Dna微阵列芯片检测与ⅱ型糖尿病相关的单核苷酸多态性的方法
【专利摘要】本发明涉及一种DNA微阵列芯片检测与Ⅱ型糖尿病相关的单核苷酸多态性的方法，属于DNA微阵列芯片【技术领域】。本发明提供的方法利用6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子作为标记物，结合筛选出的6条用于Ⅱ型糖尿病检测的寡核苷酸探针研制了一种可以同时检测6个与Ⅱ型糖尿病相关突变位点的微阵列芯片检测方法，实现了对模拟Ⅱ型糖尿病的DNA样品和Ⅱ型糖尿病的实际样品的检测。
【专利说明】DNA微阵列芯片检测与II型糖尿病相关的单核苷酸多态性 的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种DNA微阵列芯片检测与II型糖尿病相关的单核苷酸多态性的方 法，属于DNA微阵列芯片【技术领域】。
【背景技术】
[0002] II型糖尿病是由遗传和环境因素共同作用而引起的一种多基因遗传异质性 疾病。从遗传学角度研究其发病机制对糖尿病前期的筛查、诊断和干预非常重要（A genome-wide association study identified novel risk loci for type 2diabetes. Nature. 2007,445,881-885 ；Genome-ffide Association Analysis Identifies Loci for Type 2Diabetes and Triglyceride Levels. Science, 2007, 316, 1331-1336.)。在复杂疾 病的遗传机制研究中，单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs)分析能 为复杂性状的遗传机制研究提供一条便捷、有效的途径。筛选能应用于与II型糖尿病发病 有关SNPs检测的寡核苷酸探针，对II型糖尿病的预防和个体化治疗等具有重要的意义。
[0003] 微阵列生物芯片具有样品用量少和高通量的特性，能对生命科学与医学中的各 种生物化学反应过程进行集成，从而实现对基因、配体及抗原等生物活性物质乃至细胞、 组织进行高效快捷的测试和分析。例如DNA微阵列芯片已被广泛应用到基因组学研究、 药物筛选和临床检测中（Resolving Individuals Contributing Trace Amounts of DNA to Highly Complex Mixtures Using High-Density SNP Genotyping Microarrays. PLoS Genet, 2008,4，1-9 !Technology Insight:microarrays-research and clinical applications. Nature Rev. Endocrinol.，2007, 3, 594-605.)〇
[0004] 金纳米粒子具有优良的化学稳定性和独特的光学性质。通过在金纳米粒子表 面修饰不同的生物分子（如DNA、抗体和凝集素等）作为微阵列生物芯片的标记探针， 根据其共振光散射性质，可以建立高灵敏度的生物样品检测体系。基于微阵列芯片的 共振光散射法比传统的荧光检测法具有更高的灵敏度和更好的稳定性（S c anome tr i c DNA Array Detection with Nanoparticle Probes.Science,2000,289,1757-1760 ； Nanoparticle-Based Bio -Bar Codes for the Ultrasensitive Detection of Proteins. Science，2003, 301，1884-1886.)。目前，一种金纳米粒子标记物通常只能针对一种生物分 子进行检测，因此，制备一种可以同时对多种待测物进行检测的金纳米粒子标记物对简化 微阵列生物芯片的检测方法具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明为解决上述技术问题，提供一种DNA微阵列芯片检测与II型糖尿病相关的 单核苷酸多态性的方法，该方法利用6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子作为标记物，及筛选 出6条用于II型糖尿病检测的寡核苷酸探针研制了一种可以同时检测多个与II型糖尿病 相关突变位点的微阵列芯片检测方法，实现了对模拟II型糖尿病的DNA样品和II型糖尿病 的实际样品的检测。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
