一种食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法。1.本方法所涉及到的生化反应与目前市场上常见的数值鉴定系统的生化反应不同，结合不同李斯特菌的特异性基因进行验证，优化和确证了本方法的可行性和确信度。2.作为细菌数值鉴定法中最为关键的部分，该方法中菌株对不同生化试验的阳性反应率数据库(data)是通过对全国各地分离到的近2000株菌株进行生化反应后得到的，符合该菌属在中国的实际情况。3.对部分MID?67鉴定结果不好但分子方法可鉴定出来的菌株，通过本方法可以得到较好的鉴定结果，鉴定百分比可以达到90％以上。
【专利说明】
-种食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法
技术领域
[0001] 本发明属于微生物鉴定领域，具体设及一种食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定 方法。
【背景技术】：
[0002] 随着国内外人民物质生活水平的不断提高，食品安全问题已成为全人类关注的焦 点。物理因素、化学因素、生物因素是引起食品安全的=大因素，其中食源性致病微生物尤 为关键。美国CDC发布数据表明，1998-2008年间95 %食源性中毒事件由食源性致病微生物 引起;据中国CDC统计表明，2005-2011年由微生物引起的食物中毒比例占74%。食品安全是 关乎国计民生的头等大事，我国当前食品安全形势依然十分严峻，食品中毒事件频频发生， 所造成的损失和负面影响巨大。
[0003] 就检测手段而言，目前国家现行的许多检测方法都是非常耗时的经典微生物学方 法，加之一味照搬国外模式，建立我国新型快速检测体系相当必要。细菌数值鉴定法是将数 学统计学的原理运用到细菌的鉴定实验中，通过比较待测菌株与细菌数据库中已知菌株的 生化反应的符合概率，迅速得到鉴定结果。运种方法快速、鉴定率高，可实现自动化和商品 化，与双岐索引法和诊断表法并称为=大传统细菌鉴定方法。
[0004] 细菌数值鉴定法最初的理论来源于数值分类法，但运种方法只适合对大量菌株进 行分类，对于单个菌株的鉴定却不适用。同时，也有另一种数值分类的方法可W对细菌进行 鉴定，运种方法将分支图化ey)引入细菌分类，通过建立数学模型来决定最好的试验，然后 菌株通过常规方法得到试验结果，再进行比较鉴定（Annali di Microbiologia ed Enzimologia, 1958,8(23): 1-239.)，相对于传统的方法，运种方法可W节省一些力气，但跟 传统的方法相比，也一样不能解决由于一个或多个特征变异所带来的鉴别困难。此时， Lockhad等在1962年提出的概率鉴定法引起了一些学者的兴趣，运种方法是通过对每一个 细菌条目的阳性结果与实际的已知的结果进行比对从而得到可靠的鉴定（Journal Of General Microbiology, 1962,28,633-640) ePayne(1963)接受了运一方法并与Dybowski和 Franklin-起制定了一个详细的概率计算方法并应用与肠杆科的鉴定中（World Medical Electronics,1963,2:6-11.；Journal of General Microbiology,1968,54(2):215-229)； 此后，Lapage等人在1973年通过该方法对1079株革兰氏阴性菌株进行了鉴定，发酵菌株和 非发酵菌株的符合率达到了 90.8%和82.1%，并正式建立了 Lapage细菌数值鉴定理论 (Journal of General Microbiology, 1973,77(2) :273-290)。基于运一理论，法国生物-梅 里埃公司又提出了T值、R值和鉴定百分数的评价标准(API ,1977)，进一步完善了该理论。 Lapage数值鉴定理论的数据方法是基于计算机辅助鉴定下的贝叶斯理论，首先假设每一个 细菌条目所进行的生化反应都是独立的，运样每一个细菌条目所出现的概率值也是相对独 立的个体。通过不同细菌条目（Taxon)下进行的生化试验(Text)所出现的阳性或者阴性的 结果，转换成概率值，再计算得到试验组合ti各个细菌条目下出现概率值，从而得到鉴定分 数（ID，identification Scores)。
