一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法

文档序号:10506031
一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法
【专利摘要】本发明提供一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法,属于抗菌药物筛选方法技术领域。该方法先采用非接触微喷模式点样系统和紫外光照聚合反应在硅烷化的玻片表面上制作水凝胶微阵列芯片;将水凝胶微阵列芯片进行活化处理,得到含有活性基团的水凝胶基底;以含有活性基团的水凝胶基底作为载体,制备凝集素水凝胶微阵列芯片;采用凝集素水凝胶微阵列芯片固定细菌,以未经活化的聚丙烯酰胺水凝胶微阵列芯片作为药物载体,制作夹心式微阵列芯片,进行细菌培养;最后检测荧光标记的细菌,对抗菌药物进行筛选。该制备方法具有通用性,利用该方法制作的凝集素水凝胶微阵列芯片具有较好的细菌捕获能力,可以实现细菌与抗菌药物的相互作用研究。
【专利说明】
一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法
技术领域
[0001]本发明属于抗菌药物筛选方法技术领域,具体涉及一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法。
【背景技术】
[0002]金黄色葡萄球菌(St aphy I ο c ο c cu s aur eu s,S.aur eu s )属于葡萄球菌(Staphylococci),广泛分布在自然界各个环境中,可以引起食物中毒和医院或公共设施性环境感染;这种细菌也是一种最常见的人畜感染病原菌,可以引起皮肤、软组织等的局部化脓感染,甚至引起菌血症、脑膜炎、脊髓炎等严重全身感染疾病,严重危害人类的身体健康(N.Engl.J.Med.,1984,310,1368-1373;N.Engl.J.Med.,1998,339,520-532;Jama,2007,298,1763-1771 ;Science,1998,280,438-440)。为了防治细菌感染性疾病,抗菌药物常被用来抑制和杀灭病原菌,然而滥用抗菌药物导致细菌耐药性逐年增强,因此发展有效的抗菌药物筛选方法具有十分重要的意义(Chem.Rev.,2005,105 ,759-774;Science ,1992,257,1064-1073)。近年来,文献报道了许多实验方法和技术:基因组学生物信息方法、基于表现型筛选实验、酶学实验、比色/发光实验和标准平板计数法等,均被用来研究抗菌药物与细菌的相互作用以及评估相应的药物机理(J.Food Prot.,2006,69,2534-2538;Nat.Rev.Drug Discovery ,2007,6,29-40;Br.J.Pharmacol.,2007,152,1147-1154;J.Microb1l.Methods ,2008,75,478-484;Curr.0pin.Microb1l.,2009,12,497-504;Ann.N.Y.Acad.Sc1., 2010,1213,5-19 ,Cell Rep.2012,2,175-184)。尽管这些方法较为灵敏和准确,但仍然存在一些缺陷,如劳动量大、低通量、难于微型化。
[0003]微阵列芯片技术已经发展成为一种高效、安全的高通量筛选方法,能够快速并平行处理大量的样品并对其相关的大量信息进行分析检测;凝集素作为一类非酶、非抗体的糖结合蛋白,具有专一结合糖的特性,已经被用来识别检测细菌细胞;水凝胶是一类生物相容性好、易功能化的多孔聚合物材料,能够结合凝集素制备具有细菌捕获能力的凝集素水凝胶微阵列芯片;结合芯片到芯片的物质转移技术,在水凝胶微阵列芯片之间构建大量的微型培养室,可以实现细菌与抗菌药物之间的相互作用研究,该方法具有样品消耗量小、可同时检测样品量大、标准化和自动化的特点,相对于常规的筛选方法表现了更大的优越性。

【发明内容】

[0004]本发明的目的是为了解决现有的抗菌药物筛选方法劳动量大、低通量、难于微型化的问题,而提供一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法。
[0005]—种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法,包括以下步骤:
[0006]步骤一:采用非接触微喷模式点样系统和紫外光照聚合反应在硅烷化的玻片表面上制作水凝胶微阵列芯片;
[0007]步骤二:将步骤一的水凝胶微阵列芯片进行活化处理,得到含有活性基团的水凝胶基底;
[0008]步骤三:以步骤二得到的含有活性基团的水凝胶基底作为载体,制备凝集素水凝胶微阵列芯片;
[0009]步骤四:采用步骤三得到的凝集素水凝胶微阵列芯片固定细菌,以未经活化的聚丙烯酰胺水凝胶微阵列芯片作为药物载体,采用PTFE围栏粘贴工具面对面对齐两张芯片制作夹心式微阵列芯片,构建微型培养室,进行细菌培养;
[0010]步骤五:利用激光扫描共聚焦显微镜来检测荧光标记的细菌,对抗菌药物进行筛选。
