一种鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢种群的微卫星标记方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产养殖中野生种群分子鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别闽江流域 野生河川沙塘鳢种群的微卫星标记方法。 技术背景
[0002] 河川沙塘體（Odontobutispotamophila)属隹卢形目（Perciformes)，沙塘體科 (Odontobutidae)，沙塘體属（Odontobutis)，俗称：浦鱼、虎头藍、土布鱼、虎头呆子等。在 我国广泛分布于长江中下游、闽江、钱塘江等水系，属于中国特有种。该鱼为淡水底栖小型 肉食性鱼类，肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，深受广大人们的喜爱。近些年，随着野生资源 的急剧衰退和市场需求的不断增长，河川沙塘鳢已发展成为一个非常具有潜力的水产养殖 新品种。目前全国已经零星开展了沙塘鳢的混养和套养，但产量还远不能满足市场的消费 需求。在生产该鱼苗种过程中，生产单位不注重该鱼种质资源管理，导致养殖成鱼发生生长 速度变慢、病害增加等种质退化现象。因此，为了解决河川沙塘鳢繁殖过程中种质退化的问 题，对其不同地理种群进行检测和遗传评估势在必行。目前，我国关于河川沙塘鳢的研宄主 要集中在基础生物学、繁殖生物学及养殖技术方面，而关于该鱼的种群鉴别研宄较少。为尽 快掌握该鱼种质资源状况，从而制定和实施更科学的渔业管理政策，如通过河川沙塘鳢不 同流域种群的家系建立进行遗传改良等，有必要对分布于我国各流域的河川沙塘鳢种群进 行鉴别。
[0003] 微卫星标记是一种常见的单序列重复片段（SSRs)或者是短期串联重复序列 (STR)，其中包括有1-6个碱基的碱基突变机制。不仅分布在非编码区，目前在多个功能基 因（如：人类胰岛素基因、人心肌肌动蛋白基因、a-珠蛋白基因）中同样也存在着不同程 度的重复序列。由于微卫星其高度多态、共显性、PCR检测方便、含量丰富、分布相对较均匀 等特点，在种群鉴定、群体遗传学、遗传图谱的构建、QTL作图和分子标记辅助育种等方面被 广泛的应用。目前，尚没有采用微卫星分子标记技术对河川沙塘鳢野生种群进行快速简便 的鉴别方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种快捷准确、简便有效的鉴别野生河川沙塘鳢种群的微 卫星标记方法
[0005] 本发明的基本原理是：（1)用高效磁珠富集法大量开发获得河川沙塘鳢的微卫星 标记；(2)从所开发引物中选取在河川沙塘鳢的安徽省当涂地区野生种群，江苏省射阳地 区野生种群，浙江省余姚地区野生种群和江苏省太湖东西山野生种群能够稳定扩增且具有 多态性的多对微卫星引物用于福建省闽江流域河川沙塘鳢野生种群的扩增；(3)筛选出在 福建省闽江流域河川沙塘鳢野生种群中亦能明显扩增，但扩增条带位置明显不同其他野生 地理种群的微卫星引物，用于鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢种群和其他野生种群。
[0006] 本发明所述的一种鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢种群的微卫星标记方法，包括以 下步骤：
[0007] 1)DNA提取：采用基因组DNA提取试剂盒提取河川沙塘鳢基因组DNA，并测定其纯 度和浓度，取A260/A280值为1. 6?1. 9,浓度为200?2000ng/yL的基因组DNA进行扩 增；
[0008] 2)DNA片段扩增：采用聚合酶链式反应扩增DNA片段，PCR反应的1对引物序列为：
[0009] 正向引物：5，-TRAMA-TTTATGGGTTCAGAAATGGG-3，（SEQIDNO. 1)，
[0010] 反向引物：5' -CAGTCACAAAGCAAGGCAC-3'（SEQIDNO. 2);
[0011] 反应体系20yL:
[0012]
【主权项】
1. 一种鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢种群的微卫星标记方法，其特征在于包括以下步 骤： 1. DNA提取：采用基因组DNA提取试剂盒提取河川沙塘鳢基因组DNA，并测定其纯度和 浓度，取A260/A280值为1. 6?1. 9,浓度为200?2000ng/ y L的基因组DNA进行扩增； 2. DNA片段扩增：采用聚合酶链式（PCR)反应扩增DNA片段，PCR反应的1对引物序列 为： 正向引物：5 ' -TRAMA-TTTATGGGTTCAGAAATGGG-3 '， 反向引物：5 ' -CAGTCACAAAGCAAGGCAC-3'; 3. PCR产物的电泳和微卫星带型分型：用ABI3500xl毛细管电泳进行基因分型检测； 4) 与DL2000Marker标准图谱进行对比：与标准图谱对比，读出待测样本的目的条带所 处的位置，如检测样本仅在靠近标准图谱259bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定为 是闽江河川沙塘鳢种群；检测样本仅在靠近标准图谱263bp、265bp位置扩增出1条或2条 特异性条带，则鉴定为是其他流域野生河川沙塘鳢种群。
2. 根据权利要求1所述的一种鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢的微卫星标记方法，其特 征在于：步骤2)中所述的PCR反应的程序为：94°C预变性5min，30个cycles，其中每个循 环包括94°C变性30sec，51°C退火35sec，72°C延伸50sec，最后72°C延伸5min，4°C保存。
3. 根据权利要求1所述的一种鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢的微卫星标记方法，其特 征在于：步骤2)中所述微卫星引物在正向引物Y端添加荧光标记TRAMA。
【专利摘要】本发明公开了一种鉴别闽江流域野生河川沙塘鳢种群的微卫星标记方法，包括河川沙塘鳢基因组DNA的提取、DNA片段扩增、PCR产物的电泳及微卫星位点带型分析等步骤。检测样本仅在靠近标准图谱259bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定为是闽江河川沙塘鳢种群；检测样本仅在靠近标准图谱263bp、265bp位置扩增出1条或2条特异性条带，则鉴定为是其他流域野生河川沙塘鳢种群。本发明操作简单快捷和准确，可以用于对闽江流域河川沙塘鳢种群的鉴定，从而对该流域的河川沙塘鳢种群的种质资源保护具有重要意义。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104531847
【申请号】CN201410758167
【发明人】尹绍武, 祝斐, 张国松
【申请人】南京师范大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月10日