[0005] 结合计算机技术，将此方法编码成配套软件，结合试验单元，可形成细菌数值鉴定 系统。国外在此方面的研究较早，先后开发出如:API(BioMerieux) ,Cobas IDA(Roche), Enterotube II(Roche),Micro-ID(REMEL),Spectrum 10(Austin Biological),Rap ID (Innovative Diag.),Microbact(Microgen),Raplianalyzer(Oxoid),BBLCrystal(BD)等 一系列W生化鉴定为主的细菌数值鉴定系统。运些鉴定系统，都表现出了较高的专业化在、 自动化和智能化水平，其中API是国际公认的标准鉴定系统。在我国，运方面的研究从20世 纪90年代后才开始启动，起步相对较晚，如赵卓等人于1994年开发的应用与肠杆菌科和弧 菌科的数值鉴定系统（中国卫生检验杂志，1994，3:012.);赵贵阳研发的肠杆菌科细菌微量 快速生化鉴定系统（中国卫生检验杂志，2004,14(2) :142-144);张银旺等开发的肠杆菌科 细菌生化鉴定系统(现代检验医学杂志，2007,22(4) :9-11)。虽有报道，但目前，运些鉴定系 统也只是文献报道，且目前国内市场基本被国外产品所占领，未见全面推广。
[0006] 李斯特菌属化isteria SPP.)为革兰氏阳性菌，兼性厌氧。目前国际上比较公认的 主要包括W下几种：单核细胞增生李斯特菌化isteria mono巧togenes，LM)、英诺克李斯特 菌化isteria innocua,LIN)、绵羊李斯特菌化isteria ivanovii ,LIV)、西式李斯特菌 (Xisteria seeligeri ,LS)、威尔氏李斯特菌(Xisteria welshimeri ,LW)和格式李斯特菌 化 isteria grayi, LG) (Int.J.Med.Microbiol. ,2007,297(7-8) :541-557),运些李斯特菌， 在环境中无处不在，在绝大多数的食品中都能找到。2010年至今，该属又相继报道了 10个新 种和2个新亚种，但运些新种均分离自工业和淡水，对人体不致病。其中LIV和LM具有致病 性，但仅LM对人有致病性，能引起人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症、屯、内膜炎、流产、脈肿和 局部的脈性损伤，造成孕妇流产、死胎等疾病，发病者死亡率可达20 %~70 % (Microbiological reviews,1991,55(3) :476)，被认为是全球四大食源性致病菌之一。目 前，LM及其菌属其他种的鉴定和区分主要通过对分离菌落进行形态学、运动型和生化反应 来实现。在李斯特菌的数值鉴定上，也有BioMerieux公司开发的API Listeria,REM化公司 的MID-67 ,Microgen公司开发的Microbact 1化等，运些鉴定系统，都能较好的区分李斯特 菌，但是，不可否认，运些鉴定系统的价格都非常昂贵，一般从几万到几十万不等，在国内并 不容易推广应用。此外，随着地域限制、物种的进化和新物种的发现，运些细菌数值鉴定系 统中的基础数据也存在一定的缺陷，如生化反应阳性率不够准确，生化反应的选择存在一 定的局限性等，都将导致鉴定的错误率提升，一定程度上影响了细菌鉴定的准确性，因此， 自主开发具有中国特色的李斯特菌快速鉴定系统显得非常重要。
【发明内容】
：
[0007] 本发明的目的是利用细菌数值鉴定的原理，提供一种食品中常见李斯特菌，如单 核细胞增生李斯特菌化isteria monocytogenes, LM)、英诺克李斯特菌化isteria innocua,LIN)、绵羊李斯特菌化i Steria ivanovii ,LIV)、西式李斯特菌化i Steria seeIigeri ,LS)、威尔氏李斯特菌(Xisteria weIshimeri ,LW)和格式李斯特菌(Xisteria grayi，LG)的细菌数值鉴定方法。
