12个可用裂球中的10个。使用阵列CGH分析的10个裂球中，2个由于高荧光背景未能产生可分析的结果，这可能是杂交步骤采用的相对湿度偶然太低于标准95％。
8个产生可分析阵列CGH结果的裂球中，发现3个正常具有明显的女性核型(46，XX)(胚胎A的裂球1和4，胚胎C的裂球2)。4个细胞是非整倍性的，其中两个具有21三体性和明显的女性核型(胚胎A的裂球2，胚胎B的裂球1)。其它两个细胞对于染色体2l(胚胎B的裂球2)和18(胚胎C的裂球3)是非整倍性的，而对于染色体1和12分别可能是单体性的。最后，一个裂球(胚胎A的裂球3)得到明显的混乱核型并对6种不同的CSL(包括CSLl、7、8、14、17和20)具有＜0.75的比值，而对其它7种CSL(包括CSL2、5、10、12、13、18和21)具有＞1.25的比值。此结果表明该裂球对6种染色体(染色体1、7、8、14、17和20)具有单体性，而对其它7种(染色体2、5、10、12、13、18和21)具有三体性。
观察到分析的所有3个胚胎均是镶嵌型的。胚胎A的四个分析细胞中两个是正常的，一个是21三体性的，另一个具有广泛的非整倍性(混乱的)。胚胎B的二个分析细胞均是21三体性，其中的一个可能具有1单体性。胚胎C的两个分析细胞中，一个是正常的，另一个是18三体性并可能具有12单体性。性别测定表明所有三个胚胎均具有明显的女性核型并且这与每个胚胎的除混乱裂球(胚胎A的裂球3)以外的所有细胞一致，该裂球未能得到用于性别测定的CSLx的观察比值0.9的重量。
实施例16制备用于阵列印刷的BAC DNA探针BAC DNA探针来源(来自妇女儿童医院，阿德莱德)RP-11-265k23(5q35)RP-11-849(17p11.2)RP-11-354m20(10q25.2-26.11) RP-11-280F22(10q25.3)
RP-11-113m14(10q26.13)RP-11-70E19(10q26.12)RP-11-10P15(10126.13) RP-11-506P9(10q25.3)源BAC DNA稀释并通过DOP-PCR扩增使用一轮常规的DOP-PCR(Telenius，1992)扩增100ng的各种稀释的BACDNA，5μl的每种扩增产物在1％琼脂糖凝胶上展开，纯化剩余产物并用PCR纯化试剂盒将其洗脱进50μl超纯水。如图13所示，除了RP-11-849(17p11.2)，所有其它的7种探针均成功地通过DOP-PCR扩增。
制备用于阵列印刷的缺失BAC DNA通过切口平移试剂盒(目录号976776)用生物素-16-dUTP(目录号1,093070，Roche)标记25μg人Cot-1 DNA(目录号15279-011，Invitrogen)并使用按照生产商的使用说明使用Ultrapure PCR纯化试剂盒(目录号12500-250，Mo Bio Laboratories Inc.美国)纯化，然后用0.1体积的3M NaAc(pH5.2)和2体积的100％冷乙醇沉淀，在烘箱内60℃干燥并重悬于100μl TE缓冲液中。
按照生产商的使用说明制备4.4mg(440μl)链霉抗生物素蛋白磁性颗粒并重悬于125μl 10mM TRIS-HCl、pH8.0，1mM EDTA、pH 8.0，2M NaCl(2×结合和洗涤缓冲液)中。
125μl制备的链霉抗生物素蛋白磁性颗粒与100μl生物素化的Cot-1 DNA混合并于室温轴向旋转孵育40分钟。然后将试管应用于磁性颗粒分离器10分钟。
