经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物芯片制作技术，具体是一种生物大分子(即DNA、RNA和蛋白质)高密度单分子芯片的制作方法。
【背景技术】
[0002]高密度生物大分子(DNA、RNA和蛋白质)单分子芯片，即每一个样点只有一个生物大分子，样点间距达到光学分辨率极限，可以实现单位面积的数据量最大化；各样点上的单分子，可通过分子生物学手段修饰后用作“诱饵”，捕获靶分子，既可用于分子间如抗原与抗体间的相互作用、DNA杂交检测单核苷酸多态性、拷贝数变异和比较基因组杂交芯片等，也可用于DNA合成法测序、连接法测序等，将第二代测序技术转换为第三代测序技术。但是，生物大分子单分子芯片的制作难度大，传统的方法采用稀释的生物大分子溶液铺设，有很大的随机性，有许多分子因相互重叠而无法观察；此外，基底上部分区域样点极少或没有样品，检测效率降低。迄今，还没有比较有效的高密度生物大分子单分子芯片制作技术。
[0003]经对现有文献检索发现，2010年，Complete Genomics (华大基因)公司在SCIENCE(第327卷，第78-81 页)发表了题为“Human Genome Sequencing Using UnchainedBase Reads on Self-Assembling DNA Nanoarrays”论文。该项技术将经滚环复制后形成的DNA纳米球样品固定到预先制备好的硅基阵列中，大大增加了芯片表面检测样点的密度，有效地提高了 DNA测序通量和试剂的使用效率。但是，滚环复制后进入阵列的DNA并非来自天然基因组的单拷贝片段，而是短片段的多重拷贝，也即该芯片不是真正意义上的单分子DNA芯片。本发明要解决的技术问题是指提供单分子状态的高通量生物芯片。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新的单分子芯片制作技术，即经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片，该方法可将单个生物大分子固定于纳米阵列，通过单分子样点的间距控制，建立高密度、多功能生物大分子的单分子芯片。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:在基底上铺设一层薄膜，再在薄膜上制备纳米坑阵列，经进一步基底修饰(02等离子体处理基底进行羟基化，再经修饰使之生物素化)，去除薄膜后形成可连接生物大分子的活性纳米点阵列，因纳米点足够小，只能连接一个生物大分子；最后清洗基底，获得高密度的单分子生物芯片。
[0006]所述方法具体按照如下步骤实施:
[0007]第一步，纳米阵列基底的制备:在洁净的基底上镀一层薄膜，厚度不超过I个生物大分子的直径；
[0008]第二步，纳米坑阵列的制备:刻蚀薄膜，直至基底暴露，制作出直径小于I个生物大分子的纳米坑阵列；
[0009]第三步，活性纳米点阵列的制备:通过化学方法修饰基底，使之各部分携带上活性基团A，去除薄膜后形成带活性基团A的纳米点阵列；
[0010]第四步，单分子生物芯片的制备:将携带可以与活性基团A发生连接反应的活性基团B的生物大分子，在连接溶液中与基底发生连接反应；因为纳米点的直径小于2个生物大分子，因此，各个纳米点只能连接I个生物大分子，反应完成后经清洗，获得高密度生物大分子单分子芯片。
[0011]优选地，所述的基底，可以采用常用的基底材料，包括但不限于石英，玻璃片，硅片，云母片等。
[0012]优选地，所述的薄膜，包括但不限于PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)光刻胶正胶、PMMA/MA共聚物正胶和LIGA正胶等材料。
[0013]优选地，所述的在基底上镀一层薄膜，可以采用旋涂光刻胶等方法，薄膜厚度不大于生物大分子的直径。
[0014]优选地，所述的纳米点，按照所制作的单分子生物芯片的要求，保证其直径小于I个生物大分子的直径，即单个活性纳米点中最多只能连接一个生物大分子。
[0015]优选地，根据需要，所述的纳米点中心间距可以< 1000纳米，这是根据所采用的荧光分子的波长而定，两个相邻的荧光分子有分辨率极限，当前的高分辨率光学显微镜的分辨极限为200纳米，随着科学技术进步，有了突破当前分辨极限的显微镜，本发明的纳米孔中心间距，还可以随之降低；本发明也可以制备纳米点中心间距超过1000纳米的阵列，但芯片上的样点量将大幅度下降，检测的信息量也会随之降低。
[0016]优选地，所述的生物大分子，可以是蛋白质的单体、二聚体和多聚体(包括抗体)，也可以是单个蛋白质携带单根核酸分子的复合物；所述核酸分子，可以是DNA，也可以是RNA0
[0017]优选地，所述的活性基团A与B，是指二者能够发生免疫绑定、直接或介导形成共价键的活性基团对，凡是能够实现该目的的活性基团对均可，包括但不限于:生物素-抗生物素蛋白、地高辛-抗地高辛抗体、氨基-环氧基、氨基-羧基(包括羧基的活化形式如琥珀酰亚胺碳酸酯等)、氨基-羰基、巯基-马来酰亚胺、巯基-环氧基、巯基-巯基、巯基-羰基、羧基-酰肼基、羰基-酰肼基等。
[0018]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:
[0019]与国内外同类芯片相比，本发明采用的制备工艺简单，适于大规模的单分子芯片制备，单分子样点间距可控，单分子连接效率接近100%。可用于超灵敏单分子酶联免疫吸附分析、基于杂交的DNA变异检测、单分子DNA合成和连接测序以及单细胞RNA测序等。
【附图说明】
[0020]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0021]图1为规则纳米点阵列的制备流程示意图。
【具体实施方式】
[0022]以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。全部实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例及附图所采用的方法。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造商所建议的条件进行。
[0023]以下实施例中，对于制备得到的生物大分子单分子芯片的检测:用荧光分子标记生物大分子，清洗后，在高分辨荧光显微镜下检测。当然，所述的用荧光分子标记生物大分子后检测，也可以在固定生物大分子前，用焚光分子标记生物大分子后检测。
[0024]单分子芯片的质量检测，可以采用荧光标记的方法在荧光显微镜下检测，也可以采用非荧光检测方法，如原子力显微镜检测。
[0025]实施例1
[0026]第一步，在Piranha溶液和无离子水清洗后的硅基底上旋涂厚度1nm的光刻胶PMMA0
[0027]第二步，用电子束光刻技术在底片光刻显影出30nm的纳米坑图形(纳米点直径控制在只能容纳I个核酸装载工具)，通过掩模版设计将纳米坑间距控制在500nm。
[0028]第三步，将显影后的基底用等离子体处理使硅表面羟基化；丙酮清洗基底去除PMMA薄膜，获得羟基化纳米点阵列。
[0029]第四步，用APTES溶液处理基底，使纳米点表面氨基化，清洗后用B1tin-NHS处理，使纳米点表面选择性生物素化。
[0030]第五步，通过免疫反应，将四聚体抗链霉生物素-单条DNA复合物固定到纳米点，因纳米点直径足