[0008] 本发明的食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法，其特征在于，包括W下步骤：
[0009] a、确定李斯特菌包含的种类，所述的李斯特菌包括单核细胞增生李斯特菌 化isteria monocytogenes)、英诺克李斯特菌化isteria innocua)、绵羊李斯特菌 (Listeria ivanovii)、西式李其辦寺菌（Listeria seeligeri)、威尔氏李其辦寺菌（Listeria welshimeri)和格式李斯特菌化isteria grayi) W及11个生化反应，所述的11个生化反应 包括屯叶甘水解反应，甘露醇产酸反应，麦芽糖产酸反应，鼠李糖产酸反应，塔格糖产酸反 应，阿拉伯糖醇产酸反应，1-憐酸葡萄糖产酸反应，核糖产酸反应，木糖产酸反应，甲基甘露 醇产酸反应和绵羊血红细胞溶血反应；
[0010] b、选择步骤a中的11个生化实验作为数值法中所需要的生化反应：
[0011] C、建立包括单核细胞增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西式李斯特 菌、威尔氏李斯特菌和格式李斯特菌的李斯特菌属的数据库，确定数值法中计算方法:根据 选择的分类单元与生化实验的阳性概率，形成一个概率矩阵；
[0012] 按照细菌概率鉴定理论确定每一分类单元的总出现频率、多项总发生频率、鉴定 百分数的计算方法，具体计算公式如下：
[0013] 每一分类单元的总出现频率等于该分类单元对应的每个生化实验的阳性概率的 乘积；
[0014] 多项总发生频率等于每一分类单元的总出现频率的总和；
[0015] 鉴定百分数等于每一分类单元总出现频率除W多项总发生频率再乘W100%，全 体鉴定百分数之和应等于100% ;
[0016] d、待测菌株纯培养后，进行步骤a的U种生化实验；
[0017] e、获得待测菌株的11种生化实验结果后，根据生化反应的阴、阳，按照计算方法对 数据库中所有分类单元进行计算，首先将生化实验值转换成概率值，即实验结果为阳性则 就是对应生化实验的阳性概率值;若为阴性则100%减去生化实验的阳性概率值，上述结果 若是0或100%，则用近似值1%或99%代替，再按照步骤C的计算方法计算每一个分类单元 的总出现频率、多项总发生频率、鉴定百分数；
[0018] f、根据计算结果，对待测菌株鉴定结果进行判定:根据鉴定百分数的大小进行排 序，鉴定百分数最高相对应的菌株即为待测菌株所属的分类单元。
[0019] 本发明中，屯叶甘水解反应，麦芽糖产酸反应，阿拉伯糖醇产酸反应可区分李斯特 菌属与其他属的菌。英诺克李斯特菌、威尔氏李斯特菌和格式李斯特菌为不溶血菌株，绵羊 血红细胞溶血反应将他们与单增李斯特菌，西式李斯特菌和格式李斯特菌进行区分;木糖 产酸反应可区分威尔氏李斯特菌和其他两种不溶血菌株，甘露醇产酸反应和鼠李糖产酸反 应可区分格式李斯特菌和其他两种不溶血菌株;溶血性菌株中，仅绵羊李斯特菌的1-憐酸 葡萄糖产酸反应为阳性，其余菌株显示为阴性;单增李斯特菌的木糖产酸反应为阴性，西式 李斯特菌为阳性。此外，塔格糖产酸反应也可区别威尔氏李斯特菌和其他菌株，核糖产酸反 应可区分格式李斯特菌和其他的李斯特菌株，甲基甘露醇产酸反应将西式李斯特菌和绵羊 李斯特菌与其他菌株区分开。
[0020] 本方法与其他方法相比具有的优势：
[0021] 1.本方法所设及到的生化反应与目前市场上常见的数值鉴定系统的生化反应不 同，结合不同李斯特菌的特异性基因进行验证，优化和确证了本方法的可行性和确信度。
[0022] 2.作为细菌数值鉴定法中最为关键的部分，该方法中菌株对不同生化试验的阳性 反应率数据库(data)是通过对全国各地分离到的近2000株菌株进行生化反应后得到的，符 合该菌属在中国的实际情况。
[0023] 3.对部分MID-67鉴定结果不好但分子方法可鉴定出来的菌株，通过本方法可W得 到较好的鉴定结果，鉴定百分比可W达到90% W上。
【具体实施方式】：