这些珠在0.1×SSC、0.1％SDS中于室温洗涤三次，然后于65℃在0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤三次以除去未结合的Cot-1 DNA。这些珠悬浮进100μl的6×SSC、0.1％SDS。
用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2体积的100％冷乙醇沉淀混合有6 BACDNA的分别为1μg的5q25 BAC DNA和10q25-26，在烘箱内65℃干燥并重悬于100μl 6×SSC、0.1％SDS。
100μl制备的珠和100μl各种源BAC DNA一起混合，煮沸10分钟变性，并于65℃杂交过夜。
然后将试管应用于磁性颗粒分离器3分钟，小心地弃去上清液，按照生产商的使用说明使用Ultrapure PCR纯化试剂盒纯化并悬浮于50μl TE缓冲液(10mMTRIS-HCl、pH8.0，0.1mM EDTA、pH8.0)。
5μl的洗脱产物经过CAT4DOP-PCR扩增(Craig，1997)。5μl的各种产物在1％的琼脂糖凝胶上检测(图13下幅)，剩余的纯化、洗脱进50μl超纯水并点样于前述的芯片上。
实施例17制备用于阵列印刷的SEP-PCR探针(i)Y染色体特异性序列10个不同的DYS基因座选自DYS19(3682bp) DYS385(4676bp)DYS389(4244bp)DYS390(3872bp)DYS391(4039bp)DYS392(3252bp)DYS393(3454bp)DYS437(3043bp)DYS438(3010bp)DYS439(2054bp)(ii)男性基因组DNA样品的来源使用Qiagen试剂盒标准方案合并基本上来自淋巴细胞制备物的DNA，该淋巴细胞制备物是来自十多种正常男性的不同样品，这些正常男性包括不同的国籍，例如亚洲人、高加索人和希腊人等。将10μl的各种样品混合在一起以制得合并的男性DNA。
(ii)扩展的长模板PCR(ELT-PCR)扩增按照生产商的使用说明使用扩展的长模板PCR系统(目录号1681 842，Roche)为每个基因座进行总体积为50μl的PCR。10个DYS基因座中仅成功扩增了7个，并且如图14的上幅所示，10μl的各种扩增产物在1％琼脂糖凝胶上展开。这些扩增产物命名为S1-S7，包括S1(DYS 19)、S2(DYS 385)、S3(DYS 389)、S4(DYS 390)、S5(DYS 437)、S6(DYS 439)和S7(DYS 393)。S1、S2、S3和S4的样品合并在一起且命名为SP1。用于扩增这10种不同DYS基因座的引物的序列列于表5。
(iii)使用ELT-PCR扩增产物的DOP-PCR1μl的各四种DYS基因座特异的ELT-PCR扩增产物(DYS17、DYS385、DYS389和DYS390)再经过另一轮的DOP-PCR扩增。如图14下幅所示，5μl的每种扩增产物在1％琼脂糖凝胶上展开，剩余的使用Ultrapure纯化试剂盒纯化并保存于-20℃。这些扩增产物命名为SD1-SD4，包括SD1(DYS19)、SD2(DYS385)、SD3(DYS389)和SD4(DYS390)。SD1、SD2、SD3、和SD4的样品合在一起并且命名为SPD1。
表5.
