黑曲霉在制备黄芪甲苷中的应用
【专利摘要】本发明公开了黑曲霉在制备黄芪甲苷中的应用。该应用具体可为制备黄芪甲苷的方法。该制备黄芪甲苷的方法包括用黑曲霉发酵黄芪药渣，得到黄芪药渣黑曲霉发酵物，从所述黄芪药渣黑曲霉发酵物中提取得到黄芪甲苷。实验证明，黄芪药渣经黑曲霉发酵后，提高了黄芪甲苷的得率：黄芪药渣经黑曲霉ACCC 30583发酵后按照相同的提取方法提取得到的黄芪甲苷的产量是未经发酵的黄芪药渣的5.4倍；黄芪药渣经黑曲霉ACCC 30784发酵后按照相同的提取方法提取得到的黄芪甲苷的产量是未经发酵的黄芪药渣的2.7倍；黄芪药渣经黑曲霉ACCC 30177发酵后按照相同的提取方法提取得到的黄芪甲苷的产量是未经发酵的黄芪药渣的4.8倍。
【专利说明】
黑曲霉在制备黄庚甲昔中的应用
技术领域
[0001] 本发明设及微生物领域中黑曲霉的用途，特别设及黑曲霉在制备黄巧甲巧中的应 用。
【背景技术】
[0002] 中药是我国的传统药物，近年来随着我国中医药事业的不断发展，中成药在我国 乃至国际上的市场份额越来越大，使得我国中成药生产和中药加工企业数量不断增多，运 就必然使中药废弃物中药药渣大量增加，如果不能对中药药渣进行及时的处理，就会发生 如贵州百灵的"药渣村"、哈药的"污染1'了'等事件，对生态环境造成严重的污染。有报道显 示，截止到2010年我国有1636家中药企业，每年消耗植物药材高达70万吨，产生了大量的中 药药渣。受中药生产工艺的限制，各中药企业对中药有效成分提取率较低，中药药渣中还含 有大量的有效成分，具有较高的利用价值，如何正确处理中药药渣已成为目前研究的重点。
[0003] 中药药渣是中药材提取其有效成分后的残留物，在中药提取工业上一般作为废弃 物处理。目前工业上对中药药渣的处理方法主要为堆放、填埋W及焚烧等，如果采用焚烧方 式处理，药渣在焚烧过程中会产生大量的有毒有害气体，污染大气，而且湿物料也会给焚烧 带来困难;如果采用堆放、填埋等方式处理，药渣会发生腐败，产生大量的刺激性气味，严重 污染了周边的环境。中药材中有效成分含量较低，加上提取工艺落后，中成药生产往往产生 大量的中药药渣，所W中药药渣具有体积大、产量多等特点。由于中药药渣具有体积大，产 量多的特点，所W中药药渣W堆放为主，对中药药渣进行堆放处理，不仅浪费了药渣中残留 的有效成分，造成了资源浪费，同时对周边的水±资源造成污染，对人们的生产生活带来严 重的危害。
[0004] 根据《2010版中华人民共和国药典第一部》对黄巧的规定可知，黄巧为豆科植物蒙 古黄巧（Astragalus membranaceus(Fisch. )Bge. var.mongholiCUS(Bge. )Hsiao)或膜芙黄 巧(Astragalus membranaceus(Fisch. )Bge)的干燥根。皂巧类是黄巧药材的主要有效成分 之一，目前已经从黄巧药材中分离出黄巧巧、异黄巧巧等40多种皂巧。近年来随着对黄巧皂 巧类研究的不断深入，发现黄巧皂巧除了具有免疫调节作用外，还有抗病毒、抗肿瘤、降血 糖W及改善屯、血管疾病等作用。Wang等研究表明，黄巧甲巧可W促进小鼠抗体生长和T，B淋 己细胞增殖，提高小鼠的体液免疫和细胞免疫。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何W黄巧药渣为原料制备黄巧甲巧。
[0006] 为了解决W上技术问题，本发明提供了黑曲霉在制备黄巧甲巧中的应用。
[0007] 上述应用中，所述黑曲霉可为黑曲霉ACCC 30583、黑曲霉ACCC 30177或黑曲霉 ACCC 30784O
[000引为了解决W上技术问题，本发明提供了利用黑曲霉制备黄巧甲巧的方法。
[0009]本发明所提供的制备黄巧甲巧的方法，包括用黑曲霉发酵黄巧药渣，得到黄巧药 渣黑曲霉发酵物，从所述黄巧药渣黑曲霉发酵物中提取得到黄巧甲巧。
[0010]上述方法中，用黑曲霉发酵黄巧药渣，得到黄巧药渣黑曲霉发酵物的方法包括将 所述黑曲霉接入含有黄巧药渣的发酵培养基中，培养得到黄巧药渣黑曲霉发酵物。
