一种鉴别河川沙塘鳢家系的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及鱼类分子标记及种质资源鉴定技术领域，具体设及一种鉴别河川沙塘 鱼豊家系的方法。
【背景技术】
[0002] 河川沙塘禮（Odontobutispotamo地ila)属驴形目（Perciformes)，沙塘禮科 (Odontobutidae)，沙塘禮属（Odontobutis)，俗称：浦鱼、±布鱼、虎头整、虎头呆子。在我 国广泛分布于长江中下游、钱塘江、闽江等水系，属于中国特有种。该鱼为淡水底栖小型肉 食性鱼类，肉质细嫩，系餐桌名肴，深受江浙沪等地人们的喜爱。目前全国已经零星开展了 河川沙塘禮的混养和套养，但在生产该鱼苗种过程中，生产单位不注重该鱼种质资源管理， 导致养殖成鱼发生生长速度变慢、病害增加等种质退化现象。良种问题已成为制约河川沙 塘鱼豊养殖业稳定发展的主要"瓶颈"之一。
[0003] 家系选育是加强河川沙塘禮良种选育的一种有效方式，在家系建立过程中需要根 据家系信息准确选留亲本，避免近交衰退现象的产生。但在河川沙塘禮实际的生产培育过 程中，为了减少管理强度、节约空间、减少成本，多采用不同家系混养的方式，运就不可避免 的产生了近亲交配，降低了子代的遗传多样性，使河川沙塘禮的生产性能降低。并且，随着 河川沙塘禮数量的减少，人们通过增殖放流的方式增加群体数量，通过人工培育的苗种进 行放流不可避免地降低了放流群体的遗传多样性，因此，对河川沙塘禮不同家系的亲缘关 系进行鉴别是河川沙塘禮良种选育及其种群数量增加的关键技术。
[0004] 在水产养殖中应用微卫星标记来鉴别家系、确定亲缘关系已经得到认同和关注， 微卫星DNA具有丰富的多态性和简单的遗传方式，在遗传多样性的维持、溯危物种的保护、 良种选育和基因作图等领域得到了广泛的应用。目前利用微卫星标记技术进行家系鉴别 及亲子鉴定已在对邮（Fenneropenaeuschinensis)、虹縛（Oncorhynchusmykiss)、大菱解 (Sco地thalmusmaximus)等水生生物中得到应用，而国内外关于河川沙塘禮的家系鉴别和 亲缘关系鉴定尚未见报道。因此，本发明通过对河川沙塘禮的不同家系进行鉴别及对亲缘 关系进行分析，有助于优化其人工繁殖，防止近亲衰退，不仅为河川沙塘禮养殖群体的系谱 建立及制定科学的种群遗传管理策略提供技术支持，也为今后河川沙塘禮的大规模家系鉴 别和亲子鉴定提供可靠的方法。
【发明内容】
阳〇化]本发明的目的在于通过微卫星分子标记技术，提供一种利用微卫星的多态性对不 同家系的河川沙塘禮进行家系鉴别的方法，为W后的河川沙塘禮的良种提供必要的技术支 持。
[0006] 一种鉴别河川沙塘禮家系的方法。所述方法按下列步骤进行：
[0007] 1、河川沙塘禮待测家系的建立及培育
[0008] 选取健康的河川沙塘禮亲鱼作为亲本进行家系繁育，剪取待测亲本和子代的尾罐 放于99%的无水乙醇中保存备用。
[0009] 2、河川沙塘禮待测家系亲本及子代个体DNA的提取
[0010] 使用上海捷瑞生物工程有限公司的细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，根据说明 书，提取待测家系亲本和子代DNA。DNAW1%的琼脂糖凝胶电泳检测（电压120V，电流 165A，时间22min)，挑选出条带亮且无明显降解的DNA，并置于-20°C保存。
[0011] 3、河川沙塘禮多态性微卫星引物的筛选及合成
[0012] 筛选出 12 个微卫星位点，分别为：E-0P64、E-0P87、E-0P140、E-0P142、E-0P146、 E-0P201、E-0P204、E-0P130、E-0P72、0P34a、0P13a和 0P155a，它们所对应的 12 对引物 序列分别是：SEQIDNO. 1-2,沈QIDNO. 3-4,沈QIDNO. 5-6,沈QIDNO. 7-8,沈QID NO. 9-10,沈QIDNO. 11-12,沈QIDNO. 13-14,沈QIDNO. 15-16,沈QIDNO. 17-18,沈Q IDNO. 19-20,SEQIDNO. 21-22,SEQIDNO. 23-24 ；
[0013] 4、河川沙塘禮亲本及子代微卫星引物扩增
