用于修复胰腺组织的胰腺基质水凝胶的制备方法和用途与流程

本发明属于组织工程与再生医学技术领域，具体涉及一种具有促再生功能的猪组织来源的用于修复胰腺组织的胰腺基质水凝胶的制备方法和用途。

背景技术：

重症急性胰腺炎(severeacutepancreatitis，sap)病情凶险、进展快、并发症多，病死率高达30％。该病是由各种致病因素引起的胰腺腺泡损伤，触发活性胰酶释放入血，激活巨噬细胞和中性粒细胞而释放大量炎性因子，导致全身性炎症反应与代偿性抗炎反应的失衡，其中巨噬细胞浸润与激活在sap发生、发展和演进过程中扮演着至关重要的角色。业已证实，巨噬细胞具有高度可塑性，可依赖局部微环境刺激产生促炎性巨噬细胞或抗炎性巨噬细胞。目前已有研究采用药物调控巨噬细胞的功能，然而其治疗大多是全身给药，药物副作用大，临床可操作性差。因此，寻找一种安全、有效、简便的调控巨噬细胞功能策略，恢复受损的胰腺功能，已成为临床上亟需解决的问题。

生物材料可调控巨噬细胞的命运，研究证实支架材料的特性如形貌、弹性、孔隙度等均可影响巨噬细胞的表型。因此，研发具有促再生功能的材料已成为当今生物材料发展的重要趋势。在这方面，来源于天然组织/器官的胞外基质(ecm)生物材料，鉴于其具有最接近天然的组织结构、丰富的生物活性成分、组织特异的微环境以及低免疫原性等优点，已成为组织再生领域有应用前景的生物材料。特别是其水凝胶形式，可通过微创注射的方法递送到组织损伤部位，具有微创、安全、可控性强等优点大大增强了其在临床上的应用潜力。然而，目前尚无关于胰腺基质水凝胶制备及其用于胰腺再生的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决以上现有技术中存在的技术问题的至少一项，本发明提供一种解决现有胰腺组织工程材料在组分、结构和力学弹性方面的不足，提供可适宜胰腺细胞生长的天然微环境，以期达到促进重症胰腺炎胰腺组织的内源性修复的用于修复胰腺组织的胰腺基质水凝胶的制备方法和用途。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

猪胰腺基质水凝胶在制备促进胰腺修复的药物中的用途。

进一步地，猪胰腺基质水凝胶在制备治疗坏死性胰腺炎的药物中的用途。

进一步地，所述药物为注射剂。

发明人通过将猪的胰腺组织制成猪胰腺基质水凝胶，并将该物质通过注射的方式注入成功造模的实验用sd大鼠的胰腺位置，24小时后，取材观察其对胰腺损伤的修复情况表明，胰腺腺泡细胞坏死和炎症细胞浸润显著减少，组织病理学评分也表明，ecm组与sap相比评分明显降低。从而，证实本发明对于胰腺损伤和胰腺炎症等病症具有较好的改善效果。

进一步地，所述注射剂为含有猪脱细胞胰腺组织的盐酸-胃蛋白酶溶液。

进一步地，每毫升盐酸-胃蛋白酶溶液中含有猪脱细胞胰腺组织8mg。

进一步地，所述含有猪脱细胞胰腺组织的盐酸-胃蛋白酶溶液的ph值为7.4。

一种用于修复胰腺组织的胰腺基质水凝胶的制备方法，包括步骤：

b.猪胰腺基质水凝胶的制备：

将脱细胞胰腺组织冷冻干燥后做成粉末，然后按比例与盐酸-胃蛋白酶溶液混合，调节ph值至生理状态，即得猪胰腺基质水凝胶。

进一步地，所述的用于修复胰腺组织的胰腺基质水凝胶的制备方法，还包括步骤：

a.胰腺的脱细胞化：

(1)将胰腺组织切成薄片，并用生理盐水漂洗，得到胰腺组织薄片；

(2)将所述胰腺组织薄片浸于含有十二烷基硫酸钠的生理盐水溶液中搅拌，得到胰腺组织；

(3)将所述胰腺组织浸于tritonx-100溶液中搅拌至所述胰腺组织透明后，用生理盐水漂洗后得到脱细胞胰腺组织。

进一步地，所述步骤b中采用浓度为0.1mol/l氢氧化钠溶液和10xpbs调节ph值至7.4；所述脱细胞胰腺组织与盐酸-胃蛋白酶溶液的比例关系为：在调节ph值之前，每毫升盐酸-胃蛋白酶溶液中含有脱细胞胰腺组织的量为10mg；在调节ph值之后，每毫升盐酸-胃蛋白酶溶液中含有脱细胞胰腺组织的量为8mg。