[0024] W下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0025] -般来说，所有建立在细菌数值鉴定理论基础上的方法都是从计算待测菌株的可 信度(1化ehoods)开始的。首先假设每一个细菌条目所进行的生化反应都是独立的，运样每 一个细菌条目所出现的概率值也是相对独立的个体。通过不同细菌条目（Taxon)下进行的 生化试验(Test)所出现的阳性或者阴性的结果，转换成概率值，再计算得到试验组合ti各 个细菌条目下出现概率值，从而得到鉴定百分数(ID,identification Scores)。
[0026] 计算单项生化反应出现概率值公式如下：
[0027] P(ri|ti)( + )=P( + )(l-Pm)+P(-)Pm (1-1)
[002引 P(ri|ti)(-) = (l-P( + ))(l-Pm)+P( + )Pm (1-2)
[0029] 其中Pm为阳性误差率和阴性误差率，对于阳性反应率为0或者100%的菌株，概率 值用近似值0.0 l或者0.99代替。
[0030] 得到单项生化反应概率值后，再通过公式（1-3)计算不同细菌条目下生化试验组 合ti的总出现概率值P (RI ti)，如下：
[0031] p(R|ti)=P(；ri,r2,…|ti)=P(;ri|ti)P(r2|ti)..., (1-3)
[0032] 得到总出现概率值后，便可计算出鉴定百分数（％)，即生化试验组合ti条件下各 细菌条目的出现概率值P( ti IR)，公式如下：
[0033]
(1-4)
[0034] 除鉴定分数W外，也通过建立概率值的模式似然比值T值(Modal likelihood 打action)来加强鉴定结果的可信度，计算公式如下：
[0035]
(1-5)
[0036] 其中P0(P observed)代表不同细菌条目下生化试验组合ti的实际总出现概率值， PT(Ptypical)则是不同细菌条目下生化试验组合ti的最大总出现概率值。模式似然比值越 接近1，表明该菌株实际出现的概率和最可能的出现概率是等同的，也就表明鉴定价值是可 靠的。
[0037] 通过计算得到的鉴定百分数和T值，即可对待测菌株的可信度进行评价。一般来 说，分为极好的鉴定结果、好的鉴定结果、可W接受的鉴定结果和不可接受的鉴定结果等评 价标准，如表1所示：
[0038] 表1鉴定结果评价
[0039]
[0040] 编写软件的计算机语言采用C++6.0,开发平台为Visual Studio 2010。软件编码 中，具体计算得到试验组合ti各个细菌条目下出现概率值W及鉴定分数（ID， identification Scores)和评价结果的方法和计算公式见上。
[0041] 本发明的食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法，其具体步骤如下：
[0042] a、确定李斯特菌包含的种类，本发明的李斯特菌包括单核细胞增生李斯特菌 化isteria monocytogenes)、英诺克李斯特菌化isteria innocua)、绵羊李斯特菌 (Listeria ivanovii)、西式李其辦寺菌（Listeria seeligeri)、威尔氏李其辦寺菌（Listeria welshimeri)和格式李斯特菌(Xisteria grayi)。
[0043] b、选择数值法中所需要的生化实验。根据建立分支图的方法，并W最少的生化实 验能够区分最多的分类单元的原则，选择出11个生化实验。所述的11个生化反应包括屯叶 甘水解反应，甘露醇产酸反应，麦芽糖产酸反应，鼠李糖产酸反应，塔格糖产酸反应，阿拉伯 糖醇产酸反应，1-憐酸葡萄糖产酸反应，核糖产酸反应，木糖产酸反应，甲基甘露醇产酸反 应和绵羊血红细胞溶血反应；
[0044] C、建立包括单核细胞增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西式李斯特 菌、威尔氏李斯特菌和格式李斯特菌的李斯特菌属的数据库，确定数值法中计算方法:根据 选择的分类单元与生化实验的阳性概率，形成一个概率矩阵；