[00川上述方法中，所述黑曲霉可为黑曲霉ACCC 30583、黑曲霉ACCC 30177或黑曲霉 ACCC 30784O
[0012]上述方法中，所述含有黄巧药渣的发酵培养基可按照如下方法制备:将含水量为 50%-60%的物料进行灭菌得到所述含有黄巧药渣的发酵培养基;所述物料由下述质量份 的原料组成：10质量份的黄巧药渣、0.03-0.12质量份(如0.03-0.06质量份或0.06质量份） 的氮源、1.2质量份的K出K)4和0.6质量份的MgS化? 7出0。
[OOU]上述方法中，所述氮源可为尿素、KN03、(馳)2S〇4、酵母粉、牛肉膏或/和蛋白腺。
[0014] 上述方法中，所述培养是在28 °C培养5-8天或5天。
[0015] 为了解决W上技术问题，本发明提供了用于制备黄巧甲巧的成套产品。
[0016] 本发明所提供的用于制备黄巧甲巧的成套产品，包括所述黑曲霉和所述含有黄巧 药渣的发酵培养基;所述黑曲霉和所述含有黄巧药渣的发酵培养基均独立包装。
[0017] 所述含有黄巧药渣的发酵培养基也属于本发明的保护范围。
[0018] 上述含有黄巧药渣的发酵培养基中，所述黄巧药渣的粒径(直径)可为0.8-1.2cm 或2mm至4mm。
[0019] 本发明的黄巧药渣是指用水提取黄巧有效成分后残留的残渣。黄巧药渣具体可W 按照W下方法制备，将黄巧加水煮沸2-3次，过滤收集滤渣，该滤渣即为黄巧药渣。
[0020] 实验证明，黄巧药渣经黑曲霉发酵后，提高了黄巧甲巧的得率:黄巧药渣经黑曲霉 ACCC 30583发酵后按照相同的提取方法提取得到的黄巧甲巧的产量是未经发酵的黄巧药 渣的5.4倍;黄巧药渣经黑曲霉ACCC 30784发酵后按照相同的提取方法提取得到的黄巧甲 巧的产量是未经发酵的黄巧药渣的2.7倍;黄巧药渣经黑曲霉ACCC 30177发酵后按照相同 的提取方法提取得到的黄巧甲巧的产量是未经发酵的黄巧药渣的4.8倍。
【附图说明】
[0021] 图1为黄巧甲巧标准品的HPLC图谱。箭头示黄巧甲巧色谱峰。
[0022] 图2为从黑曲霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物中提取的黄巧甲巧样品的HPLC图 谱。箭头示黄巧甲巧色谱峰。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0024] 下述实施例中的黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC 30784于2006年5月11日收藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中屯、(简称ACCC，地址:北京市海淀区中关村 南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公 众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中屯、获得该菌株。黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC 30784在下文中简称黑曲霉ACCC 30784。
[00巧]下述实施例中的黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC 30177于1989年6月8日收藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中屯、(简称ACCC，地址:北京市海淀区中关村南 大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081 )，自该收藏日起公众 可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中屯、获得该菌株。黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC 30177在下文中简称黑曲霉ACCC 30177。