[0011]优选的是,所述步骤一采用非接触微喷模式点样系统和紫外光照聚合反应在硅烷化的玻片表面上制作水凝胶微阵列芯片,具体为:先制备硅烷化的玻片并在其表面固定光引发剂,然后采用非接触微喷模式点样系统在预处理的玻片上进行点样,最后通过紫外光引发单体的聚合反应,得到水凝胶微阵列芯片。
[0012]优选的是,所述的紫外光照聚合反应的条件为:在λ= 365ηηι,光强度= 4mW/cm2下,照7min?8min。
[0013]优选的是,所述步骤二活化处理具体为:将上述水凝胶微阵列芯片放入含有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中,在25°C?37°C反应30min?Ih,得到含有活性基团的水凝胶基底。
[0014]优选的是,所述步骤三以得到的含有活性基团的水凝胶基底作为载体,制备凝集素水凝胶微阵列芯片,具体为:将凝集素溶液喷点于含有活性基团的水凝胶基底上,将点样后的芯片放在25°C?37°C,相对湿度为55 %?65 %的恒温恒湿箱中反应1h?14h,然后再加入封闭液,在25 °C?37°C下反应45min?60min,得到凝集素水凝胶微阵列芯片。
[0015]优选的是,所述的凝集素水凝胶微阵列芯片固定细菌,具体为:
[0016]将金黄色葡萄球菌培养12?16h后,在4000?5000g下离心,用磷酸盐缓冲溶液清洗,重复2?4次,每次5?Smin,之后分散在磷酸盐缓冲溶液中制成细菌悬液,将上述制备的凝集素水凝胶微阵列芯片与细菌悬液在30-37°C反应1-1.5h,完毕后用磷酸盐缓冲溶液清洗并离心甩干。
[0017]优选的是,所述的以未经活化的聚丙烯酰胺水凝胶微阵列芯片作为药物载体,具体为:
[0018]先制备硅烷化的玻片并在其表面固定光引发剂,然后采用非接触微喷模式点样系统将点样液2喷点于预处理的玻片上,最后通过紫外光引发单体的聚合反应,得到水凝胶微阵列芯片,然后再用点样液4点样一次,点样液5点样两次。
[0019]优选的是,所述的点样液2组成为:体积分数15%?20%的甘油,质量体积分数为5 %的丙烯酰胺,0.12 %双丙烯酰胺的水溶液
[0020]优选的是,所述的点样液4的组成:用已灭菌的含有体积分数为15%甘油的水溶液配制抗菌药物水溶液。
[0021 ]优选的是,所述的抗菌药物水溶液为阿莫西林、万古霉素、链霉素和氯霉素的水溶液。
[0022]本发明的有益效果
[0023]一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法,该方法先采用非接触微喷模式点样系统和紫外光照聚合反应在硅烷化的玻片表面上制作水凝胶微阵列芯片;将水凝胶微阵列芯片进行活化处理,得到含有活性基团的水凝胶基底;以含有活性基团的水凝胶基底作为载体,制备凝集素水凝胶微阵列芯片;采用凝集素水凝胶微阵列芯片固定细菌,以未经活化的聚丙烯酰胺水凝胶微阵列芯片作为药物载体,采用PTFE围栏粘贴工具面对面对齐两张芯片制作夹心式微阵列芯片,构建微型培养室,进行细菌培养;最后利用激光扫描共聚焦显微镜来检测荧光标记的细菌,对抗菌药物进行筛选。与现有技术相对比,本发明的制备方法具有通用性,方法简便,设备需求少,适宜进行大批量生产;本发明提供的夹心式微阵列芯片具有样品消耗量小、可同时检测样品量大、标准化和自动化的特点。同时,利用本发明提供的方法制作的凝集素水凝胶微阵列芯片具有较好的细菌捕获能力,可以实现细菌与抗菌药物的相互作用研究。
【附图说明】
[0024]图1是用本发明实施例1的方法所获得的麦胚凝集素微阵列芯片与不同浓度金黄色葡萄球菌溶液的识别反应曲线图;
[0025]图2是用本发明实施例2的方法所获得的夹心式微阵列芯片检测不同抗菌药物与金黄色葡萄球菌的相互作用曲线图;
[0026]图3是用本发明实施例3的方法所获得的夹心式微阵列芯片检测阿莫西林与金黄色葡萄球菌的相互作用曲线图;
[0027]图4是用本发明实施例3的方法所获得的夹心式微阵列芯片检测万古霉素与金黄色葡萄球菌的相互作用曲线图;
[0028]图5是用本发明实施例3的方法所获得的夹心式微阵列芯片检测链霉素与金黄色葡萄球菌的相互作用曲线图。
【具体实施方式】
[0029 ] 一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法,包括以下步骤:
[0030]步骤一:采用非接触微喷模式点样系统和紫外光照聚合反应在硅烷化的玻片表面上制作水凝胶微阵列芯片;
[0031]步骤二:将步骤一的水凝胶微阵列芯片进行活化处理,得到含有活性基团的水凝月父基底;
[0032]步骤三:以步骤二得到的含有活性基团的水凝胶基底作为载体,制备凝集素水凝胶微阵列芯片;
[0033]步骤四:采用步骤三得到的凝集素水凝胶微阵列芯片固定细菌,以未经活化的聚丙烯酰胺水凝胶微阵列芯片作为药物载体,采用PTFE围栏粘贴工具面对面对齐两张芯片制作夹心式微阵列芯片,构建微型培养室,进行细菌培养;
[0034]步骤五:利用激光扫描共聚焦显微镜来检测荧光标记的细菌,对抗菌药物进行筛选。
[0035]按照本发明,先制备硅烷化的玻片并在其表面固定光引发剂,然后采用非接触微喷模式点样系统在预处理的玻片上进行点样,最后通过紫外光引发单体的聚合反应,得到水凝胶微阵列芯片。
[0036]按照本发明,所述的硅烷化的玻片的制备方法,具体优选为:
[0037]选用普通玻璃基片作为基底,加入3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯和醋酸溶液到乙醇溶液中配制硅烷剂溶液,经真空干燥的玻片放入硅烷剂溶液中,室温下反应15-20min后,用乙醇清洗玻片表面三次,优选清洗时间为3min,以终止硅烷剂在玻片表面的反应和除去未反应的硅烷剂溶液,完毕后真空干燥,所述的真空干燥的温度优选为50°C,时间优选为90min,经以上处理的玻片沉浸在光引发剂溶液中,静置40-60min后进行真空干燥,所述的真空干燥的温度优选为25 0C,时间优选为60min,干燥后用乙醇和Mi 11 i_Q超纯水依次洗涤玻片三次,以除去未吸附的二苯甲酮,在氮气流下吹干。经硅烷化处理的玻片具有较强的疏水性,更利于非接触微喷模式点样系统制作液滴阵列;本发明选用3_(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯作为硅烷化试剂,第一是利用双键的共聚反应固定水凝胶;第二是增加玻片表面的疏水性,更利于非接触微喷模式的点样加工。所述的光引发剂溶液为二苯甲酮的乙醇溶液,所述的光引发剂溶液的浓度优选为lOOyg/mL;所述的3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯和醋酸溶液的体积分数分别为I %和0.3%。
[0038]按照本发明,采用非接触微喷模式点样系统将点样液I喷点于预处理的玻片上,然后通过紫外光引发单体的聚合反应,得到水凝胶微阵列芯片,最后用Mill1-Q超纯水依次洗涤三次。所述的非接触微喷模式点样系统为北京博奥生物技术有限公司提供的SmartArrayer 136生物芯片非接触微喷模式点样系统;点样液I组成优选为:体积分数15-20 %的甘油,质量体积分数为3%的丙烯酰胺,10%丙烯酸,0.12%双丙烯酰胺的水溶液。所述的紫外光照聚合反应的条优选件为:在λ = 365nm,光强度=4mff/cm2下,照7min?8min。
[0039]按照本发明,将上述水凝胶微阵列芯片放入含有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中,在25°C?37°C反应30min?Ih,完毕后依次用2_(N_吗啉)乙磺酸缓冲溶液和Mi 11 i_Q超纯水洗涤三次,离干后得到含有活性基团的水凝胶基底。所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液体积比优选为I: I。
[0040]按照本发明,将上述得到的含有活性基团的水凝胶基底作为载体,制备凝集素水凝胶微阵列芯片,具体为:用点样液3配制凝集素溶液,所述的凝集素溶液的浓度优选为lmg/mL,将凝集素溶液喷点于含有活性基团的水凝胶基底上,将点样后的芯片放在25 °C?37 0C,相对湿度为55 %?65 %的恒温恒湿箱中反应1h?14h,用缓冲溶液清洗玻片,然后再加入封闭液,在25 °C?37°C下反应45min?60min,得到凝集素水凝胶微阵列芯片。
[0041]按照本发明,上述凝集素是从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白,能够识别单糖或寡糖中特定的糖基序列并与之结合,如麦胚凝集素可以特异性识别乙酰葡萄糖胺、唾液酸和乙酰氨基半乳糖基(β-GlcNAc,sialic acid,GalNAc) 乙酰氨基葡糖是金黄色葡萄球菌细胞壁上肽聚糖的主要组成单位,因此本发明所述凝集素为麦胚凝集素。
[0042]按照本发明,上述点样液3的组成优选为:体积分数为25%?30%的甘油,pH= 8.0的含有0.15mol/L?0.2mol/L氣化纳、9mmol/L?10mmol/L单糖的9mmol/L?10mmol/L 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲溶液。
[0043]按照本发明上述清洗玻片用的缓冲溶液的组成,优选包括:含有体积浓度为0.1%吐温-20、质量分数为0.2%牛血清白蛋白、0.1511101凡氯化钠和口!1 = 8.0的501111]101凡磷酸盐缓冲溶液。
[0044]按照本发明,上述封闭液的组成,优选包括:封闭液为含有质量分数为0.4%?0.6%牛血清白蛋白、0.lmol/L?0.2mol/L乙醇胺以及0.15mol/L?0.2mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲溶液。
[0045]按照本发明,将所述的凝集素水凝胶微阵列芯片固定细菌,具体为:
[0046]将金黄色葡萄球菌培养12?16h后,在4000?5000g下离心,用磷酸盐缓冲溶液清洗,重复2?4次,每次5?Smin,之后分散在磷酸盐缓冲溶液中制成细菌悬液,将上述制备的凝集素水凝胶微阵列芯片与细菌悬液在30-37°C反应1-1.5h,完毕后用磷酸盐缓冲溶液清洗并离心甩干,得到固定细菌的水凝胶微阵列芯片。
[0047]按照本发明,所述的以未经活化的聚丙烯酰胺水凝胶微阵列芯片作为药物载体,具体优选为:
