用于检测β球蛋白基因的变异的微阵列及其检测方法
【专利说明】用于检测0球蛋白基因的变异的微阵列及其检测方法
[0001] 本发明是申请号为2013800175584(国际申请号为PCT/JP2013/060261)、申请日 为2013年3月28日、发明名称为"用于检测P球蛋白基因的变异的微阵列及其检测方法" 的发明申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及用于检测P球蛋白基因的变异的探针组、具有该探针组的微阵列、及 使用其检测0球蛋白基因的变异的方法。
【背景技术】
[0003]人类基因组由约30亿个基因密码（碱基）构成，逐渐了解到个体间存在多个基因 密码（碱基序列）的差异。现在，这些碱基序列的差异中，特别引人关注的是单核苷酸多态 性（SNP)。
[0004]单核苷酸多态性（SNP)是指在DNA的碱基序列中仅1个碱基不同，是对应于是否 能喝酒、药是否容易发挥作用等人类个性的最小单位。在人类基因组的30亿个碱基对中， 显示存在约300万个（每500~1000碱基对中存在1个的比例）~1000万个单核苷酸多 态性（SNP)，通过不生成特定的蛋白质或形成与他人不同之处，从而带来个体差异（体质）、 人种差异等差别。就人类基因的个体差异的研究而言，可以说对单核苷酸多态性进行解析、 调查疾病易感性以及对药物的响应并给与对该人类个体副作用少的药物即定制医疗将成 为可能，单核苷酸多态性（SNP)解析的研究在不断推进。
[0005]单核苷酸多态性（SNP)引人关注的理由在于，随着核酸解析技术的改进而能够进 行多个SNP解析，此外，疾病和SNP之间的相关性也逐渐明确。在疾病相关基因、药物代谢 的个体差异解析及慢性疾病等广泛领域中，与SNP的相关性也逐渐明确。期待着今后SNP 与这些的相关性的进一步明确。
[0006]核酸解析技术处理非常繁多的试样、含有数量庞大的操作，复杂且费时，通常要求 较高精度。核酸解析技术中，作为迅速高精度地检测多个基因变异的手段，已知SNP检测用 DNA芯片（DNA芯片也称为DNA微阵列。以下只要没有特别限定则意义相同。）是有效的。
[0007]DNA芯片是指在载体的各个所设定的分区中固定有核酸探针（探针）的芯片，通 常，核酸探针使用具有与待测核酸片段互补的碱基序列的单链DNA或寡核苷酸分子。
[0008]SNP检测用DNA芯片中，固定有与变异核酸的检查对象位点相当的核酸片段的互 补链作为核酸探针。就变异的检查对象位点而言，通常存在1个正常型和多个变异型，与这 些中的任意者匹配的核酸探针排列在分区（polt)内。待测试样使用如下待测物液体，所述 待测物液通过以PCR法为代表的核酸扩增法仅扩增出与发生变异的检查对象位点相当的 核酸片段。
[0009] 使该待测物液与SNP检测用DNA芯片的固定有核酸探针的面接触，使待测物核酸 片段和对应的核酸探针间发生杂交。然后，检测该杂交所形成的键作为光学或电化学信号 形式，从而可以鉴定和定量与核酸探针发生结合的待测物核酸片段。
[0010] 在此，当核酸探针和待测物的组合为野生型探针和野生型待测物、或变异型探针 和与其对应的变异型待测物这样的完全匹配时，杂交完全，形成强键。而另一方面，核酸探 针和待测物的组合为野生型探针和变异型待测物、或变异型探针和野生型待测物这样的错 配时，必然伴有不能形成氢键的位点，因此杂交不完全，形成弱键。
[0011] 通常，为了维持高特异性，在通过温度、盐、洗涤剂、溶剂、离液剂及变性剂的各种 组合所实现的最为严格的条件下进行杂交，对完全匹配和错配之间的杂交结合力差异所引 起的信号强度差异进行检测，从而能够识别、确定待测物中的基因型。
[0012] 但是，血红蛋白为将氧由肺向细胞、且将二氧化碳从细胞向肺输送的含铁变构复 合蛋白。血红蛋白A为主要的成熟血红蛋白，含有4条多肽链（2条a-球蛋白链及2条P 球蛋白链）。