[00%] 下述实施例中的黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC 30583于2006年7月21日收藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中屯、(简称ACCC，地址:北京市海淀区中关村 南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公 众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中屯、获得该菌株。黑曲霉(Aspergillus niger)ACCC 30583在下文中简称黑曲霉ACCC 30583。
[0027] 实施例1、利用黑曲霉制备黄巧甲巧
[0028] 本实施例所用的培养基如下：
[0029] PDA:马铃馨去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，琼 脂17g，蒸馈水定容到1000 mL,煮沸混匀，12rC条件下灭菌20分钟，得到PDA培养基。
[0030] PD:马铃馨去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，蒸馈 水定容到1000 mL,煮沸混匀，121°C条件下灭菌20分钟，得到PD培养基。
[0031] 黄巧渣固体发酵培养基：直径为2mm至4mm的黄巧药渣10.0g( W干重计），尿素 0.03邑，1(此口04 1.2邑，1邑504*7出0 0.6邑，调整运些物料的含水量为60%、口巧直为7.0，1211： 条件下灭菌20分钟，得到黄巧渣固体发酵培养基。
[0032] 本实施例所用的黄巧药渣均按照如下方法制备：
[0033] 将100g黄巧饮片(合肥乐家老铺中药饮片有限公司，产地四川，批号13060501)置 于烧杯中，加冷纯水浸泡lh(加水量W刚好泡透药材为准）；煎煮时再加药物总量的10倍冷 纯水(约lOOOmL)。先武火煮沸，沸腾后改用文火保持微沸60min，滤取药液。药渣再加50°C左 右溫水进行第二次煎煮，方法同前，滤取药液，留取药渣，得到黄巧药渣。
[0034] 1、黑曲霉发酵黄巧药渣制备黑曲霉黄巧渣固体发酵物
[0035] 本实施例利用黑曲霉ACCC 30583、黑曲霉ACCC 30784和黑曲霉ACCC 30177在相同 的条件下分别发酵黄巧药渣，得到了黑曲霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物、黑曲霉ACCC 30784黄巧渣固体发酵物和黑曲霉ACCC 30177黄巧渣固体发酵物运S种黑曲霉黄巧渣固体 发酵物，运=种黑曲霉黄巧渣固体发酵物的制备方法的区别仅在于所用的黑曲霉菌株不 同。运=种黑曲霉黄巧渣固体发酵物的制备方法具体如下：
[0036] 1.1、黑曲霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物的制备
[0037] 实验重复3次，每次重复的方法如下:将黑曲霉ACCC 30583接种于PDA平板，接种环 挑取黑曲霉ACCC 30583抱子，无菌水稀释成1 X IO8C化/血的悬液，1 % (V/V)接种量接种PD， 28°C，160rpm培养24小时后得种子液，再将种子液Wl%(V/V)接种量接种于装有50g黄巧渣 固体发酵培养基的500ml锥形瓶中28°C培养5天，收集培养容器内的所有物质，得到黑曲霉 ACCC 30583黄巧渣固体发酵物。每次重复设10个锥形瓶。
[0038] 1.2、黑曲霉ACCC 30784黄巧渣固体发酵物的制备
[0039] 实验重复3次，每次重复的方法如下:将黑曲霉ACCC 30784接种于PDA平板，接种环 挑取黑曲霉ACCC 30784抱子，无菌水稀释成1 X IO8CfuAiL的悬液，1 % (V/V)接种量接种PD， 28°C，160rpm培养24小时后得种子液，再将种子液Wl%(V/V)接种量接种于装有50g黄巧渣 固体发酵培养基的500ml锥形瓶中28°C培养5天，收集培养容器内的所有物质，得到黑曲霉 ACCC 30784黄巧渣固体发酵物。每次重复设10个锥形瓶。
