用北京百泰克生物公司RNA提取试剂盒提取河川沙塘禮的RNA，并交给上海晶能生物公司 进行IllminaHiseq2000转录组高通量测序，采用To地at软件进行序列的组装和拼接，然 后用SSRHunt软件预测序列中可能存在的微卫星位点，利用Prime巧.0软件设计引物，并由 上海捷瑞生物公司合成其引物。挑选出多态性含量高且能稳定扩增的微卫星引物，由上海 捷瑞生物工程有限公司合成。共筛选出12对理想的微卫星引物，其信息如表2所示。
[0037] 表2 12个用于河川沙塘禮家系鉴定的微卫星引物信息
[0038]
[0040] 4、微卫星引物在家系亲本及子代中的扩增
[0041] 本发明采用一种经济的巧光标记PCR方法，PCR反应体系内包含3个引物：筛 选出来的SSR特异性正向引物，其5'端加有长为18bp的通用引物113(-21),其序列为 5' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3'；SSR特异性反向引物；肥X、FAM、TRAMERS种巧光标记的M13 通用引物。巧光标记PCR体系为12μL如表3所示。 阳0创表3巧光标记PCR体系
[0043]
[0044] PCR扩增的反应程序为：94°C预变性5min，接下来是30个循环，包括94°C变性 30s，退火45s，72°C延伸45s;然后是8个循环，包括：94°C变性30s，53°C退火45sW及72°C 延伸45s，最终在72°C延伸lOmin。
[0045] PCR反应结束后，产物用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测有单一条带后，用ABI3500xl 基因分析仪进行毛细管电泳，检测巧光信号并利用软件GENEMAmffiRl. 97分析各微卫星位 点的片段长度，建立一个小型的亲本及子代基因型数据库。 阳046] 实施例1
[0047] 将选取待测的7个家系编号为A、B、C、D、E、F、G，随机选取家系D的亲本及10个 子代个体，并选用2个未知来源的河川沙塘禮个体，记为未知1和未知2,按W上方法得出待 测个体的基因型bp数，并进行适当的人工校正，建立一个家系基因型信息表，表4为12对 引物在家系D个体间的基因型数据表。 W48] 表412对引物的基因型数据表 [0049]
阳化0]
[0051] 注：数字代表基因片段大小
[0052] 将基因型数据表转化成P0PGE肥1. 32软件所需的P0PGE肥格式，用P0PGE肥1. 32 软件对待测个体进行遗传距离分析，得出其遗传一致度，用EXC化对遗传一致度表格进行 转置并转化成NTSYS软件所需的TXT格式，用NTSYS软件根据遗传一致度对个体进行聚类 分析，得出聚类图，如为同一家系的亲本和子代，将聚类为同一支。图1为河川沙塘禮家系 D及未知来源的个体聚类分析图，由图可W看出，家系D的亲本和子代聚在一起，而两个未 知来源的个体各自单独聚在一支，运说明两个未知来源个体不属于家系D，与家系D的亲缘 关系较远，运和已知情况完全一致。因此，所选微卫星标记可W将非同一家系的个体区分开 来。 阳〇5引 实施例2
[0054] 随机选取7个家系的父母本和分养家系的子代，按W上方法得出亲本和各家系子 代的基因bp数，并进行适当的人工校正，建立一个家系基因型信息表，表5为12对引物在 部分个体间的基因型数据表。
[0055] 表5 12对引物的基因型数据表 [005Λ1
[0057]
[0058]注：数字代表基因片段大小
[0059] 按实施例1所示方法对7个家系的亲本和子代进行聚类分析，得出聚类图。图2 为7个家系的聚类情况，由聚类图可W看出，各家系的亲本和子代群体都正确的聚在一起， 运和已知的情况完全一致。因此，所选微卫星标记可W将各家系区分开来，并且将各家系子 代群体正确的分配到各家系中，聚类情况准确率为100%。 W60] 实施例3
[0061] 按实施例1所示方法，得到7个家系亲本及100尾混养子代的基因型数据，建立基 因型数据库，用P0PGE肥1. 32、EXC化和NTSYS软件对7个家系的亲本和混养子代进行聚类 分析，图3为聚类情况。由图可W看出，100个混养子代均能分配到某一亲本所在的家系中， 因此可W确定100个混养子代个体都可W找到其对应的父母。 阳ο创实施例4
[0063] 用CERVUS3. 0软件对7个家系的亲本和子代进行亲子鉴定分析，计算各微卫星位 点的等位基因频率、观测杂合度、期望杂合度、多态信息含量、平均排除概率等。表6为河川 沙塘禮12个微卫星位点遗传多样性信息及排除率情况。