[0014] W待测河川沙塘禮的亲本及子代DNA为模板对步骤3中筛选出来的E-0P64、 E-0P87、E-0P140、E-0P142、E-0P146、E-0P201、E-0P204、E-0P130、E-0P72、0P：Ma、0P13a、 0P155a共12个微卫星位点进行巧光PCR扩增。其中微卫星引物信息如表1所示。
[0015] 表1. 12个用于河川沙塘禮家系鉴定的微卫星引物信息
[0016]
[0017]
阳ο化]其中PCR所用的巧光通用引物核巧酸序列为：Μ13(-21): 5，-TGTAAAACGACGGCCAGT-3,（沈QIDNO. 25)。
[0019] 5、河川沙塘禮的家系鉴别及亲缘关系鉴定
[0020] 将步骤4中的PCR扩增产物经基因分析仪进行基因型分析，根据亲本和子代在各 位点的基因型，运用EXCELPOPGE肥1. 32和NTSYS软件进行聚类分析，鉴别各家系的亲缘关 系，并利用CERVUS3. 0软件对所选微卫星进行遗传多样性分析，对家系亲本和子代进行亲 缘关系分析。
[0021] 上述步骤4河川沙塘禮亲本及子代微卫星引物扩增，巧光PCR体系为12μL包含 (1地2〇6. 79μLMix3. 85μL浓度为10μmoL/L的巧光标记通用引物0. 16μL带有Μ13序 列的浓度为10μmoL/L的Ρ+引物0. 04μL浓度为10μmoL/L的Ρ-引物0. 16μLDNA模 板1. 0μL。其中Mix是上海捷瑞生物工程有限公司不含染料的PCRMix。
[0022] 步骤4河川沙塘禮亲本及子代微卫星引物扩增中，产物使用肥X、FAM、TAMRAΞ色 巧光标记，两种产物大小相差较大的可使用同种肥X巧光在基因分析仪的同一分析孔中进 行毛细管电泳。
[0023] 本发明具有W下积极效果：
[0024] 1、本发明首次将微卫星标记技术运用于河川沙塘禮的家系鉴别及亲缘关系鉴定， 为今后河川沙塘禮的遗传育种及种质鉴定提供必要的技术支持。
[00巧]2、本发明采用基因分型技术，读出河川沙塘禮个体的基因型数据，减少误差，确保 实验的正确率。 阳0%] 3、本发明不需要使用巧光等物理标记，避免物理标记对鱼生长的影响和对鱼体的 损伤，造成实验的误差。
【附图说明】
[0027] 图1是本发明中河川沙塘禮家系D及未知来源的个体聚类分析图（parentDl、 parentD2分别为家系D的父本和母本，D1-D10为家系D的子代，未知1、未知2为河川沙塘 鱼豊2个未知来源个体）；
[0028] 图2是本发明中7个家系分养子代群体和亲本聚类分析图（parentsA-parentsG 为A、B、C、D、E、F、G7个家系父母本，popA-popG为A、B、C、D、E、F、G7个家系对应子代群 体）；
[00巧]图3是本发明中7个家系混养子代和亲本聚类分析图（parentsA-parentsG为A、B、C、D、E、F、G7个家系父母本，1-100为100尾混养子代个体）。
【具体实施方式】
[0030] W下结合具体实例对本发明作进一步阐述，但本发明的作用不仅限于此。设及到 的具体参数为发明技术方案所需，不应理解为对本发明保护范围的限制。
[0031] 1、河川沙塘禮家系的繁育
[0032] 选取来自浙江建德、安徽当涂、江苏射阳和太湖四个不同地理群体的河川沙塘鱼豊 亲鱼作为繁殖亲本，按一雌一雄的交配方式进行两两组合建立全同胞家系，每个组合设3 个平行，共建立48个全同胞家系，记录每个家系的亲本交配方式及子代情况。随机选取其 中7个家系作为待测家系，剪取亲本尾罐样品放于99 %的无水乙醇中保存备用，并将运7个 家系的子代分开饲养，待其达到一定大小时从每个家系中取30尾子代个体，剪取其尾罐放 于99%的无水乙醇中保存备用，并将其余的7个家系子代混养后随机挑选100尾，剪取尾罐 放于99%的无水乙醇中保存备用。
[0033] 2、河川沙塘禮亲本和子代基因组DNA提取
[0034] 河川沙塘MDNA的提取采用上海捷瑞生物工程有限公司的细胞/组织基因组 DNA提取试剂盒，参照说明书提取，对提取的DNA样品W1 %的琼脂糖凝胶电泳检测（电压 120V，电流165A，时间22min)，邸染色并放在紫外凝胶成像系统下拍照，挑选出条带亮且无 明显降解的DNA，并置于-20°C保存。
[0035]3、河川沙塘禮多态性微卫星标记的筛选和引物合成
[0036] 河川沙塘禮家系鉴定所用的微卫星引物由本实验室自行开发，方法如下：首先利