[0007] -种DNA微阵列芯片检测与II型糖尿病相关的单核苷酸多态性的方法，包括以下 步骤：
[0008] (1)合成6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物；
[0009] (2)筛选出用于II型糖尿病6个突变位点检测的6条特定寡核苷酸探针；
[0010] (3)利用标准制作方法将所述特定寡核苷酸探针点样液点样到芯片上制备得到 DNA微阵列芯片；
[0011] (4)用所述的DNA微阵列芯片对模拟II型糖尿病的寡核苷酸靶标和II型糖尿病实 际样品进行检测，再用6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物对检测结果进行标记。
[0012] 在上述技术方案中，步骤（1)的具体步骤如下：
[0013] 6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物的合成：将6条100 μ M巯基修饰的寡核苷 酸以 SP1: SP2: SP3: SP4: SP5: SP6 = I. 2:1. 2: 0· 6:1:1. 6:1. 6 的比例混合；取 5 μ 1 该寡核苷酸 混合溶液与300 μ I 8ηΜ的金纳米粒子混合均匀，室温静置反应10h，再加入等体积的PBS缓 冲溶液，混合均匀后反应过夜；将反应后的溶液真空离心浓缩至100 μ 1，通过离心提纯反 应产物，获得6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物；
[0014] 其中所述寡核苷酸序列分别为：
[0015] SP1 ： (T10) CTCTCTTACATA, SP2 ： (T10) ATTTAAACCTTC,
[0016] SP3 ： (T10) TTCCTGGTTTCA, SP4 ： (T10) ACTTGATGCAAT,
[0017] SP5 : (Tltl) ATAGACTTACTG，SP6 : (Tltl) GGCAATTAAATT。
[0018] 在上述技术方案中，所述6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物的平均粒径为 13nm〇
[0019] 在上述技术方案中，步骤⑵中所述的6个突变位点分别为：rslll96205， rslll96218, rs6585205, rsl0946398, rsl0811661, rs7903146 ；
[0020] 所述的6条特定寡核苷酸探针序列分别为：
[0021] P1 ：CTGCTCGTAGTTATAA (T10)-NH2,
[0022] P1A : CTGCTGGTAGTTATAA (Tici) -NH2，
[0023] P2 : TCGGGTGCTTATGAAA (Tltl) -NH2，
[0024] P2A : TCGGGTGTTTATGAAA (T10) -NH2，
[0025] P3 : TCTAAGTCGTGGGGCA (Tici) -NH2，
[0026] P3A : TCTAAGTAGTGGGGCA (Tici) -NH2，
[0027] P4 :GACAGCATAACGATAC (T10) -NH2，
[0028] p4A ： gacagcagaacgatac(t10) -nh2,
[0029] P5 : TCATGAGAAAACTAAA (T10) -NH2，
[0030] p5A ： tcatgggaaaactaaa(t10) -nh2,
[0031] P6 ：ATATAGTATCTAAAAA (T10)-NH2,
[0032] P6A :ATATAATATCTAAAAA (T10) -NH2。
[0033] 在上述技术方案中，步骤（3)中所述特定寡核苷酸探针点样液的点样浓度为 30 μ M0
[0034] 在上述技术方案中，步骤（4)中所述的模拟II型糖尿病的寡核苷酸靶标的浓度为 500nM，所述的6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物的浓度为3nM。
[0035] 在上述技术方案中，步骤（4)中用所述的DNA微阵列芯片对模拟II型糖尿病的寡 核苷酸靶标和II型糖尿病实际样品进行检测、及再用6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记 物对检测结果进行标记的反应温度均为30°C。