为了制备用于阵列印刷的探针和制备用于使用选择性增强的引物延伸预扩增(SEP)的阵列CGH分析的单细胞靶位而扩增10个不同的DYS基因座所用的引物

实施例18使用SEP-PCR技术制备用于阵列CGH分析的Cy3-和Cy5-dUTP-标记的靶序列(i)Y染色体特异性序列7个不同的DYS基因座选自DYS19(3682bp) DYS385(4676bp)DYS389(4244bp)DYS390(3872bp)DYS393(3454bp)DYS437(3043bp)DYS439(2054bp)(ii)SEP扩增策略单细胞DOP-PCR按上述进行，除了向第一轮和第二轮DOP-PCR中加入不同组合的DYS引物，包括第一组合在第一轮和第二轮DOP-PCR中均加入1μl的合并引物(0.1pmol，仅是F-引物)第二组合在第一轮和第二轮DOP-PCR中均加入1μl的合并引物(0.1pmol，F-和R-引物)第三组合在第一轮和第二轮DOP-PCR中均加入1μl的合并引物(0.1pmol，F-引物)第四组合在第一轮和第二轮DOP-PCR中均加入1μl的合并引物(0.1pmol，F-和R-引物)4个女性的单细胞(图15的上幅)和4个男性的单细胞(图15的下幅)使用上述各自的条件独立扩增。如图15所示，5μl的每种扩增产物在1％琼脂糖凝胶上展开，剩余的使用Ultrapure纯化试剂盒纯化。
最后，应该理解的是，在不脱离本发明的范围和精神的条件下，对文中描述的本发明方法和组合物做出各种改进和改变对于本领域的技术人员是显而易见的。虽然用具体的优选实施方案对本发明进行了描述，但应该理解要求权利的本发明不应该被不恰当地限制于这些特定的实施方案。实际上，实践本发明的所述方式的各种改进形式也要包括在本发明的范围内，这种改进形式对于检测染色体异常、产前诊断和植入前遗传诊断、分子生物学或相关领域的技术人员是显而易见的。
权利要求
1.一种将具有第一核型的细胞的至少一条染色体或其一部分与具有第二核型的细胞的对应染色体或其一部分进行比较的方法，所述方法包括以下步骤(a)从分离的染色体或分离染色体的一部分扩增DNA；(b)将扩增的DNA与固体基质相连；(c)从具有第一核型的一个或多个细胞扩增DNA并从具有第二核型的一个或多个细胞扩增DNA；(d)用第一标记来标记扩增自具有第一核型的一个或多个细胞的DNA，并用第二标记来标记扩增自具有第二核型的一个或多个细胞的DNA，其中所述第一种和第二标记有可检测的不同；(e)将来自具有第一核型的一个或多个细胞的扩增并标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交，并将来自具有第二核型的一个或多个细胞的扩增并标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交；和(f)比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一种和第二标记的相对量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述从分离的染色体或分离染色体的一部分扩增DNA是随机引物扩增。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述随机引物扩增包括使用简并寡核苷酸引物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述简并寡核苷酸引物由以下核苷酸序列组成5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′，其中N是任何核苷酸。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述分离的染色体是通过显微切割或流式细胞术分离的染色体。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述分离染色体的一部分是染色体的克隆片段。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述来自分离染色体的一部分的扩增DNA排除了非染色体序列。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增DNA排除了重复序列和/或由于扩增DNA而超表现的序列。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增DNA排除了重复序列。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述重复序列是Cot-1序列。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，将扩增DNA连接到固体基质之前，所述来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增DNA是经过大小选择的。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增DNA是经过大小选择的，其DNA大小小于10kb。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增DNA是经过大小选择的，其DNA大小小于3kb。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述从具有第一核型的一个或多个细胞扩增DNA和从具有第二核型的一个或多个细胞扩增DNA是随机引物扩增。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述随机引物扩增包括使用简并寡核苷酸引物。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述简并寡核苷酸引物由以下核苷酸序列组成5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′，其中N是任何核苷酸。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述来自具有第一核型的一个或多个细胞的扩增DNA和来自具有第二核型的一个或多个细胞的扩增DNA均排除了重复序列。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述重复序列是Cot-1序列。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其特征在于，所述来自具有第一核型的一个或多个细胞的扩增DNA是扩增自1-20个细胞的DNA。