进一步地，所述盐酸-胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶的质量占所述盐酸-胃蛋白酶溶液总重的1％，所述盐酸-胃蛋白酶溶液中盐酸的浓度为0.1mol/l；所述含有十二烷基硫酸钠的生理盐水溶液中十二烷基硫酸钠的重量占含有十二烷基硫酸钠的生理盐水溶液总重的0.5％；所述tritonx-100溶液中tritonx-100的重量百分数为1％。

本发明相对于现有技术的有益效果是：本发明的胰腺基质水凝胶不但具有温敏性、低免疫原性及能提供最天然的细胞外微环境等优点，而且操作工艺简单、实施条件温和，为胰腺组织工程提供了一种新型水凝胶材料。该材料适宜于胰腺细胞的生长，可调控巨噬细胞向抗炎性m2型极化，进而促进重症胰腺炎胰腺组织的内源性修复，因此有望发展为一种用于治疗重症急性胰腺炎药物用途的产品，这对改进重症急性胰腺炎的临床治疗具有重要意义。

附图说明

图1he染色观察脱细胞化的胰腺组织切片的脱细胞胰腺基质图像。

图2免疫荧光染色观察细胞外i型胶原保留情况图像。

图3免疫荧光染色观察细胞外iv型胶原保留情况图像。

图4免疫荧光染色观察细胞外层粘连蛋白保留情况图像。

图5免疫荧光染色观察细胞外纤连蛋白保留情况图像。

图6本发明的猪胰腺基质水凝胶在常温下的状态示意图。

图7本发明的猪胰腺基质水凝胶在37℃下的状态示意图。

图8he染色观察本发明的猪胰腺胞外基质(ecm)水凝胶与皮下组织的生物相容性图像。

图9用sd大鼠建立sap模型后其胰腺图像。

图10扫描电镜下观察本发明的猪胰腺基质水凝胶图像。

图11sap组胰腺组织he染色图像。

图12猪胰腺基质水凝胶注射组胰腺组织he染色图像。

图13sap组免疫荧光染色观察胰腺巨噬细胞m2型(cd68+/cd206+)极化情况图。

图14ecm组免疫荧光染色观察胰腺巨噬细胞m2型(cd68+/cd206+)极化情况图。

图15sham组、sap组和ecm组的大鼠胰腺体重比(pancreas/bodyweight)对比示意图。

图16sham组、sap组和ecm组的淀粉酶(amylase)对比示意图。

图17sham组、sap组和ecm组的脂肪酶(lipase)对比示意图。

图18sham组、sap组和ecm组的髓过氧化物酶(myeloperoxidase，mpo)对比示意图。

其中，上述图中的sham组，sap组，ecm组分别表示：假手术组、重症急性胰腺炎组、ecm水凝胶注射组；

其中，图15-图18中的*表示p<0.05，#表示p<0.01，p为统计学显著性指标。

具体实施方式

以下通过附图结合实施例来描述说明但不限制本发明。以下结合实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，应当说明的是，以下仅是本发明的优选实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些应当都属于本发明的保护范围。

0.5％十二烷基硫酸钠/生理盐水指的是十二烷基硫酸钠的重量占含有十二烷基硫酸钠的生理盐水溶液总重的0.5％。

猪胰腺基质水凝胶在制备促进胰腺内源性修复的药物中的用途。

进一步地，猪胰腺基质水凝胶在制备治疗坏死性胰腺炎的药物中的用途。

进一步地，所述药物为注射剂。

发明人通过将猪的胰腺组织制成猪胰腺基质水凝胶，并将该物质通过注射的方式注入成功造模的实验用sd大鼠的胰腺位置，24小时后，取材观察其对胰腺损伤的修复情况表明，胰腺腺泡细胞坏死和炎症细胞浸润显著减少，组织病理学评分也表明，ecm组与sap相比评分明显降低。从而，证实本发明对于胰腺损伤和胰腺炎症等病症具有较好的改善效果。