[0040] 1.3、黑曲霉ACCC 30177黄巧渣固体发酵物的制备
[0041] 实验重复3次，每次重复的方法如下:将黑曲霉ACCC 30177接种于PDA平板，接种环 挑取黑曲霉ACCC 30177抱子，无菌水稀释成1 X IO8CfVmL的悬液，1 % (V/V)接种量接种PD， 28°C，160rpm培养24小时后得种子液，再将种子液Wl%(V/V)接种量接种于装有50g黄巧渣 固体发酵培养基的500ml锥形瓶中28°C培养5天，收集培养容器内的所有物质，得到黑曲霉 ACCC 30177黄巧渣固体发酵物。每次重复设10个锥形瓶。
[0042] 2、从黑曲霉黄巧渣固体发酵物中提取黄巧甲巧
[0043] 2.1从黑曲霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物中提取黄巧甲巧
[0044] 实验重复3次，每次重复的方法如下:取黑曲霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物lOg， 加入IOOmL的蒸馈水浸泡30min，煮沸并保持微沸30min，过滤收集滤液(将该滤液称为滤液 1);向滤渣中加入IOOmL的蒸馈水，煮沸并保持微沸30min，过滤收集滤液(将该滤液称为滤 液2)，合并滤液1和滤液2，于4000r/min离屯、IOmin，取上清液，使用旋转蒸发仪浓缩至IOmL， 用水饱和正下醇振摇萃取4次，每次40mL，合并正下醇相，用氨液充分洗涂2次，每次40mL，弃 去氨液，将正下醇液蒸干，残渣加水5mL使溶解，通过DlOl型大孔吸附树脂柱（内径1.5cm，柱 高12cm)，W水50mL洗脱，弃去水洗脱出来的液体，再用40 %乙醇水溶液30mL洗脱，弃去洗脱 出的液体，继用70%乙醇水溶液SOmL洗脱，收集洗脱液(洗脱出的液体），蒸干，得到从黑曲 霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物中提取的黄巧甲巧样品。用甲醇溶解该黄巧甲巧样品，并 定容至IOmL ,HPLC检测。
[0045] 2.2从黑曲霉ACCC 30784黄巧渣固体发酵物中提取黄巧甲巧
[0046] 与步骤2.1的区别仅在于将步骤2.1的黑曲霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物替换 为黑曲霉ACCC 30784黄巧渣固体发酵物。
[0047] 2.3从黑曲霉ACCC 30177黄巧渣固体发酵物中提取黄巧甲巧
[004引与步骤2.1的区别仅在于将步骤2.1的黑曲霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物替换 为黑曲霉ACCC 30177黄巧渣固体发酵物。
[0049] 3、从黄巧药渣中提取黄巧甲巧
[0050] 同时从黄巧药渣中按照步骤2.1的方法提取黄巧甲巧，作为对照。其与步骤2.1的 区别仅在于将步骤2.1的黑曲霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物替换为黄巧药渣。
[0051 ] 4、HPLC检测黄巧甲巧
[0052]取黄巧甲巧(标准品，批号110781-201314,中国食品药品研究所），用甲醇溶解定 容，进行HPLC制作标准曲线。
[0化3] HPLC色谱条件:采用是安捷伦1100液相色谱工作站，色谱柱是:ZORBAX SB-C18250 X4.6mm 5皿C18 880975-902,流动相：乙腊:水(体积比）= 30:70;流速：lmL/min;检测波 长:210nm;柱溫：30°C;进样量：10化。