[0048]采用非接触微喷模式点样系统将点样液2喷点于预处理的玻片上,然后通过紫外光引发单体的聚合反应,得到水凝胶微阵列芯片,然后再用点样液4点样一次,点样液5点样两次,得到药物载入水凝胶微阵列芯片。所述的紫外光照聚合反应的条优选件为:在λ =365nm,光强度= 4mW/ cm2 下,照 7min ?8min。
[0049]按照本发明,所述的点样液2组成优选为:体积分数15%?20%的甘油,质量体积分数为5 %的丙烯酰胺,0.12 %双丙烯酰胺的水溶液。
[0050]按照本发明,所述的点样液4的组成优选:用已灭菌的含有体积分数为15%甘油的水溶液配制抗菌药物水溶液,点样量为150nL/点。所述的抗菌药物水溶液优选为阿莫西林、万古霉素、链霉素和氯霉素的水溶液。
[0051]按照本发明,所述的点样液5的组成优选:体积分数为10%甘油的LB培养基溶液,点样量为150nL/点。
[0052]按照本发明,将上述制备得到的固定细菌的水凝胶微阵列芯片两端贴上橡胶贴(厚度约为ΙΟΟμπι),与药物载入水凝胶微阵列芯片面对面对齐,当两玻片靠近时,LB培养基溶液与固定细菌的水凝胶点接触,在两个对齐的水凝胶点之间形成一段液体柱;将制作好的微型反应装置放入已灭菌的培养皿中,在37°C培养24h;培养结束后去除药物载入的水凝胶微阵列芯片,清洗离干固定细菌的水凝胶微阵列芯片。芯片对齐工具优选为北京博奥生物技术有限公司生产的PTFE围栏粘贴工具,操作简便。
[0053]按照本发明,用磷酸盐缓冲溶液配制SYTO60水溶液,所述的水溶液的浓度优选为Ο.ΟΙμΜ,然后和上述清洗离干固定细菌的水凝胶微阵列芯片在37°C孵育75min后,清洗离干芯片后,用蔡司激光扫描共聚焦显微镜来成像;所述的步骤五中激光扫描共聚焦显微镜为德国生产的TCS Sp2型激光扫描共聚焦显微镜。
[0054]实验中所讨论的细菌计数和细菌在水凝胶表面所占的面积百分数均用ImageJ进行处理获得。为了研究抗菌药物的活性,本发明采用微量稀释方法进行检测,其响应曲线是细菌生长变化响应与给药量的非线性关系。细菌生长的响应变化通过每个水凝胶点表面的荧光标记细菌的红色荧光面积百分数进行测试。细菌的面积百分数的计算公式如下:
[0055]金黄色葡萄球菌的面积百分数=(红色荧光所占的面积/水凝胶的表面积)X100%
[0056]将每个水凝胶点的面积百分数正规于没有药物作用的水凝胶点的面积百分数后,对测试的药物浓度作图,从而获得相应的最低抑菌浓度。最低抑菌浓度(MIC)是衡量抗菌药物抗菌活性大小的一个重要指标,即可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度。
[0057]实施例1.麦胚凝集素水凝胶微阵列芯片对金黄色葡萄球菌的捕捉能力
[0058]I)玻片表面的预处理
[0059]选用普通玻璃基片作为基底,加入0.5mL 3_(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯和1.5mL体积分数为10%的醋酸溶液到50mL乙醇溶液中配制硅烷剂溶液,经真空干燥的玻片放入50mL硅烷剂溶液中,室温下反应20min后,用30mL乙醇清洗玻片表面三次,时间为3min,以终止硅烷剂在玻片表面的反应和除去未反应的硅烷剂溶液,完毕后50°C真空干燥90min;经以上处理的玻片沉浸在浓度为100yg/mL二苯甲酮的乙醇溶液中,静置40min后放入25°C真空干燥Ih;干燥后用30mL乙醇和30mL Mill1-Q超纯水依次洗涤玻片三次,以除去未吸附的二苯甲酮,在氮气流下吹干。
[0060]2)水凝胶微阵列芯片的制备
[0061]选用步骤I)预处理的玻片和北京博奥生物技术有限公司提供的Smart Arrayer136生物芯片非接触微喷模式点样系统制作水凝胶微阵列芯片;选用的点样液I组成为:体积分数15%的甘油,质量体积分数为3%的丙烯酰胺,10%丙烯酸,0.12%双丙烯酰胺的水溶液;点样后直接用紫外光(λ = 365nm,光强度=4mff/cm2)照8min;紫外光照聚合后,用30mLMi 11 i_Q超纯水依次洗涤三次。
[0062]3)水凝胶微阵列芯片的活化
[0063]选用pH=5.7的含有50mM 1-乙基_(3_二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和50mMN-羟基硫代琥珀酰亚胺的10mM 2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液活化步骤2)点样液I制备的水凝胶微阵列芯片,在25°C反应lh,完毕后依次用30mL 2_(N_吗啉)乙磺酸缓冲溶液和30mLMi 11 1-Q超纯水洗涤三次,离干后将活化的水凝胶微阵列芯片保存于4°C下备用。
[0064]4)麦胚凝集素水凝胶微阵列芯片的制备