进一步地，所述注射剂为含有猪脱细胞胰腺组织的盐酸-胃蛋白酶溶液。

进一步地，每毫升盐酸-胃蛋白酶溶液中含有猪脱细胞胰腺组织8mg。

进一步地，所述含有猪脱细胞胰腺组织的盐酸-胃蛋白酶溶液的ph值为7.4。

一种用于修复胰腺组织的胰腺基质水凝胶的制备方法，包括步骤：

b.猪胰腺基质水凝胶的制备：

将脱细胞胰腺组织冷冻干燥后做成粉末，然后按比例与盐酸-胃蛋白酶溶液混合，调节ph值至生理状态，即得猪胰腺基质水凝胶。

进一步地，所述的用于修复胰腺组织的胰腺基质水凝胶的制备方法，还包括步骤：

a.胰腺的脱细胞化：

(1)将胰腺组织切成薄片，并用生理盐水漂洗，得到胰腺组织薄片；

(2)将所述胰腺组织薄片浸于含有十二烷基硫酸钠的生理盐水溶液中搅拌，得到胰腺组织；

(3)将所述胰腺组织浸于tritonx-100溶液中搅拌至所述胰腺组织透明后，用生理盐水漂洗后得到脱细胞胰腺组织。

进一步地，所述步骤b中采用浓度为0.1mol/l氢氧化钠溶液和10xpbs调节ph值至7.4；所述脱细胞胰腺组织与盐酸-胃蛋白酶溶液的比例关系为：在调节ph值之前，每毫升盐酸-胃蛋白酶溶液中含有脱细胞胰腺组织的量为10mg；在调节ph值之后，每毫升盐酸-胃蛋白酶溶液中含有脱细胞胰腺组织的量为8mg。

进一步地，所述盐酸-胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶的质量占所述盐酸-胃蛋白酶溶液总重的1％，所述盐酸-胃蛋白酶溶液中盐酸的浓度为0.1mol/l；所述含有十二烷基硫酸钠的生理盐水溶液中十二烷基硫酸钠的重量占含有十二烷基硫酸钠的生理盐水溶液总重的0.5％；所述tritonx-100溶液中tritonx-100的重量百分数为1％。

实施例1猪胰腺基质水凝胶的制备

具体步骤如下:

(1)猪胰腺的脱细胞化:首先将猪胰腺组织切为约2毫米厚的薄片并用生理盐水漂洗，然后将其浸没于0.5％十二烷基硫酸钠/生理盐水中，室温搅拌24小时；最后将其转移于1％tritonx-100溶液，室温搅拌直至组织透明，约需1小时，并用生理盐水漂洗3-5次，每次15分钟，去除残余的洗涤剂。

(2)猪胰腺基质水凝胶的制备:将低温冻干的脱细胞胰腺组织，用粉碎机磨成粉末，然后按照10mg/ml比例加入盐酸-胃蛋白酶溶液中，室温缓慢搅拌至溶解状态，通过加入0.1m氢氧化钠和10xpbs调至生理状态(ph＝7.4)，使水凝胶终浓度为8mg/ml，置于37℃下数分钟即可成胶。

猪胰腺基质水凝胶体内移植治疗：使用时，将上述制备的8mg/ml水凝胶悬液注射到sap大鼠胰腺组织内，观察其对胰腺损伤的修复情况。

实施例2猪胰腺基质水凝胶在制备促进胰腺内源性修复的药物中的用途

a、猪胰腺基质水凝胶的制备和鉴定

(1)猪胰腺基质水凝胶制备：取猪新鲜胰腺，剪去表面的脂肪组织和外膜，将猪胰腺组织切为约2毫米厚的薄片并用生理盐水漂洗数次除去血细胞，然后将其浸没于0.5％十二烷基硫酸钠/生理盐水中，室温搅拌24小时；最后将其转移于1％tritonx-100溶液，室温搅拌直至组织透明，约需1小时，并用生理盐水漂洗3-5次，每次15分钟，去除残余的洗涤剂。脱细胞化的胰腺储存于-80℃。

(2)猪胰腺脱细胞鉴定：将脱细胞化的猪胰腺组织直接用组织包埋剂oct(tissueoct-freezemedium)包埋，做冰冻切片后，一方面用苏木素和伊红染色观察细胞残留情况，可见没有细胞核残留(图1)；另一方面用免疫荧光染色观察胞外基质成分保留情况。根据图2-图5所示，所制备的猪胰腺脱细胞基质保留了i型胶原、iv型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白等主要细胞外基质成分。

(3)将脱细胞的猪胰腺组织置于低温冻干机上进行干燥，用粉碎机将其磨成粉末，并在使用前通过暴露于环氧乙烷中16小时进行灭菌。

(4)按照10mg/ml浓度(每毫升盐酸-胃蛋白酶溶液中含有脱细胞胰腺组织的量为10mg)将上述胰腺脱细胞粉末溶解于盐酸-胃蛋白酶溶液中，室温缓慢搅拌至溶解状态，超速离心除去未消化的大颗粒物，取上清液低温储存待用。