[0013] 多种人类疾病被认为有起因于对编码血红蛋白多肽链的1个以上基因产生影响 的基因变异。这类疾病含有镰状红细胞贫血，其是由于血红蛋白0链中的点突变而发生 的。此外，P地中海贫血症是由于球蛋白链的1种型的不充分合成从而表型上成为显著 的、由基因变异而发生的血液相关疾病，产生其它型球蛋白链的过度合成（例如，参照非专 利文献1)。
[0014] 另一方面，最新开发的分子生物学技术已经能够对引起特定的人疾病状态及症状 或与之相关的基因异常进行研究。聚合酶链反应（PCR)及其多种变形的方法成为用于疾病 状态及症状中的基因异常研究的极其有用的工具（例如，参照非专利文献2及3)。
[0015] 使用PCR法容易对特定的目的DNA或该DNA的部分进行扩增，并对扩增出的部分 进一步附加特征。该进一步附加特征包括用于确定大小的凝胶电泳、核苷酸序列确定、使用 特定探针的杂交研究等（例如，参照非专利文献4)。
[0016] 近年，进行了很多关于SNPs(单核苷酸多态性）等基因型（即基因多态性）和疾 病等的因果关系的研究，正在对基因异常是否存在于特定个体的基因组进行确定。
[0017] 作为对SNPs等一个碱基变异或2个以上碱基数的基因变异进行判定（检测）的 方法，首先有PCR-SSP法。该方法由于对发生变异的基因的碱基序列合成特异性引物、实 施PCR，因此为了判断数十个基因变异，需要数十对引物。
[0018] 该方法的分析时间短，为简便的方法，但合成上述引物时得小心翼翼，还需要知识 和时间，因此在大量待测物的分析中存在限制。除此之外，欲对变异进行检测的位置越多则 PCR-SSP的次数也越多，因此具有难以一次处理多个待测物的缺点。
[0019] 作为第2方法可以被认为是从以往一直进行的限制酶片段长度多态性法（PCR-RFLP法）。对共通序列位点设定引物，使其内侧、S卩PCR产物内具有多态性并对其进行扩增。 扩增后，利用各种限制酶将扩增产物切断，通过其DNA片段的尺寸将基因序列的变异分类。
[0020] 该方法虽然结果的判定容易、方法也简单，但在限制酶所能够识别的位点被限定 时变得难以判别，此外，待测物的分离中必须使用聚丙烯酰胺凝胶，因此难以对大量的待测 物、数十个变异同时进行分类。进而有报道指出，通常在对全血待测物直接进行PCR扩增 后、用限制酶进行片段化时，扩增待测物中残存来自于全血的蛋白质，利用限制酶进行的切 断并不完全。即，由于结合于DNA的蛋白质没有从DNA中分离，限制酶无法与DNA结合，切 断反应未正常进行，需要进行DNA的提取操作。
[0021] 作为第3方法，有PCR-SSCP法。该方法为如下方法，S卩，在添加甲酰胺等变性剂使 PCR产物变性为单链DNA(ssDNA)后，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳中，ssDNA具有基于其碱基序列的特殊结构，电泳中显示固有的移动速度，分别形成不同类型的条带。
[0022] 该方法为利用基于碱基序列而显示固有的移动速度这一性质对碱基序列中的变 异进行分类的方法，需要复杂且难度高的技术，其结果的解析也需要经验和知识。
[0023]作为第 4 方法可以认为是PCR-SSO(sequencespecificoligonucleotide)法。 PCR-SSO为如下方法，S卩，使针对正常位点和变异位点的合成探针与点样在过滤器的（有时 也使用微孔板）PCR产物杂交，来检测有无变异。此外，相反地、也有将探针点样、使PCR产 物杂交的反向点杂交法（Reversedotblotmethod)。如果比喻成抗原抗体反应有如下方 法，即，DNA作为抗原，与针对变异位点的特异性抗体和针对正常位点的特异性抗体进行作 用，观察与哪种抗体发生结合。一直以来，该方法的检测中使用放射性同位素，由于所使用 的设施的制约等，逐渐变成通过化学发光、显色等进行检测。
[0024] 该方法虽然简便，但需要确保样品量为相当大量、否则反而需要引入提高灵敏度 的方法（例如，参照非专利文献5及6、专利文献1)。