[0036] 在上述技术方案中，步骤（4)中所述的模拟II型糖尿病的寡核苷酸靶标序列分别 为：
[0037] T1 ： TTATAACTACGAGCAGTATGTAAGAGAG,
[0038] Tia : TTATAACTACCAGCAGTATGTAAGAGAG,
[0039] T2 ： TTTCATAAGCACCCGAGAAGGTTTAAAT,
[0040] T2A:TTTCATAAACACCCGAGAAGGTTTAAAT,
[0041] T3：TGCCCCACGACTTAGATGAAACCAGGAA,
[0042] T3A ： TGCCCCACTACTTAGATGAAACCAGGAA,
[0043] T4：GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT,
[0044] T4A ： GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT,
[0045] T5 ： TTTAGTTTTCCCATGACAGTAAGTCTAT,
[0046] T5A ： TTTAGTTTTCTCATGACAGTAAGTCTAT,
[0047] T6 ： TTTTTAGATACTATATAATTTAATTGCC,
[0048] T6A :TTTTTAGATATTATATAATTTAATTGCC。
[0049] 在上述技术方案中，步骤（4)中所述：
[0050] 用所述的DNA微阵列芯片对模拟II型糖尿病的寡核苷酸靶标进行检测时，所述模 拟II型糖尿病的寡核苷酸靶标?\、T 2、T3、T4、T5、T6、T 1A、T2A、T3A、T4A、T5a和T 6a的浓度分别为： 0· 005、0· 01、0· 05、0· 1、0· 5、1、5、10、50、100、500 和 ΙΟΟΟηΜ，寡核苷酸探针 PpPpPyPpPp P6、P1A、P2A、P3A、P 4A、P5A 和 P6A 的点样浓度均为 30 μ M ;
[0051] 用所述DNA微阵列芯片对II型糖尿病实际样品进行检测时，实际样品的浓度分别 为：0· 5、1、5 和 ΙΟηΜ，寡核苷酸探针 P2、P3、P4、P5、P6、P 1A、P2A、P3A、P4A、P5a 和 P6a 的点样浓 度均为30 μ Μ。
[0052] 在上述技术方案中，在步骤（4)之后还包括如下步骤：
[0053] 将所述DNA微阵列芯片与ImL银增强溶液反应8min ;
[0054] 所述银增强溶液为硝酸银溶液与氢醌溶液的混合溶液，硝酸银溶液与氢醌溶液的 体积比为1:1。
[0055] 本发明具有以下有益效果：
[0056] (1)本发明提供的方法是以6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子作为标记物结合筛选 出来的探针制作DNA微阵列芯片，对模拟样品和实际样品进行检测（模拟样品和实际样品 即为寡核苷酸靶标）。应用本方法可实现对与II型糖尿病相关的模拟DNA样品和实际样品 的单核苷酸多态性进行检测。
[0057] (2)本发明用于合成多条寡核苷酸修饰的金纳米粒子的方法，具有简单，稳定，快 速的特点。使用该方法合成的6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物可以同时对多个与II 型糖尿病相关的突变位点进行检测。
[0058] (3)本发明的方法筛选出多个能用于II型糖尿病检测的特定寡核苷酸探针，通过 对单核苷酸多态性和等位基因频率的分析证明，这些特定寡核苷酸探针对靶标寡核苷酸检 测具有高特异性。
【专利附图】
【附图说明】
[0059] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0060] 图1为本发明提供的方法的过程示意图。
[0061] 图2用本发明的方法合成的6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物与未修饰的金 纳米粒子的对比图；
[0062] 其中图2a为未修饰的金纳米粒子的电镜图和溶液照片；图2b为用本发明的方法 合成的6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物的电镜图和溶液照片。