[0054]结果表明，黄巧药渣未经发酵，W干重计，每克黄巧药渣能得到0.131±0.004mg黄 巧甲巧;黑曲霉ACCC 30583发酵黄巧药渣，W干重计，每克黄巧药渣经黑曲霉ACCC 30583发 酵后能得到0.713 ± 0.003mg黄巧甲巧;黑曲霉ACCC 30784发酵黄巧药渣，W干重计，每克黄 巧药渣经黑曲霉ACCC 30784发酵后能得到0.354±0.004mg黄巧甲巧;黑曲霉ACCC 30177发 酵黄巧药渣，W干重计，每克黄巧药渣经黑曲霉ACCC 30177发酵后可W得到0.632 ± 0.002mg黄巧甲巧。黄巧药渣经黑曲霉ACCC 30583发酵后按照相同的提取方法提取得到的 黄巧甲巧的产量是未经发酵的黄巧药渣的5.4倍;黄巧药渣经黑曲霉ACCC 30784发酵后按 照相同的提取方法提取得到的黄巧甲巧的产量是未经发酵的黄巧药渣的2.7倍;黄巧药渣 经黑曲霉ACCC 30177发酵后按照相同的提取方法提取得到的黄巧甲巧的产量是未经发酵 的黄巧药渣的4.8倍。说明黄巧药渣经黑曲霉发酵后，提高了黄巧甲巧的得率，相同的黄巧 药渣经不同的黑曲霉菌株在相同条件下发酵产生的黑曲霉黄巧渣固体发酵物，按照相同的 提取方法提取到的黄巧甲巧质量不同，每克黄巧药渣经黑曲霉ACCC 30583发酵后提取到的 黄巧甲巧质量是黑曲霉ACCC 30177的1.13倍，是黑曲霉ACCC 30784的2.Ol倍。
[0055] 实施例2、黑曲霉ACCC 30583发酵黄巧药渣的条件优化
[0056] 1、氮源种类对黄巧甲巧产量的影响
[0057] 所用的氮源种类优化黄巧渣固体发酵培养基如下:直径为0.8-1.2cm的黄巧药渣 10.0旨（^干重计），氮源1.2旨，1(出?04 1.2旨，1旨504.7此0 0.6旨，调整运些物料的含水量为 50%、pH值为7.0，12rC条件下灭菌20分钟，得到氮源种类优化黄巧渣固体发酵培养基。其 中，氮源为(NH4)2S化、KN03、尿素、牛肉膏、酵母粉或蛋白腺。
[005引实验重复3次，每次重复的方法如下:将黑曲霉ACCC 30583接种于PDA平板，接种环 挑取黑曲霉ACCC 30583抱子，无菌水稀释成1 X IO8C化/血的悬液，1 % (V/V)接种量接种PD， 28°C，ieOrpm培养24小时后得种子液，再将种子液Wl % (V/V)接种量接种于装有50g氮源种 类优化黄巧渣固体发酵培养基的500ml锥形瓶中，28°C培养5天，收集培养容器内的所有物 质，得到黑曲霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物。每次重复设10个锥形瓶。
[0059] 按照实施例1步骤2的方法从黑曲霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物中提取黄巧甲 巧，按照实施例1步骤4的方法HPLC检测黄巧甲巧。结果表明黑曲霉ACCC 30583在W尿素为 氮源的氮源种类优化黄巧渣固体发酵培养基中发酵黄巧药渣的黄巧甲巧产量最高，W干重 计，每克黄巧药渣能产生〇.673mg的黄巧甲巧(表1)。
[0060] 表1、氮源种类对黄巧甲巧产量的影响 「00611
[0062] 2、尿素含量对黄巧甲巧产量的影响
[0063] 所用的尿素含量优化黄巧渣固体发酵培养基如下:直径为0.8-1.2cm的黄巧药渣 10.0旨（^干重计），尿素，1(此?04 1.2旨，1旨504?7此0 0.6旨，调整运些物料的含水量为50%、 pH值为7.0，12rC条件下灭菌20分钟，得到尿素含量优化黄巧渣固体发酵培养基。其中，尿 素的质量为O.Olg(是黄巧药渣质量的0.1%)、0.02邑(是黄巧药渣质量的0.2%)、0.03邑(是 黄巧药渣质量的0.3%)、0.04肖（是黄巧药渣质量的0.4%)、0.05肖（是黄巧药渣质量的 0.5%)或0.06g(是黄巧药渣质量的0.6%)。每次重复设10个锥形瓶。实验重复3次，每次重 复的方法如下：将黑曲霉ACCC 30583接种于PDA平板，接种环挑取黑曲霉ACCC 30583抱子， 无菌水稀释成1 X IO8C化/血的悬液，1 % (V/V)接种量接种PD，28°C，ieOrpm培养24小时后得 种子液，再将种子液Wl%(V/V)接种量接种于装有50g尿素含量优化黄巧渣固体发酵培养 基的500ml锥形瓶中28°C培养5天，收集培养容器内的所有物质，得到黑曲霉ACCC 30583黄 巧渣固体发酵物。