[0065]选用步骤3)活化的水凝胶微阵列芯片和由北京博奥生物技术有限公司提供的SMartArrayer 136芯片制作系统制作并处理凝集素水凝胶微阵列芯片。将浓度为lmg/mL的麦胚凝集素喷点于步骤3)活化的水凝胶微阵列芯片上,为获得较好的阵列点并保持生物分子的活性,所述的点样液3组成为:体积分数为25%的甘油,pH=8.0的含有0.15mol/L氯化钠、I Ommo I /L单糖的I Ommo I/I 4- (2-羟乙基)-1 -哌嗪乙磺酸缓冲溶液。将点样好的芯片放入25°C,相对湿度为55%的恒温恒湿箱中,反应12h。然后用含有体积浓度为0.1 %吐温-20、质量分数为0.2%牛血清白蛋白、0.15mol/L氯化钠和pH = 8.0的50mmol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤玻片,再用含有质量分数为0.5%牛血清白蛋白、0.1moI/L乙醇胺以及0.15mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲溶液,25°C下反应45min,封闭芯片得到麦胚凝集素水凝胶微阵列芯片。
[0066]5)麦胚凝集素水凝胶微阵列芯片与不同浓度细菌溶液的识别反应
[0067]金黄色葡萄球菌培养12h后,在4000g下离心,用磷酸盐缓冲溶液清洗,重复2次,每次5min,之后分散在磷酸盐缓冲溶液中制成浓度为109、108、107、106、15ceIlsAiL的细菌悬液。选用步骤4)制备的凝集素水凝胶微阵列芯片与不同浓度的细菌溶液在30°C反应lh,完毕后用磷酸盐缓冲溶液清洗并离心甩干。
[0068]6)荧光检测固定细菌的水凝胶微阵列芯片
[0069]用磷酸盐缓冲溶液配制Ο.ΟΙμΜ SYTO 60水溶液(SYT0 60红色荧光核酸染料)和步骤5)键合金黄色葡萄球菌的凝集素水凝胶微阵列芯片在37°C孵育75min后,清洗离干芯片后,用蔡司激光扫描共聚焦显微镜来成像;实验中所讨论的细菌计数和细菌在水凝胶表面所占的面积百分数均用Image J进行处理获得。
[0070]图1是用本发明实施例1的方法所获得的麦胚凝集素微阵列芯片与不同浓度金黄色葡萄球菌溶液的识别反应曲线图,金黄色葡萄球菌的浓度分别为:a、15,b、16,c、17,d、108,e、109cells/mL。图1说明:金黄色葡萄球菌在麦胚凝集素水凝胶点的固定数量随着细菌溶液浓度的增大而增多,当细菌溶液浓度为106cells/mL时,麦胚凝集素水凝胶表面的细菌较少,其捕捉细菌存在较宽的范围16?109cellS/mL。
[0071]实施例2.基于水凝胶的夹心式微阵列芯片检测金黄色葡萄球菌和抗菌药物的相互作用
[0072]I)玻片表面的预处理
[0073]选用普通玻璃基片作为基底,加入0.5mL 3_(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯和1.5mL体积分数为10%的醋酸溶液到50mL乙醇溶液中配制硅烷剂溶液,经真空干燥的玻片放入50mL硅烷剂溶液中,室温下反应20min后,用30mL乙醇清洗玻片表面三次,时间为3min,以终止硅烷剂在玻片表面的反应和除去未反应的硅烷剂溶液,完毕后50°C真空干燥90min;经以上处理的玻片沉浸在浓度为100yg/mL二苯甲酮的乙醇溶液中,静置40min后放入25°C真空干燥lh;干燥后用30mL乙醇和30mL Mill1-Q超纯水依次洗涤玻片三次,以除去未吸附的二苯甲酮,在氮气流下吹干。
[0074]2)水凝胶微阵列芯片的制备
[0075]选用步骤I)预处理的玻片和北京博奥生物技术有限公司提供的Smart Arrayer136生物芯片非接触微喷模式点样系统制作水凝胶微阵列芯片;选用的点样液I组成为:体积分数15%的甘油,质量体积分数为3%的丙烯酰胺,10%丙烯酸,0.12%双丙烯酰胺的水溶液;选用的点样液2组成为:体积分数15%的甘油,质量体积分数为5%的丙烯酰胺,0.12 %双丙烯酰胺的水溶液;点样后直接用紫外光(λ = 365nm,光强度=4mff/cm2)照8min;紫外光照聚合后,用30mL Mi 11 1-Q超纯水依次洗涤三次。
[0076]3)水凝胶微阵列芯片的活化
[0077]选用pH=5.7的含有50mM 1-乙基_(3_二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和50mMN-羟基硫代琥珀酰亚胺的10mM 2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液活化步骤2)点样液I制备的水凝胶微阵列芯片,在25°C反应lh,完毕后依次用30mL 2_(N_吗啉)乙磺酸缓冲溶液和30mLMi 11 1-Q超纯水洗涤三次,离干后将活化的水凝胶微阵列芯片保存于4°C下备用。
[0078]4)麦胚凝集素水凝胶微阵列芯片的制备
[0079]选用步骤3)活化的水凝胶微阵列芯片和由北京博奥生物技术有限公司提供的SMartArrayer 136芯片制作系统制作并处理凝集素水凝胶微阵列芯片。将浓度为lmg/mL的麦胚凝集素喷点于步骤3)活化的水凝胶微阵列芯片上,为获得较好的阵列点并保持生物分子的活性,所述的点样液3组成为:体积分数为25%的甘油,pH=8.0的含有0.15mol/L氯化钠、I Ommo I /L单糖的I Ommo I/I 4- (2-羟乙基)-1 -哌嗪乙磺酸缓冲溶液。将点样好的芯片放入37°C,相对湿度为55%的恒温恒湿箱中,反应12h。然后用含有体积浓度为0.1 %吐温-20、质量分数为0.2%牛血清白蛋白、0.15mol/L氯化钠和pH = 8.0的50mmol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤玻片,再用含有质量分数为0.5%牛血清白蛋白、0.1moI/L乙醇胺以及0.15mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲溶液,37°C下反应45min,封闭芯片得到麦胚凝集素水凝胶微阵列芯片。