[0064] 表6河川沙塘禮12个微卫星位点遗传多样性信息及排除率 阳0化]
阳066] 注：Κ为等位基因，Η(0)为观测杂合度，Η巧）为期望杂合度，PIC为多态信息含量，Excl(l)为双亲未知时的排除率，Excl(2)为已知单亲时的排除率，HW为哈迪溫伯格平衡检 巧。，**表示偏离显著，F(Null)表示无效等位基因频率。
[0067] 综上所述，本发明所选用的12对微卫星引物能够有效的实现对河川沙塘禮的 家系鉴别和亲子鉴定，该方法在已知信息的情况下，聚类情况和实际情况相比，准确率为 100%。对亲本和家系的亲子关系分析结果显示，累计排除率均达到99%。因此，本发明能 够满足河川沙塘禮的种质鉴定、增值放流的系谱追踪和家系管理的要求。
【主权项】
1. 一种鉴别河川沙塘鳢家系的方法，其特征在于包括以下5个步骤： (1) 河川沙塘鳢待测家系的建立及培育：选取健康的河川沙塘鳢亲鱼作为亲本进行家 系繁育，剪取待测亲本和子代的尾鳍放于99%的无水乙醇中保存备用； (2) 河川沙塘鳢待测家系亲本及子代个体DNA的提取； (3) 河川沙塘鳢多态性微卫星引物的筛选及合成：筛选出12个微卫星位点，分别为： E-0P64、E-0P87、E-0P140、E-0P142、E-0P146、E-0P201、E-0P204、E-0P130、E-0P72、0P34a、 0P13a和0P155a，它们所对应的12对引物序列分别是：SEQIDNO. 1-2，SEQIDNO. 3-4，SEQ IDNO. 5-6,SEQIDNO. 7-8,SEQIDNO. 9-10,SEQIDNO. 11-12,SEQIDNO. 13-14,SEQID NO. 15-16,SEQIDNO. 17-18,SEQIDNO. 19-20,SEQIDNO. 21-22,SEQIDNO. 23-24 ; (4) 河川沙塘鳢亲本及子代微卫星引物扩增：以步骤（2)提取的河川沙塘鳢的亲本及 子代DNA为模板，对步骤（3)中筛选出来的12个微卫星位点进行荧光PCR扩增； (5) 河川沙塘鳢的家系鉴别及亲缘关系鉴定：将步骤（4)中的PCR扩增产物经基因 分析仪进行基因型分析，根据亲本和子代在各位点的基因型，运用EXCEL、P0PGENE1. 32和 NTSYS软件进行聚类分析，鉴别各家系的亲缘关系，并利用CERVUS3. 0软件对所选微卫星进 行遗传多样性分析，对家系亲本和子代进行亲缘关系分析。2. 如权利要求1所述的鉴别河川沙塘鳢家系的方法，其特征在于，步骤（4)河川沙塘鳢 亲本及子代微卫星引物扩增，荧光PCR体系为12yL，包含ddH20 6. 79yL，Mix3. 85yL，浓 度为10μm〇L/L的荧光标记通用引物0· 16μL，带有M13序列的浓度为10μm〇L/L的P+引 物0. 04μL，浓度为10μmoL/L的P-引物0. 16μL，DNA模板1. 0μL。其中Mix是上海捷瑞 生物工程有限公司不含染料的PCRMix。3. 如权利要求1所述鉴别河川沙塘鳢家系的方法，其特征在于，步骤（4)河川沙塘鳢亲 本及子代微卫星引物扩增中，产物使用HEX、FAM、TAMRA三色荧光标记，两种产物大小相差 较大的使用同种HEX荧光在基因分析仪的同一分析孔中进行毛细管电泳。
【专利摘要】本发明涉及鱼类分子标记及种质资源鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别河川沙塘鳢家系的方法。该方法步骤包括：(1)河川沙塘鳢待测家系的建立及培育；(2)河川沙塘鳢待测家系亲本及子代个体DNA的提取；(3)河川沙塘鳢多态性微卫星引物的筛选及合成；(4)河川沙塘鳢亲本及子代微卫星引物扩增；(5)河川沙塘鳢的家系鉴别及亲缘关系鉴定。本发明可以准确而快速地对不同家系进行鉴别，对河川沙塘鳢进行亲子鉴定，有助于优化其人工繁殖，防止近亲衰退，不仅为河川沙塘鳢养殖群体的系谱建立及制定科学的种群遗传管理策略提供技术支持，也为以后河川沙塘鳢的大规模家系鉴别和亲子鉴定提供可靠的方法。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105331732
【申请号】CN201510884390
【发明人】尹绍武, 王佩佩, 丁严冬, 于兴达, 贾秀琪
【申请人】南京师范大学
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年12月4日