[0045] 按照细菌概率鉴定理论确定每一分类单元的总出现频率、多项总发生频率、鉴定 百分数的计算方法，具体计算公式如下：
[0046] 每一分类单元的总出现频率等于该分类单元对应的每个生化实验的阳性概率的 乘积；
[0047] 多项总发生频率等于每一分类单元的总出现频率的总和；
[004引鉴定百分数等于每一分类单元总出现频率除W多项总发生频率再乘W100%，全 体鉴定百分数之和应等于100% ;
[0049] d、待测菌株纯培养后，进行步骤b的11种生化实验，即进行屯叶甘水解反应，甘露 醇产酸反应，麦芽糖产酸反应，鼠李糖产酸反应，塔格糖产酸反应，阿拉伯糖醇产酸反应，1-憐酸葡萄糖产酸反应，核糖产酸反应，木糖产酸反应，甲基甘露醇产酸反应和绵羊血红细胞 溶血反应;可W使用商品化的鉴定条，也可W购买生化管或自行配制培养基进行生化实验。
[0050] e、获得待测菌株的11种生化实验结果后，根据生化反应的阴、阳，按照计算方法对 数据库中所有分类单元进行计算，首先将生化实验值转换成概率值，即实验结果为阳性则 就是对应生化实验的阳性概率值;若为阴性则100%减去生化实验的阳性概率值，上述结果 若是0或100%，则用近似值0.1或0.99代替，再按照步骤C的计算方法计算每一个分类单元 的总出现频率、多项总发生频率、鉴定百分数；
[0051] f、根据计算结果，对待测菌株鉴定结果进行判定:根据鉴定百分数的大小进行排 序，鉴定百分数最高相对应的菌株即为待测菌株所属的分类单元。
[0化2] g、鉴定软件采用C++语言编写，开发平台为Visual Studio 2010。为便于分析和软 件开发，生化反应谱的编码采用了八进制的方式进行，1巧巾生化反应如表3分成了 4组，分别 赋值为1、2、4,当待测菌株生化反应结果为阴性时一律为0。即当第一个生化反应为阳性时 数值为1，第二位为阳性反应时数值为2,第=位阳性时则标记为4,所有阴性反应均为0。运 种编码方式是一种非常方便的查询方法，目前API生化鉴定系统即采用的表2所示的编码方 式：
[0化3] 表2 API数值编码 [0化4]
[0055]本数值鉴定系统的生化反应谱的编码采用同样的八进制方式，11种生化反应分成 了4组，分别赋值为1、2、4,当待测菌株生化反应结果为阴性时一律为0,如表3所示：
[0化6] 表3 「nnf；7l L0058J 下面由表4进行举例说明。
[0化9] 1、生化试验
[0060]首先将待测菌进行屯叶甘水解反应，甘露醇产酸反应，麦芽糖产酸反应，鼠李糖产 酸反应，塔格糖产酸反应，阿拉伯糖醇产酸反应，1-憐酸葡萄糖产酸反应，核糖产酸反应，木 糖产酸反应，甲基甘露醇产酸反应和绵羊血红细胞溶血反应11项生化试验，记录试验结果。
[0061] 2、鉴定百分数的计算
[0062] 得到生化实验结果后，计算6个分类单元(单核细胞增生李斯特菌、英诺克李斯特 菌、绵羊李斯特菌、西式李斯特菌、威尔氏李斯特菌和格式李斯特菌）与待测菌的鉴定百分 数，由于限于篇幅无法将6个分类单元的阳性概率悉数列出，所W W已知菌1、已知菌2、已知 菌3=个代称，W及与其生化实验1、生化实验2、生化实验3举例来进行说明。
[0063] 待测菌生化实验结果和已知菌1、已知菌2、已知菌3 =种菌生化阳性概率结果如表 4所示：
[0064] 表4待测菌的数值鉴定百分比计算例子
[00 化]
[0069] C:不同细菌条目下生化试验组合ti的总出现概率值
[0
[0
[0
[00701
[0
[0 1234 根据待测菌的生化实验结果，=个生化实验的结果分别为+、-、+，因此按照前面所 述的计算方法，已知菌1的总出现频率=98X (100-1) X90X ICT6 = O.911493;已知菌2的总 出现频率=84 X (100-99) X 5 X 10-6 = 0.000420;已知菌3的总出现频率=1 X (100-98) X 97 X 10-6 = 0.000194;多项总出现频率=0.911493+0.000420+0.000194 = 0.912107;已知菌 1 的鉴定百分数=(0.911493今0.912107 ) X 100 = 99.93% ;已知菌2的鉴定百分数= (0.000420今0.912107) X 100 = 0.045%;已知菌3的鉴定百分数=(0.000194今0.912107) X 100 = 0.021%。由于本发明包括的分类单元为6个及生化反应为11个，每鉴定一株菌需要 对6个分类单元都进行鉴定百分数的计算，人工计算工作量大，工作进程将会受到严重的影 响，因此，计算过程在相应的配套软件进行。 2 于是我们可W推断待测菌为已知菌1的概率最高，达到了 99.93%。 3 表5中所示的细菌条目的模式似然比值建立如表2-4所示： 4 表5模式似然比值的建立