[0080]5)麦胚凝集素水凝胶微阵列芯片与细菌的识别反应
[0081]金黄色葡萄球菌培养16h后,在5000g下离心,用磷酸盐缓冲溶液清洗,重复3次,每次5min,之后分散在磷酸盐缓冲溶液中制成浓度为16ceIlsAiL的细菌悬液。选用步骤4)制备的麦胚凝集素水凝胶微阵列芯片与细菌溶液在30°C反应lh,完毕后用磷酸盐缓冲溶液清洗并离心甩干。
[0082]6)药物载入水凝胶微阵列芯片的制备
[0083]选用步骤2)点样液2制备的水凝胶微阵列芯片和由北京博奥生物技术有限公司提供的SMartArrayer 136芯片制作系统制作药物载入水凝胶微阵列芯片,点样量为150nL/点。点样液4的组成:用已灭菌的含有体积分数为15%甘油的水溶液配制3.3yg/ml阿莫西林、万古霉素、链霉素和氯霉素的水溶液;点样液5的组成:体积分数为10 %甘油的LB培养基溶液,点样量为150nL/点,重复点样两次。
[0084]7)夹心式水凝胶微阵列芯片的制备
[0085]将步骤5)制作的固定细菌的水凝胶微阵列芯片两端贴上橡胶贴(厚度约为100μm),与步骤6)制作的药物载入水凝胶微阵列芯片面对面对齐,当两玻片靠近时,LB培养基溶液与固定细菌的水凝胶点接触,在两个对齐的水凝胶点之间形成一段液体柱;将制作好的微型反应装置放入已灭菌的培养皿中,在37°C培养24h;培养结束后去除药物载入的水凝胶微阵列芯片,清洗离干固定细菌的水凝胶微阵列芯片。
[0086]8)荧光检测固定细菌的水凝胶微阵列芯片
[0087]用磷酸盐缓冲溶液配制Ο.ΟΙμΜSYTO 60水溶液和步骤7)固定细菌的水凝胶微阵列芯片在37°C孵育75min后,清洗离干芯片后,用蔡司激光扫描共聚焦显微镜来成像;实验中所讨论的细菌在水凝胶表面所占的面积百分数均用Image J进行处理获得。
[0088]图2是用本发明实施例2的方法所获得的夹心式微阵列芯片检测不同抗菌药物与金黄色葡萄球菌的相互作用曲线图:a组、阿莫西林与金黄色葡萄球菌相互作用的3个重复实验,b组、万古霉素与金黄色葡萄球菌相互作用的3个重复实验,c组、链霉素与金黄色葡萄球菌相互作用的3个重复实验,d组、氯霉素与金黄色葡萄球菌相互作用的3个重复实验和e组、无抗菌药物存在下培养金黄色葡萄球菌的3个重复的空白实验。图2说明:与正常条件的金黄色葡萄球菌生长情况(空白)相比,与抗菌药物共培养的细菌生长活性明显被抑制,而且金黄色葡萄球菌与不同的抗菌药物共培养后,凝胶表面捕捉的细菌量明显不同,表明不同抗菌药物对细菌活性产生了不同程度的抑制效果:阿莫西林》万古霉素>链霉素>氯霉素。
[0089]实施例3.检测不同抗菌药物对金黄色葡萄球菌的抑菌效率
[0090]I)玻片表面的预处理
[0091]选用普通玻璃基片作为基底,加入0.5mL 3_(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯和1.5mL体积分数为10%的醋酸溶液到50mL乙醇溶液中配制硅烷剂溶液,经真空干燥的玻片放入50mL硅烷剂溶液中,室温下反应20min后,用30mL乙醇清洗玻片表面三次,时间为3min,以终止硅烷剂在玻片表面的反应和除去未反应的硅烷剂溶液,完毕后50°C真空干燥90min;经以上处理的玻片沉浸在浓度为100yg/mL二苯甲酮的乙醇溶液中,静置40min后放入25°C真空干燥lh;干燥后用30mL乙醇和30mL Mill1-Q超纯水依次洗涤玻片三次,以除去未吸附的二苯甲酮,在氮气流下吹干。
[0092]2)水凝胶微阵列芯片的制备
[0093]选用步骤I)预处理的玻片和北京博奥生物技术有限公司提供的Smart Arrayer136生物芯片非接触微喷模式点样系统制作水凝胶微阵列芯片;选用的点样液I组成为:体积分数15%的甘油,质量体积分数为3%的丙烯酰胺,10%丙烯酸,0.12%双丙烯酰胺的水溶液;选用的点样液2组成为:体积分数15%的甘油,质量体积分数为5%的丙烯酰胺,
0.12 %双丙烯酰胺的水溶液;点样后直接用紫外光(λ = 365nm,光强度=4mff/cm2)照8min;紫外光照聚合后,用30mL MiII1-Q超纯水依次洗涤三次。
[0094]3)水凝胶微阵列芯片的活化
[0095]选用pH=5.7的含有50mM 1-乙基_(3_二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和50mMN-羟基硫代琥珀酰亚胺的10mM 2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液活化步骤2)点样液I制备的水凝胶微阵列芯片,在25°C反应lh,完毕后依次用30mL 2_(N_吗啉)乙磺酸缓冲溶液和30mLMi 11 1-Q超纯水洗涤三次,离干后将活化的水凝胶微阵列芯片保存于4°C下备用。
[0096]4)麦胚凝集素水凝胶微阵列芯片的制备