[0063] 图3用本发明的方法对模拟II型糖尿病6个易感基因突变位点的检测结果图。
[0064] 图4用本发明的方法对模拟II型糖尿病6个易感基因突变位点的等位基因频率检 测结果及对应的扫描图。
[0065] 图5用本发明的方法对15例II型糖尿病实际样品的风险基因检测结果以及相对 应的扫描图。
【具体实施方式】
[0066] 一种DNA微阵列芯片检测与II型糖尿病相关的单核苷酸多态性的方法，具体包括 以下步骤：
[0067] (1)合成6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物
[0068] 将六条ΙΟΟμΜ巯基修饰的寡核苷酸以SP1:SP2:SP 3:SP4:SP5:SP6 = 1. 2:1. 2:0. 6:1:1. 6:1. 6的比例混合。取5 μ 1该混合物与300 μ 18nM的金纳米粒子混合 均匀（按摩尔吸光系数为4. 2 X IO8Cm^T1计算），室温静置反应10h，加入等体积的PBS缓 冲溶液（IOmM ΡΒ，0. 2M NaCl，pH 7. 5)，混合均匀后反应过夜。将上述溶液真空离心浓缩至 10(^1，通过离心（13000印111，（9000印111，3\))提纯反应产物，获得6条寡核苷酸修饰的金 纳米粒子标记物。将纯化后的产物溶解在探针反应缓冲溶液（〇. 67XSSC，0. 1% (w/v)SDS) 中，在4°C下保存。所述6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物的平均粒径为13nm。
[0069] 其中所述寡核苷酸序列分别为：
[0070] SP1 ： (T10) CTCTCTTACATA, SP2 ： (T10) ATTTAAACCTTC,
[0071] SP3 ： (T10) TTCCTGGTTTCA, SP4 ： (T10) ACTTGATGCAAT,
[0072] SP5 : (Tltl) ATAGACTTACTG，SP6 : (Tltl) GGCAATTAAATT。
[0073] 图2a为未修饰的金纳米粒子的电镜图和溶液照片；图2b为用本发明的方法合成 的6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物的电镜图和溶液照片。通过对比说明我们已经将 6条寡核苷酸修饰到了金纳米粒子表面。
[0074] (2)筛选出用于II型糖尿病6个突变位点检测的6条特定寡核苷酸探针；
[0075] 所述的 6 个突变位点分别为：rslll96205, rslll96218, rs6585205, rsl0946398， rsl0811661, rs7903146 ；
[0076] 所述的6条特定寡核苷酸探针序列分别为：
[0077] P1 ：CTGCTCGTAGTTATAA (T10)-NH2,
[0078] P1A : CTGCTGGTAGTTATAA (Tici) -NH2，
[0079] P2 : TCGGGTGCTTATGAAA (Tltl) -NH2，
[0080] P2A : TCGGGTGTTTATGAAA (T10) -NH2，
[0081] P3 ：TCTAAGTCGTGGGGCA (T10)-NH2,
[0082] P3A : TCTAAGTAGTGGGGCA (Tici) -NH2，
[0083] P4 ：GACAGCATAACGATAC (T10)-NH2,
[0084] P4A :GACAGCAGAACGATAC (T10) -NH2，
[0085] P5 : TCATGAGAAAACTAAA (T10) -NH2，
[0086] P5A : TCATGGGAAAACTAAA (T10) -NH2，
[0087] P6 ：ATATAGTATCTAAAAA (T10)-NH2,
[0088] P6A :ATATAATATCTAAAAA (T10) -NH2。
[0089] (3)利用标准制作方法将所述特定寡核苷酸探针点样液点样到芯片上制备得到 DNA微阵列芯片；
[0090] 将特定寡核苷酸探针溶于3XSSC，1.5M甜菜碱，0.005% (w/v)SDS的点样液中。 根据标准制作方法使用博奥SmartArrayer 136微阵列芯片接触式针点系统在三维高分子 D基片上点样，点样量约为InL/点，点样浓度为30 μ M。将得到DNA微阵列芯片放入反应盒 中于37 °C，75 %相对湿度恒温恒湿培养箱中孵育过夜。