[0077]
[0078] 根据鉴定百分数和T值的临界值可W对鉴定结果进行分类评价，可判断出待测菌 为已知菌1的结果是极好的鉴定。
[0079] W下实施例是按照W上食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法进行鉴定的，具 体如下：
[0080] 实施例1:
[0081 ] 基于本实验室分离到的2000多株李斯特菌(包括1627株LM，270株LIN，32株LW，29 株LG，9株LS和6株LIV)进行11项生化反应，即屯叶甘水解反应（1)，甘露醇产酸反应(2)，麦 芽糖产酸反应(3)，鼠李糖产酸反应(4)，塔格糖产酸反应(5)，阿拉伯糖醇产酸反应(6)，1-憐酸葡萄糖产酸反应(7)，核糖产酸反应(8)，木糖产酸反应(9)，甲基甘露醇产酸反应（10) 和绵羊血红细胞溶血反应(11)的结果，获得本鉴定系统的生化反应阳性数据库。
[0082] 具体如表6所示：
[0083] 表 6
[0084]
[0085] 对李斯特菌标准菌株(如表8所示)按照上述食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定 方法进行鉴定。
[0086] 对六种李斯特菌的标准菌株分别进行上述U种生化反应后记录结果，如表7所示：
[0087] 表7李斯特菌标准菌株各生化反应结果 「mRRl
[0090] 注:LM为单增李斯特菌，LIN为英诺克李斯特菌，LW为威尔氏李斯特菌，LS为西式李 斯特菌，LIV为绵羊李斯特菌，LG为格式李斯特菌
[0091] 获得11种生化实验结果后，根据生化反应的阴、阳，按照计算方法对数据库中所有 分类单元进行计算。首先将生化值转换成概率值，即实验结果为阳性则就是对应生化实验 的阳性概率值;若为阴性则100%减去生化实验的阳性概率值。上述结果若是0或100,则用 近似值0.01或0.99代替。再计算每一个分类单元的总出现频率、多项总发生频率、鉴定百分 数。
[0092] 计算结果可知LM的读数结果为5503,输入结果后显示:单增李斯特菌的鉴定百分 数为99.25%，T值为100%，判定为极好的鉴定。其他菌株的读数分别为：英诺克李斯特菌 (5501)、威尔氏李斯特菌(5741)、西式李斯特菌(5442)、绵羊李斯特菌(5452)、格式李斯特 菌(7421)。鉴定出来的结果分别为:98.34%、99.99%、95.07%、98.08%和100%，T值分别 是:100%、100 %、100 %、100 %和100%，均为极好的鉴定结果。
[OOW]表 8
[0094]
[0095]
[0096] 实施例2:
[0097] 对本实验分离到的264株单核细胞增生李斯特菌进行MID鉴定，均显示为单增李斯 特菌，鉴定百分比为99.92%，T值为1，结果判定为极好的鉴定结果。
[0098] 同时对上述264株单核细胞增生李斯特菌按照本发明的食品中常见李斯特菌的细 菌数值鉴定方法进行鉴定。首先对264株单核细胞增生李斯特菌分别进行11项生化试验，具 体结果如表9所示，然后按照食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法中的计算方法，对照 其生化反应阳性数据库(表6)计算每一个分类单元的总出现频率、多项总发生频率、鉴定百 分数。显示数值5503,输入结果后得到单增李斯特菌99.25%的鉴定百分比，T值为100%，判 定为极好的鉴定结果。表明本发明的鉴定结果与MIDW及分子鉴定的结果完全相符，表现出 较好的鉴定能力。
[0099] 表 9