[0097]选用步骤3)活化的水凝胶微阵列芯片和由北京博奥生物技术有限公司提供的SMartArrayer 136芯片制作系统制作并处理凝集素水凝胶微阵列芯片。将浓度为lmg/mL的麦胚凝集素喷点于步骤3)活化的水凝胶微阵列芯片上,为获得较好的阵列点并保持生物分子的活性,所述的点样液3组成为:体积分数为25%的甘油,pH=8.0的含有0.15mol/L氯化钠、I Ommo I /L单糖的I Ommo I/I 4- (2-羟乙基)-1 -哌嗪乙磺酸缓冲溶液。将点样好的芯片放入37°C,相对湿度为55%的恒温恒湿箱中,反应12h。然后用含有体积浓度为0.1 %吐温-20、质量分数为0.2%牛血清白蛋白、0.15mol/L氯化钠和pH = 8.0的50mmol/L磷酸盐缓冲溶液洗涤玻片,再用含有质量分数为0.5%牛血清白蛋白、0.1moI/L乙醇胺以及0.15mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲溶液,37°C下反应45min,封闭芯片得到麦胚凝集素水凝胶微阵列芯片。
[0098]5)麦胚凝集素水凝胶微阵列芯片与细菌的识别反应
[0099]金黄色葡萄球菌培养16h后,在5000g下离心,用磷酸盐缓冲溶液清洗,重复3次,每次5min,之后分散在磷酸盐缓冲溶液中制成浓度为16ceIlsAiL的细菌悬液。选用步骤4)制备的麦胚凝集素水凝胶微阵列芯片与细菌溶液在30°C反应lh,完毕后用磷酸盐缓冲溶液清洗并离心甩干。
[0100]6)药物载入水凝胶微阵列芯片的制备
[0101]选用步骤2)点样液2制备的水凝胶微阵列芯片和由北京博奥生物技术有限公司提供的SMartArrayer 136芯片制作系统制作药物载入水凝胶微阵列芯片,点样量为150nL/点。点样液4的组成:用已灭菌的含有体积分数为15%甘油的水溶液配制不同浓度阿莫西林(1.67ng/ml、3.33ng/ml、16.67ng/ml、33.33ng/ml、0.17yg/mL、0.33yg/mL、0.83yg/mL、1.67yg/mL、3.33yg/mL、8.33yg/mL)、万古霉素(3.33ng/ml、16.67ng/ml、33.33ng/ml、0.17yg/mL、0.33yg/mL、0.83yg/mL、1.67yg/mL、3.33yg/mL、8.33yg/mL、16.67yg/mL、33.33yg/mL)和链霉素(0.03yg/mL、0.17yg/mL、0.33yg/mL、1.67yg/mL、3.33yg/mL、6.67yg/mL、10.0Oyg/mL、13.33yg/mL、16.67yg/mL、33.33yg/mL)的水溶液;点样液5的组成:体积分数为10 %甘油的LB培养基溶液,点样量为150nL/点,重复点样两次。
[0102]7)夹心式水凝胶微阵列芯片的制备
[0103]将步骤5)制作的固定细菌的水凝胶微阵列芯片两端贴上橡胶贴(厚度约为100μm),与步骤6)制作的药物载入水凝胶微阵列芯片面对面对齐,当两玻片靠近时,LB培养基溶液与固定细菌的水凝胶点接触,在两个对齐的水凝胶点之间形成一段液体柱;将制作好的微型反应装置放入已灭菌的培养皿中,在37°C培养24h;培养结束后去除药物载入的水凝胶微阵列芯片,清洗离干固定细菌的水凝胶微阵列芯片。
[0104]8)荧光检测固定细菌的水凝胶微阵列芯片
[0105]用磷酸盐缓冲溶液配制Ο.ΟΙμΜSYTO 60水溶液和步骤7)固定细菌的水凝胶微阵列芯片在37°C孵育75min后,清洗离干芯片后,用蔡司激光扫描共聚焦显微镜来成像;实验中所讨论的细菌在水凝胶表面所占的面积百分数均用Image J进行处理获得。
[0106]图3是用本发明实施例3的方法所获得的夹心式微阵列芯片检测阿莫西林与金黄色葡萄球菌的相互作用曲线图,其中图a:不同浓度的阿莫西林与金黄色葡萄球菌相互作用的焚光图,从左到右依次为:1.67ng/ml、3.33ng/ml、16.67ng/ml、33.33ng/ml、0.17yg/mL、0.33yg/mL、0.83yg/mL、l.67yg/mL、3.33yg/mL、8.33yg/mL阿莫西林与金黄色葡萄球菌相互作用的3个重复实验;图b为相应的MIC曲线图。
[0107]图4是用本发明实施例3的方法所获得的夹心式微阵列芯片检测万古霉素与金黄色葡萄球菌的相互作用曲线图:其中图a:不同浓度的万古霉素与金黄色葡萄球菌相互作用的焚光图,从左到右依次为:3.33ng/ml、16.67ng/ml、33.33ng/ml、0.17yg/mL、0.33yg/mL、
0.83yg/mL、1.67yg/mL、3.33yg/mL、8.33yg/mL、16.67yg/mL万古霉素与金黄色葡萄球菌相互作用的3个重复实验;图b:相应的MIC曲线图。
[0108]图5是用本发明实施例3的方法所获得的夹心式微阵列芯片检测链霉素与金黄色葡萄球菌的相互作用曲线图:其中图a:不同浓度的链霉素与金黄色葡萄球菌相互作用的荧光图,从左到右依次为:0.03yg/mL、0.17yg/mL、0.33yg/mL、I.67yg/mL、3.33yg/mL、6.67yg/mL、10.00yg/mL、13.33yg/mL、16.67yg/mL、33.33yg/mL 链霉素与金黄色葡萄球菌相互作用的3个重复实验;图b:相应的MIC曲线图。