[0091] (4)用所述的DNA微阵列芯片对模拟II型糖尿病的寡核苷酸靶标（也称为模拟II 型糖尿病DNA样品）和II型糖尿病实际样品进行检测，再使用6条寡核苷酸修饰的金纳米 粒子标记物对检测结果进行标记；
[0092] 在制作好的DNA微阵列芯片的每个子阵列中先加入25 μ 1待测样品反应lh，再加 入3nM的6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物反应lh，反应温度均为30°C，清洗并离心 甩干。
[0093] 所述模拟II型糖尿病的寡核苷酸靶标序列分别为：
[0094] T1 ： TTATAACTACGAGCAGTATGTAAGAGAG,
[0095] Tia : TTATAACTACCAGCAGTATGTAAGAGAG,
[0096] T2 ： TTTCATAAGCACCCGAGAAGGTTTAAAT,
[0097] T2A: TTTCATAAACACCCGAGAAGGTTTAAAT,
[0098] T3：TGCCCCACGACTTAGATGAAACCAGGAA,
[0099] T3A ： TGCCCCACTACTTAGATGAAACCAGGAA,
[0100] T4：GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT,
[0101] T4A ： GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT,
[0102] T5：TTTAGTTTTCCCATGACAGTAAGTCTAT,
[0103] T5A ： TTTAGTTTTCTCATGACAGTAAGTCTAT,
[0104] T6：TTTTTAGATACTATATAATTTAATTGCC,
[0105] T6A : TTTTTAGATATTATATAATTTAATTGCC。
[0106] 用所述的DNA微阵列芯片对模拟II型糖尿病DNA样品进行检测时，所述模拟II型 糖尿病的寡核苷酸靶标?\、T 2、T3、T4、T5、T6、T 1A、T2A、T3A、T4A、T5a和T 6a的浓度分别为：0. 005、 0· 01、0· 05、0· 1、0· 5、1、5、10、50、100、500 和 100011]\1，寡核苷酸探针？1、？2、？3、？4、？ 5、？6、？14、 Ρ2Α、Ρ3Α、Ρ4Α、P5A和P6A的点样浓度均为30 μ M ;
[0107] 用所述DNA微阵列芯片对II型糖尿病实际样品进行检测时，实际样品的浓度分别 为：0· 5、1、5 和 ΙΟηΜ，寡核苷酸探针 P2、P3、P4、P5、P6、P 1A、P2A、P3A、P4A、P5a 和 P6a 的点样浓 度均为30 μ Μ。
[0108] 为了进一步提高检测灵敏度，还可以将步骤（4)所述的DNA微阵列芯片与ImL银 增强溶液反应8min ;根据金纳米粒子的共振光散射原理对DNA微阵列芯片进行检测。
[0109] 所述银增强溶液为硝酸银溶液与氢醌溶液的混合溶液，硝酸银溶液与氢醌溶液的 体积比为1:1。
[0110] 实施例1 :模拟II型糖尿病DNA样品的检测
[0111] 结合图1，图3,图4和表1说明本实施例。
[0112] 应用美国斯坦福大学布朗实验室所制定的标准方法，将固定浓度（30 μ mol/L)的 寡核苷酸探针（P1-P6)点样在基片上制备DNA微阵列芯片。通过使用PBS (PH = 7.4, 50mmol/ L磷酸缓冲液+0. 15mol/L氯化钠）和0. lmol/L乙醇胺封闭芯片。并依次与寡核苷酸靶标 T1J2J3J4J5J 6JiaJ2aJ3aJ4aJ 5a 和 T6a 的浓度分别为：0· 005nM，0· OlnM, 0· 05nM，0· InM, 0· 5ηΜ，ΙηΜ，5ηΜ，ΙΟηΜ，50ηΜ，ΙΟΟηΜ，500nM 和 IOOOnM 的混合物，Tia-T6a 在混合物中所占的百 分比分别为：〇,〇. 2,0. 5,1，2, 5,10, 20, 50, 70,90和100%，及3nM寡核苷酸修饰的金纳米粒 子（SPnOGNPs)，30°C各反应Ih。再进一步与ImL银增强溶液反应8分钟后使用共振光散射 微阵列生物芯片扫描仪进行检测。
[0113] 图3用本实施例的方法对模拟II型糖尿病6个易感基因突变位点的检测结果。如 图3所示，利用这个方法获得的DNA微阵列芯片可以对6个与II型糖尿病相关的易感基因 位点进行检测。筛选出的6个位点的寡核苷酸探针对寡核苷酸靶标检测具有高特异性。图 4为利用本实施例的方法对模拟II型糖尿病6个易感基因突变位点的等位基因频率检测结 果及对应的扫描图。图中（a)-(f)分别对应1-6个易感基因突变位点。如图4所示，利用 这一方法可以准确检测低至0. 2%的等位基因频率。