20.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其特征在于，所述来自具有第一核型的一个或多个细胞的扩增DNA是扩增自单细胞的DNA。
21.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述具有第一核型的一个或多个细胞是胚胎细胞、胎儿细胞、生殖细胞、癌性细胞或极体。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述单细胞是胚胎细胞、卵母细胞或极体。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其特征在于，所述具有第二核型的一个或多个细胞是与具有第一核型的一个或多个细胞相同类型的细胞。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其特征在于，所述来自具有第二核型的一个或多个细胞的扩增DNA是扩增自与具有第一核型的一个或多个细胞相同数目的细胞的DNA。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其特征在于，所述从分离的染色体或分离染色体的一部分扩增DNA还包括扩增特定的染色体区域。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述从具有第一核型的一个或多个细胞扩增DNA和从具有第二核型的一个或多个细胞扩增DNA还包括扩增相同的特定染色体区域。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一标记是Cy3-dUTP，第二标记是Cy5-dUTP。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用于胚胎或卵母细胞的植入前诊断。
29.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用于产前诊断胎儿的染色体异常。
30.一种检测具有未知核型的细胞内染色体异常的方法，所述方法包括以下步骤(a)从分离的染色体或分离的染色体的一部分扩增DNA；(b)将扩增的DNA与固体基质相连；(c)从具有未知核型的一个或多个细胞扩增DNA并从具有参考核型的一个或多个细胞扩增DNA；(d)用第一标记来标记具有未知核型的一个或多个细胞的扩增DNA，并用第二标记来标记具有参考核型的一个或多个细胞的扩增DNA，其中第一种和第二标记有可检测的不同；(e)将来自具有未知核型的一个或多个细胞的扩增并标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交，并将来自具有参考核型的一个或多个细胞的扩增并标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交；和(f)通过比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一种标记的相对量和与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第二标记的量来检测具有未知核型的细胞内是否存在染色体异常。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述从分离的染色体或分离染色体的一部分扩增DNA是随机引物扩增。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述随机引物扩增包括使用简并寡核苷酸引物。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述简并寡核苷酸引物由以下核苷酸序列组成5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′，其中N是任何核苷酸。
34.如权利要求30-33中任一项所述的方法，其特征在于，所述分离的染色体是通过显微切割或流式细胞术分离的染色体。
35.如权利要求30-33中任一项所述的方法，其特征在于，所述分离染色体的一部分是染色体的克隆片段。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述来自分离染色体的一部分的扩增DNA排除了非染色体序列。
37.如权利要求30-36中任一项所述的方法，其特征在于，所述来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增DNA排除了重复序列和/或由于扩增DNA而超表现的序列。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增DNA排除了重复序列。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述重复序列是Cot-1序列。