[0109]图3-5表明,随着抗菌药物的浓度不断增加,相应的金黄色葡萄球菌的正规化面积百分数逐渐减小,这说明该方法构建的夹心式微阵列芯片能够用于有效检测抗菌药物对金黄色葡萄球菌生长的抑制效果。根据不同浓度抗菌药物抑制金黄色葡萄球菌生长的曲线分析,获得阿莫西林、万古霉素、链霉素的最小抑菌浓度分别为1.7yg/mL、3.3yg/mUP10.3yg/mLo
【主权项】
1.一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法,其特征在于,包括以下步骤: 步骤一:采用非接触微喷模式点样系统和紫外光照聚合反应在硅烷化的玻片表面上制作水凝胶微阵列芯片; 步骤二:将步骤一的水凝胶微阵列芯片进行活化处理,得到含有活性基团的水凝胶基底; 步骤三:以步骤二得到的含有活性基团的水凝胶基底作为载体,制备凝集素水凝胶微阵列芯片; 步骤四:采用步骤三得到的凝集素水凝胶微阵列芯片固定细菌,以未经活化的聚丙烯酰胺水凝胶微阵列芯片作为药物载体,采用PTFE围栏粘贴工具面对面对齐两张芯片制作夹心式微阵列芯片,构建微型培养室,进行细菌培养; 步骤五:利用激光扫描共聚焦显微镜来检测荧光标记的细菌,对抗菌药物进行筛选。2.根据权利要求1所述的一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法,其特征在于,所述步骤一采用非接触微喷模式点样系统和紫外光照聚合反应在硅烷化的玻片表面上制作水凝胶微阵列芯片,具体为:先制备硅烷化的玻片并在其表面固定光引发剂,然后采用非接触微喷模式点样系统在预处理的玻片上进行点样,最后通过紫外光引发单体的聚合反应,得到水凝胶微阵列芯片。3.根据权利要求1所述的一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法,其特征在于,所述的紫外光照聚合反应的条件为:在X = 365nm,光强度= 4mW/cm2下,照7min?8min04.根据权利要求1所述的一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法,其特征在于,所述步骤二活化处理具体为:将上述水凝胶微阵列芯片放入含有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中,在25 °C?37 °C反应30min?Ih,得到含有活性基团的水凝胶基底。5.根据权利要求1所述的一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法,其特征在于,所述步骤三以得到的含有活性基团的水凝胶基底作为载体,制备凝集素水凝胶微阵列芯片,具体为:将凝集素溶液喷点于含有活性基团的水凝胶基底上,将点样后的芯片放在25 0C?37 °C,相对湿度为55 %?65 %的恒温恒湿箱中反应1h?14h,然后再加入封闭液,在25 0C?37°C下反应45min?60min,得到凝集素水凝胶微阵列芯片。6.根据权利要求1所述的一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法,其特征在于,所述的凝集素水凝胶微阵列芯片固定细菌,具体为: 将金黄色葡萄球菌培养12?16h后,在4000?5000g下离心,用磷酸盐缓冲溶液清洗,重复2?4次,每次5?8min,之后分散在磷酸盐缓冲溶液中制成细菌悬液,将上述制备的凝集素水凝胶微阵列芯片与细菌悬液在30-37°C反应1-1.5h,完毕后用磷酸盐缓冲溶液清洗并离心甩干。7.根据权利要求1所述的一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法,其特征在于,所述的以未经活化的聚丙烯酰胺水凝胶微阵列芯片作为药物载体,具体为: 先制备硅烷化的玻片并在其表面固定光引发剂,然后采用非接触微喷模式点样系统将点样液2喷点于预处理的玻片上,最后通过紫外光引发单体的聚合反应,得到水凝胶微阵列芯片,然后再用点样液4点样一次,点样液5点样两次。8.根据权利要求7所述的一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法,其特征在于,所述的点样液2组成为:体积分数15%?20%的甘油,质量体积分数为5%的丙烯酰胺,0.12%双丙烯酰胺的水溶液。9.根据权利要求7所述的一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法,其特征在于,所述的点样液4的组成:用已灭菌的含有体积分数为15%甘油的水溶液配制抗菌药物水溶液;点样液5的组成:体积分数为10 %甘油的LB培养基溶液,点样量为150nL/点。10.根据权利要求7所述的一种基于水凝胶微阵列芯片的抗菌药物筛选方法,其特征在于,所述的抗菌药物水溶液为阿莫西林、万古霉素、链霉素和氯霉素的水溶液。
【文档编号】C12Q1/18GK105861626SQ201610178568
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月25日
【发明人】王振新, 刘霞
【申请人】中国科学院长春应用化学研究所
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