[0114] 表1为本发明方法对II型糖尿病易感基因突变位点的定量检测结果，如表1所示， 利用这一方法可以对检测模拟II型糖尿病易感基因突变位点的检出限可低至〇. 〇〇5nM。
[0115] 实施例2 : II型糖尿病的实际样品检测
[0116] 结合图1，图5和表1说明本实施例。
[0117] 收集15例II型糖尿病患者的血液，针对rsl0811661位点进行PCR扩增。应用美 国斯坦福大学布朗实验室所制定的标准方法，将固定浓度（30 μ mol/L)的寡核苷酸探针 (Pn)点样在基片上制备DNA微阵列芯片。通过使用PBS (PH = 7. 4, 50mmol/L磷酸缓冲液 +0· 15mol/L氯化钠）和0· lmol/L乙醇胺封闭芯片。并依次与不同浓度（0· 5ηΜ，1ηΜ，5ηΜ和 IOnM)的II型糖尿病患者血液的PCR产物，及3nM寡核苷酸修饰的金纳米粒子（SPnOGNPs)， 30°C各反应lh。再进一步与ImL银增强溶液反应8分钟后使用共振光散射微阵列生物芯片 扫描仪进行检测。
[0118] 图5为利用本实施例方法对15例II型糖尿病患者rsl0811661位点的风险基因进 行检测的结果。如图5所示，15例患者中有11例患者的rsl0811661位点为T/C杂合基因 型，2例患者为C/C纯合基因型，2例患者为T/T纯合基因型。
[0119] 表1为利用本发明方法对II型糖尿病易感基因突变位点的定量检测结果，如表I 所示，利用该方法对II型糖尿病实际样品的的检出限可以低至〇. 5nM。
[0120] 表1. 11型糖尿病易感基因突变位点的定量检测结果
【权利要求】
1. 一种DNA微阵列芯片检测与II型糖尿病相关的单核苷酸多态性的方法，其特征在 于，包括以下步骤： (1) 合成6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物； (2) 筛选出用于II型糖尿病6个突变位点检测的6条特定寡核苷酸探针； (3) 利用标准制作方法将所述特定寡核苷酸探针点样液点样到芯片上制备得到DNA微 阵列芯片； (4) 用所述的DNA微阵列芯片对模拟II型糖尿病的寡核苷酸靶标和II型糖尿病实际样 品进行检测，再用6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物对检测结果进行标记。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)的具体步骤如下： 6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物的合成：将6条100 y M巯基修饰的寡核苷酸以 SPi: SP2: SP3: SP4: SP5: SP6 = 1. 2:1. 2: 0? 6:1:1. 6:1. 6 的比例混合；取 5 ill 该寡核苷酸混合 溶液与300 yl 8nM的金纳米粒子混合均匀，室温静置反应10h，再加入等体积的PBS缓冲溶 液，混合均匀后反应过夜；将反应后的溶液真空离心浓缩至100 U 1，通过离心提纯反应产 物，获得6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物； 其中所述寡核苷酸序列分别为： SPi ： (T10)CTCTCTTACATA, SP2 ： (T10) ATTTAAACCTTC, SP3 ： (T10)TTCCTGGTTTCA, SP4 ： (T10) ACTTGATGCAAT, SP5 : (T1(I)ATAGACTTACTG，SP6 : (T1(I)GGCAAITAAAIT。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记 物的平均粒径为13nm。