[0100]
[0101] 实施例3:
[0102] 对本实验室分离到的48株单核细胞增生李斯特菌进行MID鉴定作为对照。MID结果 显示33株菌株鉴定百分比为99.41 %，T值为2.04%，判定为可接受的鉴定结果；1株分离菌 株显示鉴定百分比为99.99%，T值3.04%，判定为可接受的鉴定结果;6株分离菌株显示鉴 定百分比为99.84%，T值0.1%，判定为可接受的鉴定结果;8株分离菌株显示鉴定百分比为 58.26%，T值<0.Ol %，判定为不可接受的鉴定结果。对运些菌株进行进一步的分子鉴定，结 果显示均为单增李斯特菌。
[0103] 同时对上述48株单核细胞增生李斯特菌按照本发明的食品中常见李斯特菌的细 菌数值鉴定方法进行鉴定，首先对48株单核细胞增生李斯特菌分别进行11项生化试验，具 体结果如表10所示，然后按照本发明的食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法中的计算 方法，对照其生化反应阳性数据库(表6)计算每一个分类单元的总出现频率、多项总发生频 率、鉴定百分数。结果显示，其中6株菌为极好的鉴定结果，42株菌为可接受的鉴定结果。鉴 定百分比和 T 值分别为：99.25% (100% ),98.82% (2.04% ),95.24% (0.01 % ),99.59% (2.04% )。如表11所示：
[0104] 表10
[0105]
[i
[i
[i
[0109] 综合分子鉴定结果，本发明的食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法表现出优 于MID鉴定系统的鉴定水平和能力。
[0110] 实施例4:
[0111] 对本实验室分离到的265株英诺克李斯特菌分离株进行MID鉴定，结果显示227株 分离株为极好的鉴定结果，鉴定百分比为93.95%，T值为100% ; 29株分离株为好的鉴定结 果，鉴定百分比为97.86%，T值为42.86% ;2株分离株为可接受的鉴定结果，鉴定百分比为 92.90%，T值为0.10% ; 5株分离株为可疑的鉴定结果，鉴定百分比为66.73 %，T值为 0.04%。分子鉴定结果显示，所有菌株均含有英诺克李斯特菌的特异性条带。
[0112] 同时对上述265株英诺克李斯特菌按照本发明的食品中常见李斯特菌的细菌数值 鉴定方法进行鉴定，首先对4265株英诺克李斯特菌分别进行11项生化试验，具体结果如表 12所示，然后按照本发明的食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法中的计算方法，对照 其生化反应阳性数据库(表6)计算每一个分类单元的总出现频率、多项总发生频率、鉴定百 分数。结果显示（表13)227株分离株为极好的鉴定结果，鉴定百分比为98.31 %，T值为 100% ;34株为好的鉴定结果，鉴定百分比为99.70%，T值为42.86% ; 2株为可接受的鉴定结 果，鉴定百分比为94.53 %，T值为1.01 %。本实施例表明本发明表现出优于MID鉴定系统的 鉴定水平和能力，可W更好的鉴定出英诺克李斯特菌。
[0113] 表12
[0114]
[(
[0116]表13英诺克李斯特菌分离株MID鉴定结果与本发明的结果比较
[01171
[011引实施例5:
[0119] 对本实验分离的28株格式李斯特菌分离株进行MID鉴定，结果显示均为可接受的 鉴定结果。同时对运些菌株按照本发明的食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法行鉴 定，首先对28株格式李斯特菌分离株分别进行11项生化试验，然后按照本发明的食品中常 见李斯特菌的细菌数值鉴定方法中的计算方法，对照其生化反应阳性数据库(表6)计算每 一个分类单元的总出现频率、多项总发生频率、鉴定百分数。记录结果，输入软件，显示其中 27株为可接受的鉴定结果，1株分离株为可疑的鉴定结果。如表14所示：
[0120] 表14格式李斯特菌分离株MID鉴定结果与本发明的结果比较 [01211
[0122]
[0123] 实施例6:
[0124] 对本实验分离的6株西式李斯特菌分离株进行MID鉴定，其中2株为极好的鉴定，4 株为可接受的鉴定结果。1株绵羊李斯特菌分离株MID鉴定结果为可接受的鉴定。同时对运 些菌株按照本发明的食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法行鉴定，首先对运些李斯特 菌分离株分别进行11项生化试验，然后按照本发明的食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定 方法中的计算方法，对照其生化反应阳性数据库(表6)计算每一个分类单元的总出现频率、 多项总发生频率、鉴定百分数。鉴定结果与MID相同。两种鉴定系统的鉴定结果一样，与分子 鉴定结果一致。具体鉴定结果如表15所示：
[0125] 表15西式李斯特菌分离株MID鉴定结果与本发明的结果比较
【主权项】
1. 一种食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤： a、 确定李斯特菌包含的种类，所述的李斯特菌包括单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、英诺克李斯特菌（Listeria innocua)、绵羊李斯特菌（Listeria ivanovii)、西式李斯特菌（Listeria seeligeri)、威尔氏李斯特菌（Listeria welshimeri)和格式李斯特菌(Listeria grayi)以及11个生化反应，所述的11个生化反应 包括七叶甘水解反应，甘露醇产酸反应，麦芽糖产酸反应，鼠李糖产酸反应，塔格糖产酸反 应，阿拉伯糖醇产酸反应，1-磷酸葡萄糖产酸反应，核糖产酸反应，木糖产酸反应，甲基甘露 醇产酸反应和绵羊血红细胞溶血反应； b、 选择步骤a中的11个生化实验作为数值法中所需要的生化反应： c、 建立包括单核细胞增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西式李斯特菌、 威尔氏李斯特菌和格式李斯特菌的李斯特菌属的数据库，确定数值法中计算方法:根据选 择的分类单元与生化实验的阳性概率，形成一个概率矩阵； 按照细菌概率鉴定理论确定每一分类单元的总出现频率、多项总发生频率、鉴定百分 数的计算方法，具体计算公式如下： 每一分类单元的总出现频率等于该分类单元对应的每个生化实验的阳性概率的乘积； 多项总发生频率等于每一分类单元的总出现频率的总和； 鉴定百分数等于每一分类单元的总出现频率除以多项总发生频率再乘以1〇〇%，全体 鉴定百分数之和应等于100% ; d、 待测菌株纯培养后，进行步骤a的11种生化实验； e、 获得待测菌株的11种生化实验结果后，根据生化反应的阴、阳，按照计算方法对数据 库中所有分类单元进行计算，首先将生化实验值转换成概率值，即实验结果为阳性则就是 对应生化实验的阳性概率值;若为阴性则100%减去生化实验的阳性概率值，上述结果若是 0或100%，则用近似值1%或99%代替，再按照步骤c的计算方法计算每一个分类单元的总 出现频率、多项总发生频率、鉴定百分数； f、 根据计算结果，对待测菌株鉴定结果进行判定:根据鉴定百分数的大小进行排序，鉴 定百分数最高相对应的菌株即为待测菌株所属的分类单元。2. 根据权利要求1所述的细菌数值鉴定方法，其特征在于，所述的单核细胞增生李斯特 菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西式李斯特菌、威尔氏李斯特菌和格式李斯特菌的李 斯特菌属的数据库如下表所示：3.根据权利要求1所述的细菌数值鉴定方法，其特征在于，所述的11种生化实验按照下 表分成了4组，分别赋值为1、2、4,当待测菌株生化反应结果为阴性时一律为0,由此形成生 化反应谱；
【文档编号】C12Q1/04GK105861621SQ201610423653
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】吴清平, 吴诗, 叶青华, 张菊梅, 郭伟鹏, 蔡芷荷
【申请人】广东省微生物研究所