40.如权利要求30-39中任一项所述的方法，其特征在于，将扩增DNA连接到固体基质之前，所述来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增DNA是经过大小选择的。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增DNA是经过大小选择的，其DNA大小小于10kb。
42.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增DNA是经过大小选择的，其DNA大小小于3kb。
43.如权利要求30-42中任一项所述的方法，其特征在于，所述从具有未知核型的一个或多个细胞扩增DNA和从具有参考核型的一个或多个细胞扩增DNA是随机引物扩增。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述扩增包括使用简并寡核苷酸引物。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述简并寡核苷酸引物由以下核苷酸序列组成5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′，其中N是任何核苷酸。
46.如权利要求30-45中任一项所述的方法，其特征在于，所述来自具有未知核型的一个或多个细胞的扩增DNA和来自具有参考核型的一个或多个细胞的扩增DNA均除去了重复序列。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述重复序列是Cot-1序列。
48.如权利要求30-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述来自具有未知核型的一个或多个细胞的扩增DNA是扩增自1-20个细胞的DNA。
49.如权利要求30-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述来自具有未知核型的一个或多个细胞的扩增DNA是扩增自单细胞的DNA。
50.如权利要求30-48中任一项所述的方法，其特征在于，所述具有未知核型的一个或多个细胞是胚胎细胞、胎儿细胞、生殖细胞、癌性细胞或极体。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述单细胞是胚胎细胞、卵母细胞或极体。
52.如权利要求30-51中任一项所述的方法，其特征在于，所述具有参考核型的一个或多个细胞是与具有未知核型的一个或多个细胞相同类型的细胞。
53.如权利要求30-52中任一项所述的方法，其特征在于，所述来自具有参考核型的一个或多个细胞的扩增DNA是扩增自与具有未知核型的一个或多个细胞相同数目的细胞的DNA。
54.如权利要求30-53中任一项所述的方法，其特征在于，所述从分离的染色体或分离染色体的一部分扩增DNA还包括扩增特定的染色体区域。
55.如权利要求30-54中任一项所述的方法，其特征在于，所述从具有未知核型的一个或多个细胞扩增DNA和从具有参考核型的一个或多个细胞扩增DNA还包括扩增相同的特定染色体区域。
56.如权利要求30-55中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一标记是Cy3-dUTP，第二标记是Cy5-dUTP。
57.如权利要求30-56中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用于胚胎或卵母细胞的植入前诊断。
58.如权利要求30-56中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用于产前诊断胎儿的染色体异常。
59.一种与固体基质相连的核酸，其中所述核酸衍生自分离的染色体或分离染色体的一部分并且所述核酸排除了重复序列。
60.如权利要求59所述的核酸，其特征在于，所述核酸衍生自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增。
61.如权利要求60所述的核酸，其特征在于，所述从分离的染色体或分离染色体的一部分扩增是随机引物扩增。
62.如权利要求61所述的核酸，其特征在于，所述从分离的染色体或分离染色体的一部分扩增包括使用简并寡核苷酸引物。
63.如权利要求62所述的核酸，其特征在于，所述简并寡核苷酸引物由以下核苷酸序列组成5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′，其中N是任何核苷酸。
64.如权利要求59-63中任一项所述的核酸，其特征在于，所述分离的染色体是通过显微切割或流式细胞术分离的染色体。
65.如权利要求59-63中任一项所述的核酸，其特征在于，所述分离染色体的一部分是通过显微切割或流式细胞术分离的染色体的一部分。
66.如权利要求59-63中任一项所述的核酸，其特征在于，所述分离染色体的一部分是染色体的克隆片段。
67.如权利要求66所述的核酸，其特征在于，所述核酸也排除了非染色体序列。
68.如权利要求60-67中任一项所述的核酸，其特征在于，所述来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增DNA也排除了由于扩增而超表现的序列。
69.如权利要求59-68中任一项所述的核酸，其特征在于，所述重复序列是Cot-1序列。
70.如权利要求59-69中任一项所述的核酸，其特征在于，所述来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增核酸是经过大小选择的。
71.如权利要求70所述的核酸，其特征在于，所述来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增核酸是经过大小选择的，其大小小于10kb。