[0025] 作为第5方法，已知有直接碱基序列确定法。直接碱基序列确定法是以PCR扩增 获得的DNA链为模板直接确定碱基序列而无需进行亚克隆等到载体的方法。
[0026] 该方法中，对PCR扩增获得的DNA链进行被称为非对称PCR的二次PCR，对单链DNA 进行扩增，通常使用双脱氧法来确定碱基序列。该二次PCR是通过对一组引物中的一者限 量（通常为1:10~1 :1〇〇)进行PCR，从而对单链DNA进行扩增。最近应用循环测序法，能 够更简单地进行测序反应。但是试剂盒价格非常昂贵，还需要昂贵的装置，实验过程也复 杂，因此用于大量待测物的解析时成本上升。
[0027] 专利文献1:日本特开平5-184398号公报
[0028]非专利文献I:Weatherall等，TheThalassaemiaSyndromes，第 3 版，Oxford， BlackwellScientific,1981
[0029]非专利文献 2:Erlich等，CurrentCommunicationsinMolecularBiology： PolymeraseChainReaction，ColdSpringHarbor：ColdSpringHarborPress(1989)
[0030]非专利文献 3:Innis等，PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications. San Diego ：Academic Press (1990)
[0031]非专利文献 4:Sambrook等，MolecularCloning-ALaboratoryManual，第 2 版， ColdSpringHarbor：ColdSpringHarborPress(1989)
[0032]非专利文献 5:Am.J.Hum.Genet. 43 :095-100,1988
[0033]非专利文献 6:Blood，Vol81，NoUJanuaryI). 1993:pp239-242
【发明内容】
[0034] 如上所述，为了对基因的变异进行分析?检测而使用了各种检测方法，但这些方法 的共通缺点在于，为了同时检测多个变异，需要极长时间和海量的劳动，尤其是对大量待测 物进行分析则困难更大。
[0035] 因此，本发明的主要目的在于，提供能够简便且短时间地检测多个变异（待测物） 的、用于检测P球蛋白基因的变异的微阵列。
[0036] 本发明人等鉴于现有技术存在的问题反复进行了深入研究，结果发现，通过使用 多种具有特定序列的探针可以实现上述目的，直至完成了本发明。
[0037] 即、本发明涉及一种含有序列号3、4、7、8、11、12、17、18和序列号25~66所不的 基因的用于检测P球蛋白基因的变异的探针组、固定化有该探针组的微阵列、使用该微阵 列的变异检测方法及试剂盒。
[0038] 根据本发明，PCR产物可以不精制就与杂交溶液混合并直接与微阵列接触、反应， 因此即使使用大量待测物的情况下也能够在短时间内进行处理。进而，可以一次性检测P 球蛋白基因的25个位置的变异，因此实用性、有用性优异。
【附图说明】
[0039] 图1是示出本发明的校正方法的图。
[0040] 图2是示出本发明的校正方法的图。
[0041] 图3是示出本发明的校正方法的图。
[0042] 图4是示出本发明的校正方法的图。
[0043]图5示出在表示第1、第2多态性检测用探针的信号强度的荧光坐标系中，标绘将 第1对照核酸多次杂交的结果、以及获得的代表性直线。
[0044] 图6示出在图5的基础上标绘将第2对照核酸多次杂交的结果、以及获得的代表 性直线。
[0045]图7是校正值C、C2的图。
[0046] 图8是使用校正值C、C2、误差角度进行校正前、校正后的探针性能数据。
[0047] 图9是由来自于质粒的25种样品获得的数据的校正前、校正后。
[0048] 图10是将表9的数据叠加在图9的校正后的图中的结果。
【具体实施方式】
[0049] 以下详细说明本发明。以下的实施方式是用于说明本发明的例示，本发明并非