(5)通过加入0.1m氢氧化钠和10xpbs调至生理状态(ph＝7.4)，使水凝胶终浓度为8mg/ml，置于37℃数分钟即可成胶，常温下表现为液态(图6)，当置于37℃数分钟即可成胶，如图7所示，即为所制备的猪胰腺基质水凝胶。如图10所示，扫描电镜检测显示猪胰腺基质水凝胶呈现为多孔状结构，不同粗细猪胰腺基质水凝胶纤维呈网状分布。

b、猪胰腺基质水凝胶生物相容性检测

通过皮下注射本发明的猪胰腺基质水凝胶(采用现有的商业化的胶原水凝胶作对照)于大鼠腹股沟处，观察其生物相容性，如图8所示，he染色结果显示胶原水凝胶组可见较多的炎性细胞浸润，本发明的猪胰腺基质水凝胶材料可均匀分布于皮肤组织，没有明显的炎性细胞浸润，这表明本发明的猪胰腺基质水凝胶具有良好的组织相容性。

c、动物的选择和sap模型制备

本发明选择sd大鼠作为实验对象，实验用sd大鼠(250-300g左右)，用戊巴比妥钠进行腹腔麻醉后，行开腹术，充分暴露胰腺，使用微量输液泵以12ml/h速度逆行向胰胆管注入5％牛磺胆酸钠溶液(0.1ml/100g大鼠体重)，维持10min后关腹。3小时后可以看到腹腔内腹水形成和脏器造化斑形成，sap模型建立前后的sd大鼠胰腺对比图如图11和图12所示，用sd大鼠建立sap模型后其胰腺图像如图9所示。

本发明中将sd大鼠分组进行实验，将sd大鼠分成sham组，sap组和ecm组即假手术组、重症急性胰腺炎组和ecm水凝胶注射组，分别观察各个组内sd大鼠的胰腺修复情况。

d、猪胰腺基质水凝胶修复胰腺功能

(1)猪胰腺基质水凝胶移植sap大鼠胰腺:通过胰腺内多点注射于成功造模的sap大鼠，24后取材观察其对胰腺损伤的修复情况，如图14-16所示，ecm组与sap组相比，胰腺腺泡细胞坏死和炎症细胞浸润显著减少，组织病理学评分也表明，ecm组与sap相比评分明显降低。这表面本发明的猪胰腺基质水凝胶对胰腺损伤具有较好的修复能力。

(2)猪胰腺基质水凝胶可调控巨噬细胞m2型极化:通过对比图13和图14，通过免疫染色检测胰腺组织内巨噬细胞表型，结果显示该水凝胶移植sap模型后，如图14所示，损伤部位可见大量的m2巨噬细胞(cd68/cd206)出现，这表明本发明的猪胰腺基质水凝胶可通过提供天然胰腺组织微环境进而调控巨噬细胞m2型极化。

(3)猪胰腺基质水凝胶可改善胰腺功能：如图15-18所示，胰腺基质水凝胶移植后，可见大鼠胰腺体重比降低(图15)，elisa检测血清胰酶、脂肪酶和mpo的表达水平，结果显示与sap组比较，ecm组血清胰酶、脂肪酶和mpo水平显著降低(图16-18)，这表明本发明的猪胰腺基质水凝胶降低了胰腺的损伤程度，改善了胰腺功能。从而，本发明的猪胰腺基质水凝胶能够促进胰腺的修复。

综上，本发明的猪胰腺基质水凝胶能够应用在制备促进胰腺内源性修复的药物中。具体地，本发明的胰腺基质水凝胶能够应用于治疗重症急性胰腺炎的药物中。较佳地，所述重症急性胰腺炎为急性坏死性胰腺炎。所述液态水凝胶为猪胰腺来源的脱细胞化细胞外基质，其中所述水凝胶具有温敏性，可通过注射的方式输送到胰腺受损部位，在体温即可转变为水凝胶形式，其不但可为受损的胰腺细胞提供接近天然的胰腺组织微环境，而且巨噬细胞也可响应微环境的改变而向抗炎性巨噬细胞极化，因此该水凝胶降低了炎性介质的表达，进而改进了胰腺功能。

根据本说明书的记载即可较好的实现本发明的技术方案。