[0064] 按照实施例1步骤2的方法从黑曲霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物中提取黄巧甲 巧，按照实施例1步骤4的方法HPLC检测黄巧甲巧。结果表明黑曲霉ACCC 30583在尿素质量 是黄巧药渣质量的0.3 %-0.6 %的尿素含量优化黄巧渣固体发酵培养基中发酵黄巧药渣的 黄巧甲巧产量均较高，W干重计，每克黄巧药渣能产生0.668-0.684mg的黄巧甲巧(表2)。
[0065] 表2、尿素含量对黄巧甲巧产量的影响 「mAAl LUU6/」；3、友酔町间河黄氏甲甘广重的寮刈曰」
[006引所用的黄巧渣固体发酵培养基:直径为0.8-1.2cm的黄巧药渣10.0g( W干重计）， (畑4)2504 1.2旨，1(此？04 1.2旨，1旨504.7此0 0.6旨，调整运些物料的含水量为50%、9制直为 7.0，12rC条件下灭菌20分钟，得到黄巧渣固体发酵培养基。
[0069] 实验重复3次，每次重复的方法如下:将黑曲霉ACCC 30583接种于PDA平板，接种环 挑取黑曲霉ACCC 30583抱子，无菌水稀释成1 X IO8C化/血的悬液，1 % (V/V)接种量接种PD， 28°C，ieOrpm培养24小时后得种子液，再将种子液Wl % (V/V)接种量接种于装有50g尿素含 量优化黄巧渣固体发酵培养基的500ml锥形瓶中28 °C分别培养3天、4天、5天、6天、7天或8 天，收集培养容器内的所有物质，得到黑曲霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物。每次重复设10 个锥形瓶。
[0070] 按照实施例1步骤2的方法从黑曲霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物中提取黄巧甲 巧，按照实施例1步骤4的方法HPLC检测黄巧甲巧。结果表明黑曲霉ACCC 30583在黄巧渣固 体发酵培养基中发酵黄巧药渣5-8天的黄巧甲巧产量均较高，W干重计，每克黄巧药渣能产 生0.671-0.682mg的黄巧甲巧(表3)。
[0071] 表3、发酵时间对黄巧甲巧产量的影响 「00701
L〇〇73」4、黄巧药渣粒度对黄巧甲巧产量的影响
[0074] 所用的黄巧药渣粒度优化固体发酵培养基如下：黄巧药渣10.0g( W干重计）， (畑4)25〇4 1.2旨，1(此？〇4 1.2旨，1旨5〇4.7此0 0.6旨，调整运些物料的含水量为50%、9制直为 7.0，12rC条件下灭菌20分钟，得到黄巧药渣粒度优化固体发酵培养基。其中，黄巧药渣的 粒度为直径0.8-1.2cm、2mm至4mm或小于2mm。
[0075] 实验重复3次，每次重复的方法如下:将黑曲霉ACCC 30583接种于PDA平板，接种环 挑取黑曲霉ACCC 30583抱子，无菌水稀释成1 X IO8C化/血的悬液，1 % (V/V)接种量接种PD， 28°C，160rpm培养24小时后得种子液，再将种子液Wl%(V/V)接种量接种于装有50g黄巧药 渣粒度优化固体发酵培养基的500ml锥形瓶中28°C分别培养5天，收集培养容器内的所有物 质，得到黑曲霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物。每次重复设10个锥形瓶。
[0076] 按照实施例1步骤2的方法从黑曲霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物中提取黄巧甲 巧，按照实施例1步骤4的方法HPLC检测黄巧甲巧。结果表明黑曲霉ACCC 30583在黄巧药渣 的直径为0.8-1.2cm和黄巧药渣的直径为2mm至4mm的黄巧药渣粒度优化固体发酵培养基的 黄巧甲巧产量均较高，W干重计，每克黄巧药渣能产生0.624-0.673mg的黄巧甲巧(表4)。