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)中所述的6个突变位点分别为： rslll96205,rslll96218, rs6585205, rsl0946398, rsl0811661, rs7903146 ； 所述的6条特定寡核苷酸探针序列分别为： p: ：ctgctcgtagttataa(t10)-nh2, P1A ：CTGCTGGTAGTTATAA(T10) -NH2, P2 ：TCGGGTGCTTATGAAA(T10)-NH2, p2A :tcgggtgtttatgaaa(t10)-nh2， p3 ：tctaagtcgtggggca(t10)-nh2, p3A :tctaagtagtggggca(t10)-nh2, p4 ：gacagcataacgatac(t10)-nh2, p4A :gacagcagaacgatac(t10)-nh2， p5 ：tcatgagaaaactaaa(t10)-nh2, p5A :tcatgggaaaactaaa(t10)-nh2， p6 ：atatagtatctaaaaa(t10)-nh2, p6A :atataatatctaaaaa(t10)-nh2。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)中所述特定寡核苷酸探针点样液 的点样浓度为30iiM。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4)中所述的模拟II型糖尿病的寡核 苷酸靶标的浓度为500nM，所述的6条寡核苷酸修饰的金纳米粒子标记物的浓度为3nM。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4)中用所述的DNA微阵列芯片对模 拟II型糖尿病的寡核苷酸靶标和II型糖尿病实际样品进行检测、及再用6条寡核苷酸修饰 的金纳米粒子标记物对检测结果进行标记的反应温度均为30°C。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4)中所述的模拟II型糖尿病的寡核 苷酸靶标序列分别为： T: ： TTATAACTACGAGCAGTATGTAAGAGAG, T1A:TTATAACTACCAGCAGTATGTAAGAGAG, T2 ： TTTCATAAGCACCCGAGAAGGTTTAAAT, T2A:TTTCATAAACACCCGAGAAGGTTTAAAT, T3 ： TGCCCCACGACTTAGATGAAACCAGGAA, T3A ： TGCCCCACTACTTAGATGAAACCAGGAA, T4 ： GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT, T4A：GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT, T5 ： TTTAGTTTTCCCATGACAGTAAGTCTAT, T5A ： TTTAGTTTTCTCATGACAGTAAGTCTAT, T6 ： TTTTTAGATACTATATAATTTAATTGCC, T6A : TTTTTAGATATTATATAATTTAATTGCC。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤⑷中所述： 用所述的DNA微阵列芯片对模拟II型糖尿病的寡核苷酸靶标进行检测时，所述模拟II 型糖尿病的寡核苷酸靶标1'1、1'2、1'3、1'4、1' 5、1'6、1^、1^、1^、1^、1^和1^的浓度分别为：0.005、 0? 01、0. 05、0. 1、0. 5、1、5、10、50、100、500 和 10001^，寡核苷酸探针？1、？2、？3、？4、？ 5、？6、卩14、 P2A、P3A、P4A、P5A和P6A的点样浓度均为30 y M ; 用所述DNA微阵列芯片对II型糖尿病实际样品进行检测时，实际样品的浓度分别为： 0? 5、1、5 和 10nM，寡核苷酸探针 Pi、P2、P3、P4、P5、P6、P 1A、P2A、P3A、P4A、P5A 和 P6A 的点样浓度均 为 30 u M。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（4)之后还包括如下步骤： 将所述DNA微阵列芯片与lmL银增强溶液反应8min ; 所述银增强溶液为硝酸银溶液与氢醌溶液的混合溶液，硝酸银溶液与氢醌溶液的体积 比为1:1。
【文档编号】C12Q1/68GK104388555SQ201410628972
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月6日 优先权日:2014年11月6日
【发明者】王振新, 李桃, 邢雪峰, 邬东阳 申请人:中国科学院长春应用化学研究所