72.如权利要求70所述的核酸，其特征在于，所述来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增核酸是经过大小选择的，其大小小于3kb。
73.如权利要求59-72中任一项所述的核酸，其特征在于，所述与基质相连的核酸是杂交的靶。
74.如权利要求73所述的核酸，其特征在于，所述与基质相连的核酸是基因组比较杂交的靶。
75.一种核酸阵列，所述阵列包括如权利要求59-74中任一项所述的与固体基质相连的一种或多种核酸。
76.一种与固体基质相连的核酸，其中所述核酸衍生自分离的染色体或分离染色体的一部分的随机引物扩增，且所述核酸排除去了重复序列、非染色体序列或由于扩增而超表现的序列中的一种或多种。
77.如权利要求76所述的核酸，其特征在于，所述随机引物扩增包括使用简并寡核苷酸引物。
78.如权利要求77所述的核酸，其特征在于，所述简并寡核苷酸引物由以下核苷酸序列组成5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′，其中N是任何核苷酸。
79.如权利要求76-78中任一项所述的核酸，其特征在于，所述分离的染色体是通过显微切割或流式细胞术分离的染色体。
80.如权利要求76-78中任一项所述的核酸，其特征在于，所述分离染色体的一部分是通过显微切割或流式细胞术分离的染色体的一部分。
81.如权利要求76-78中任一项所述的核酸，其特征在于，所述分离染色体的一部分是染色体的克隆片段。
82.如权利要求76-81所述的核酸，其特征在于，所述重复序列是Cot-1序列。
83.如权利要求76-82所述的核酸，其特征在于，所述非染色体序列是细菌序列。
84.如权利要求76-83所述的核酸，其特征在于，所述来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增核酸是经过大小选择的。
85.如权利要求84所述的核酸，其特征在于，所述来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增核酸是经过大小选择的，其大小小于10kb。
86.如权利要求84所述的核酸，其特征在于，所述来自分离的染色体或分离染色体的一部分的扩增核酸是经过大小选择的，其大小小于3kb。
87.如权利要求76-86中任一项所述的核酸，其特征在于，所述与固体基质相连的核酸是杂交的靶。
88.如权利要求87所述的核酸，其特征在于，所述与固体基质相连的核酸是基因组比较杂交的靶。
89.一种与固体基质相连的核酸阵列，所述阵列包括如权利要求76-88中任一项所述的与固体基质相连的一种或多种核酸。
90.一种衍生自分离的染色体或分离染色体的一部分的随机引物扩增的核酸，其中，所述核酸排除了重复序列。
91.如权利要求90所述的核酸，其特征在于，所述随机引物扩增包括使用简并寡核苷酸引物。
92.如权利要求91所述的核酸，其特征在于，所述简并寡核苷酸引物由以下核苷酸序列组成5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′，其中N是任何核苷酸。
93.如权利要求90-92中任一项所述的核酸，其特征在于，所述分离的染色体是通过显微切割或流式细胞术分离的。
94.如权利要求90-92中任一项所述的核酸，其特征在于，所述分离染色体的一部分是通过显微切割或流式细胞术分离的染色体的一部分。
95.如权利要求90-92中任一项所述的核酸，其特征在于，所述分离染色体的一部分是染色体的克隆片段。
96.如权利要求95所述的核酸，其特征在于，所述核酸也排除了非染色体序列。
97.如权利要求91-96中任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸还排除了由于扩增而超表现的序列。
98.如权利要求90-97中任一项所述的核酸，其特征在于，所述重复序列是Cot-1序列。
99.如权利要求90-98中任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸是经过大小选择的。
100.如权利要求99所述的核酸，其特征在于，所述核酸大小是经过大小选择的，其大小小于10kb。
101.如权利要求88所述的核酸，其特征在于，所述核酸大小是经过大小选择的，其大小小于3kb。
102.如权利要求90-101中任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸是杂交的靶核酸。
103.如权利要求102所述的核酸，其特征在于，所述核酸是基因组比较杂交的靶核酸。
104.一种将具有第一核型的单细胞的至少一条染色体或其一部分与具有第二核型的细胞的对应染色体或其一部分进行比较的方法，所述方法包括以下步骤(a)从分离的染色体或分离染色体的一部分扩增DNA；(b)将扩增的DNA与固体基质相连；(c)从具有第一核型的单细胞随机扩增DNA并从具有第二核型的一个或多个细胞随机扩增DNA；(d)用第一标记来标记来自具有第一核型的单细胞的扩增DNA，并用第二标记来标记来自具有第二核型的一个或多个细胞的扩增DNA，其中第一种和第二标记有可检测的不同；(e)将来自具有第一核型的单细胞的扩增并标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交，并将来自具有第二核型的一个或多个细胞的扩增并标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交；和(f)比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一种和第二标记的相对量。