[0077] 表4、黄巧药渣粒度对黄巧甲巧产量的影响
[0079] 5、发酵培养基含水量对黄巧甲巧产量的影响
[0080] 所用的含水量优化黄巧渣固体发酵培养基:直径为0.8-1.2cm的黄巧药渣10 . Og (^干重计），（畑4)25〇4 1.2旨，1(此？〇4 1.2旨，1旨5〇4*7此0 0.6旨，调整运些物料的含水量为 30 %、40 %、50%、60%、70%或80%，调整运些物料的抑值为7.0，12rC条件下灭菌20分钟， 得到含水量优化黄巧渣固体发酵培养基。每次重复设10个锥形瓶。
[0081] 实验重复3次，每次重复的方法如下:将黑曲霉ACCC 30583接种于PDA平板，接种环 挑取黑曲霉ACCC 30583抱子，无菌水稀释成1 X IO8C化/血的悬液，1 % (V/V)接种量接种PD， 28°C，ieOrpm培养24小时后得种子液，再将种子液Wl % (V/V)接种量接种于装有50g含水量 优化黄巧渣固体发酵培养基的500ml锥形瓶中28°C培养5天，收集培养容器内的所有物质， 得到黑曲霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物。
[0082] 按照实施例1步骤2的方法从黑曲霉ACCC 30583黄巧渣固体发酵物中提取黄巧甲 巧，按照实施例1步骤4的方法HPLC检测黄巧甲巧。结果表明黑曲霉ACCC 30583在含水量为 60%的含水量优化黄巧渣固体发酵培养基中发酵黄巧药渣的黄巧甲巧产量最高，W干重 计，每克黄巧药渣能产生〇.672mg的黄巧甲巧(表5)。
[0083] 表5、发酵培养基含水量对黄巧甲巧产量的影响
【主权项】
1. 制备黄芪甲苷的方法，包括用黑曲霉发酵黄芪药渣，得到黄芪药渣黑曲霉发酵物，从 所述黄芪药渣黑曲霉发酵物中提取得到黄芪甲苷。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用黑曲霉发酵黄芪药渣，得到黄芪药渣黑 曲霉发酵物的方法包括将所述黑曲霉接入含有黄芪药渣的发酵培养基中，培养得到黄芪药 渣黑曲霉发酵物。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述黑曲霉为黑曲霉ACCC 30583、黑曲 霉ACCC 30177或黑曲霉ACCC 30784。4. 根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于:所述含有黄芪药渣的发酵培养基按 照如下方法制备:将含水量为50%_60%的物料进行灭菌得到所述含有黄芪药渣的发酵培 养基;所述物料由下述质量份的原料组成：1〇质量份的黄芪药渣、0.03-0.12质量份的氮源、 1.2质量份的KH 2P〇4和0.6质量份的MgS〇4 · 7H20。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述氮源为尿素、KN〇3、（NH4)2S〇4、酵母粉、 牛肉膏或/和蛋白胨。6. 根据权利要求4-5中任一所述的方法，其特征在于:所述培养是在28°C培养5-8天或5 天。7. 用于制备黄芪甲苷的成套产品，包括权利要求1-3中任一所述方法中的所述黑曲霉 和权利要求2-5中任一所述方法中的所述含有黄芪药渣的发酵培养基;所述黑曲霉和所述 含有黄芪药渣的发酵培养基独立包装。8. 权利要求4或5所述方法中的所述含有黄芪药渣的发酵培养基。9. 黑曲霉在制备黄芪甲苷中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述黑曲霉为黑曲霉ACCC 30583、黑曲霉 ACCC 30177或黑曲霉ACCC 30784。
【文档编号】C12P33/20GK105861614SQ201610313391
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】顾金刚, 韩春阳, 陈华, 刘峰, 李世贵, 刘翠艳, 龚明波, 张瑞颖
【申请人】中国农业科学院农业资源与农业区划研究所