够小，位阻效应只允许连接一个复合物，因此，制备出的DNA阵列为高密度单分子DNA芯片。
[0031]实施效果:本实施例可获得使阵列中纳米坑的单分子DNA装载效率接近100%的高密度单分子芯片，样点间距约500nm。经进一步分子生物学处理，该芯片可用于单分子水平的连接测序、合成测序、比较基因组杂交和单核苷酸多态性检测等，四色荧光检测时，样点间距与光学检测极限相匹配。
[0032]实施例2
[0033]第一步，在现玻璃的云母基底上旋涂厚度1nm光刻胶PMMA/MA，使之不超过后续单个分子的直径。
[0034]第二步，采用电子束光刻，并显影实现直径小于20nm的纳米点阵列，通过掩模版设计将纳米坑间距控制在200nm。
[0035]第三步，将显影后的基底用O2等离子体处理使基底表面羟基化；丙酮清洗基底去除PMMA薄膜，获得羟基化纳米点阵列。
[0036]第四步，用APTES溶液处理基底，使纳米点表面氨基化，清洗后用B1tin-NHS处理，使纳米点表面选择性生物素化。
[0037]第五步，通过免疫反应，将四聚体抗链霉生物素-单条RNA复合物固定到纳米点，因纳米点直径足够小，位阻效应只允许连接一个复合物，因此，制备出的RNA阵列为高密度单分子RNA芯片。
[0038]实施效果:本实施例可获得使阵列中纳米坑的单分子RNA装载效率接近100%的高密度单分子芯片。该芯片经进一步分子生物学处理，可用于单分子水平的RNA测序、单细胞RNA测序、RNA-DNA杂交等，最近样点间距为200nm，单波长紫色荧光检测时，样点间距与光学检测极限相匹配。
[0039]实施例3
[0040]第一步，在清洗后的玻璃基底上旋涂厚度20nm的光刻胶LIGA薄膜。
[0041]第二步，用电子束光刻技术在底片光刻显影出直径为20nm的图形，通过掩模版设计将纳米坑间距控制在500nm。
[0042]第三步，将显影后的基底用O2等离子体处理使基底表面羟基化，丙酮清洗基底去除PMMA薄膜，获得羟基化纳米点阵列。
[0043]第四步，用APTES溶液处理基底，使纳米点表面氨基化，清洗后用B1tin-NHS处理，使纳米点表面选择性生物素化。
[0044]第五步，将与TNF-α (肿瘤坏死因子)绑定、标记有生物素的TNF-α单克隆抗体复合物固定到纳米点表面，纳米点的直径足够小，位阻效应只允许连接一个复合物分子，从而，获得高密度单分子芯片。
[0045]第六步，将荧光标记的TNF-α单克隆抗体与TNF-α纳米阵列作用，通过免疫反应而得到固定。冲洗后荧光显微镜检测。
[0046]实施效果:本实施例可获得使阵列中纳米坑的单个蛋白质分子装载效率接近100%的高密度单分子芯片，用于高通量单分子抗体筛选。
[0047]本发明获得的目的生物芯片是单分子、高通量、多功能的，未来可用于超灵敏单分子酶联免疫吸附分析、基于杂交的DNA变异检测、单分子DNA合成和连接测序以及单细胞RNA测序等领域。
[0048]尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到，上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
【主权项】
1.一种经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于包括如下步骤: 第一步，纳米阵列基底的制备:在洁净的基底上镀一层薄膜，厚度不超过I个生物大分子的直径； 第二步，纳米坑阵列的制备:刻蚀薄膜，直至基底暴露，制作出直径小于I个生物大分子的纳米坑阵列； 第三步，活性纳米点阵列的制备:通过化学方法修饰基底，使之各部分携带上活性基团A，去除薄膜后形成带活性基团A的纳米点阵列； 第四步，单分子生物芯片的制备:将携带可以与活性基团A发生连接反应的活性基团B的生物大分子，在连接溶液中与基底发生连接反应；因为纳米点的直径小于I个生物大分子，因此，各个纳米点只能连接I个生物大分子，反应完成后经清洗，获得高密度生物大分子单分子芯片。
2.根据权利要求1所述的经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于:所述纳米坑中心间距控制在< 1000纳米。
3.根据权利要求1所述的经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于:所述的纳米点，按照所制作的单分子生物芯片的要求，保证其直径小于I个生物大分子的直径，即单个活性纳米点中最多只能连接一个生物大分子。
4.根据权利要求1所述的经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于:所述的生物大分子是蛋白质的单体、二聚体或多聚体，或是单个蛋白质携带单根核酸分子的复合物；所述核酸分子是DNA或RNA。
5.根据权利要求1-4任一项所述的经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于:所述的活性基团A与B，是指二者能够发生免疫绑定、直接或介导形成共价键的活性基团对，凡是能够实现该目的的活性基团对均可。
6.根据权利要求1-4任一项所述的经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于:所述的活性基团A与B包括但不限于:生物素-抗生物素蛋白、地高辛_抗地尚辛抗体、氨基_环氧基、氨基_羧基、氨基_幾基、疏基_马来酰亚胺、疏基_环氧基、巯基-巯基、巯基-羰基、羧基-酰肼基、羰基-酰肼基。
7.根据权利要求1-4任一项所述的经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于:所述的在基底上镀一层薄膜，采用旋涂光刻胶方法，薄膜厚度不大于生物大分子的直径。
8.根据权利要求1-4任一项所述的经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于:所述的薄膜，其去除在步骤三进行，或者在单分子固定到活性纳米点之后进行。
9.根据权利要求1-4任一项所述的经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法，其特征在于:所述的单分子生物芯片的应用包括但不限于超灵敏单分子酶联免疫吸附分析、基于杂交的DNA变异检测、单分子DNA合成测序、连接测序或单细胞RNA测序。
【专利摘要】本发明公开一种经高密度纳米点阵列制备生物大分子单分子芯片的方法，首先在基底上铺设一层薄膜，再在薄膜上制备纳米坑阵列，经进一步基底修饰(O2等离子体处理基底进行羟基化，再经修饰使之生物素化)，去除薄膜后形成可连接生物大分子的活性纳米点阵列，因纳米点足够小，只能连接一个生物大分子；最后清洗基底，获得高密度的单分子生物芯片。本发明获得的目的生物芯片主要特征是单分子、高通量、多功能，可用于超灵敏单分子酶联免疫吸附分析、基于杂交的DNA变异检测、单分子DNA合成和连接测序以及单细胞RNA测序等领域。
【IPC分类】G01N33-68, C40B40-10, C40B50-18, C12Q1-68, C40B40-06
【公开号】CN104531853
【申请号】CN201410769264
【发明人】王志民, 程秀兰, 吕鹏雨, 杨秋萍, 王跃, 何珊珊
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月12日