105.一种在具有未知核型的单细胞中检测染色体异常的方法，所述方法包括以下步骤(a)从分离的染色体或分离的染色体的一部分随机扩增DNA；(b)将扩增的DNA与固体基质相连；(c)从具有未知核型的单细胞随机扩增DNA并从具有参考核型的一个或多个细胞扩增DNA；(d)用第一标记来标记来自具有未知核型的单细胞的扩增DNA，并用第二标记来标记来自具有参考核型的一个或多个细胞的扩增DNA，其中第一种和第二标记有可检测的不同；(e)将来自具有未知核型的单细胞的扩增并标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交，并将来自具有参考核型的一个或多个细胞的扩增并标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交；和(g)通过比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一标记的相对量和与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第二标记的量来检测具有未知核型的细胞内是否存在染色体异常。
106.一种胚胎的植入前遗传诊断方法，该方法包括以下步骤(a)从分离的染色体或分离染色体的一部分随机扩增DNA；(b)将扩增的DNA与固体基质相连；(c)从具有未知核型的一个或多个胚胎细胞随机扩增DNA并从具有参考核型的一个或多个细胞扩增DNA；(d)用第一标记来标记具有未知核型的一个或多个胚胎细胞的扩增DNA，并用第二标记来标记具有参考核型的一个或多个细胞的扩增DNA，其中第一种和第二标记有可检测的不同；(e)将具有未知核型的一个或多个细胞的扩增并标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交，并将具有参考核型的一个或多个细胞的扩增并标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交；(f)通过比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一标记的相对量和与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第二标记的量来检测具有未知核型的胚胎细胞内是否存在染色体异常；和(g)通过一个或多个胚胎细胞中不存在染色体异常来确定胚胎或卵母细胞植入的适合性。
107.一种卵母细胞的植入前遗传诊断方法，该方法包括以下步骤(a)从分离的染色体或分离染色体的一部分随机扩增DNA；(b)将扩增的DNA与固体基质相连；(c)从具有未知核型的卵母细胞的极体随机扩增DNA并从具有参考核型的一个或多个细胞扩增DNA；(d)用第一标记来标记具有未知核型的卵母细胞的极体的扩增DNA，并用第二标记来标记具有参考核型的一个或多个细胞的扩增DNA，其中第一种和第二标记有可检测的不同；(e)将具有未知核型的卵母细胞的极体的扩增并标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交，并将具有参考核型的一个或多个细胞的扩增并标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交；(f)通过比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一标记的相对量和与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第二标记的量来检测具有未知核型的卵母细胞的极体内是否存在染色体异常；和(g)通过卵母细胞的极体中不存在染色体异常来确定卵母细胞植入的适合性。
108.一种出生前诊断胎儿染色体异常的方法，该方法包括以下步骤(a)从分离的染色体或分离染色体的一部分随机扩增DNA；(b)将扩增的DNA与固体基质相连；(c)从具有未知核型的一个或多个胎儿细胞随机扩增DNA并从具有参考核型的一个或多个细胞扩增DNA；(d)用第一标记来标记具有未知核型的一个或多个胎儿细胞的扩增DNA，并用第二标记来标记具有参考核型的一个或多个细胞的扩增DNA，其中第一种和第二标记有可检测的不同；(e)将具有未知核型的一个或多个胎儿细胞的扩增并标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交，并将具有参考核型的一个或多个细胞的扩增并标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交；和(f)通过比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一标记的相对量和与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第二标记的量来检测胎儿内是否存在染色体异常。
全文摘要
本发明涉及一种将具有第一核型的细胞的至少一条染色体或其一部分与具有第二核型的细胞的对应染色体或其一部分进行比较的方法。所述方法包括以下步骤(a)从分离的染色体或分离染色体的一部分扩增DNA；(b)将扩增的DNA与固体基质相连；(c)从具有第一核型的一个或多个细胞扩增DNA和从具有第二核型的一个或多个细胞扩增DNA；(d)用第一标记来标记具有第一核型的一个或多个细胞的扩增DNA以及用第二标记来标记具有第二核型的一个或多个细胞的扩增DNA，其中第一种和第二标记有可检测的不同；(e)将来自具有第一核型的一个或多个细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交，并将来自具有第二核型的一个或多个细胞的扩增且标记的DNA与连接在固体基质上的扩增DNA杂交；和(f)比较与连接在固体基质上的扩增DNA杂交的第一种和第二标记的相对量。
文档编号C12Q1/68GK1798974SQ200480015169
公开日2006年7月5日 申请日期2004年4月2日 优先权日2003年4月2日
发明者N·D·赫西, D·G·胡 申请人:阿德莱德研究及创新控股有限公司