检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药的 试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 尽管结直肠癌的发病率和死亡率在全世界范围内存在很大差异，但在多数发达 国家，结直肠癌一直是第3位癌症相关的死亡原因。祀向表皮生长因子受体（Epidermal GrowthFactorReceptor,EGFR)的单抗如西妥昔单抗、帕尼单抗在RAS野生型的转移性结 直肠癌患者（mCRC)的治疗中可显著改善患者的生存，因此被推荐用于RAS野生型的mCRC 的治疗。尽管目前RAS基因检测已作为患者选择EGFR单抗的常规检测，仍有30-40 %的RAS 野生型患者对EGFR单抗治疗无效。更重要的是，绝大部分RAS野生型的患者在接受EGFR 单抗治疗后仍然会发生耐药。因此，在影像学确认治疗无效之前，及时监测耐药的发生，以 避免不必要的延长无效治疗，对指导EGFR单抗临床应用具有非常重要的意义。
[0003] 近期的研宄报道了EGFR信号通路下游的一系列基因，如BRAF、PIK3CA和PTEN可 能与EGFR单抗的耐药有关。但多个研宄得出了矛盾的结论，而且在耐药相关研宄中，传统 的方法是关注治疗前肿瘤组织中已有的体细胞突变，监测其在治疗过程中的变化，但这样 的策略可能忽略治疗过程中的新发突变，导致无法充分评估与耐药有关的基因突变。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种用于检测或辅助检测西妥昔单抗治疗转移性结直 肠癌耐药的试剂盒。
[0005] 本发明所提供的用于检测或辅助检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药的试 剂盒，具体含有用于检测PIK3CA基因第19外显子是否发生基因突变的物质。
[0006] 所述试剂盒中还可含有记载有如下内容的说明书：
[0007] 若作为待测者的拟接受西妥昔单抗治疗或正在接受西妥昔单抗治疗尚未发生耐 药的转移性结直肠癌患者的PIK3CA基因第19外显子发生了如下（a)-(e)突变中的至少一 种，则所述待测者在接受或继续接受西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌时会或候选会发生耐 药：
[0008] (a)所述PIK3CA基因编码蛋白的第944位氨基酸由赖氨酸突变为天冬酰胺 (K944N)；
[0009] (b)所述PIK3CA基因编码蛋白的第930位氨基酸由苯丙氨酸突变为丝氨酸 (F930S)；
[0010] (c)所述PIK3CA基因编码蛋白的第955位氨基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸 (V955I)；
[0011] (d)所述PIK3CA基因编码蛋白的第955位氨基酸由缬氨酸突变为甘氨酸 (V955G)；
[0012] (e)所述PIK3CA基因编码蛋白的第966位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸 (K966E)〇
[0013] 在本发明中，以上各突变对应于基因水平，具体体现为：
[0014] 所述（a)为所述PIK3CA基因第19外显子的第48位由A突变为T;
[0015] 所述（b)为所述PIK3CA基因第19外显子的第5位由T突变为C;
[0016] 所述（c)为所述PIK3CA基因第19外显子的第79位由G突变为A;
[0017] 所述（d)为所述PIK3CA基因第19外显子的第80位由T突变为G;
[0018] 所述（e)为所述PIK3CA基因第19外显子的第112位由A突变为G。
[0019] 其中，所述PIK3CA基因第19外显子（野生型）的核苷酸序列如序列表中序列1 所示。
[0020] 用于检测PIK3CA基因第19外显子是否发生基因突变的物质，在制备用于检测或 辅助检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药的试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范 围。
[0021] 在所述应用中，所述PIK3CA基因第19外显子的基因突变为如下中的至少一种：
[0022] (a)所述PIK3CA基因编码蛋白的第944位氨基酸由赖氨酸突变为天冬酰胺 (K944N)；
[0023] (b)所述PIK3CA基因编码蛋白的第930位氨基酸由苯丙氨酸突变为丝氨酸 (F930S)；
[0024] (c)所述PIK3CA基因编码蛋白的第955位氨基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸 (V955I)；
[0025] (d)所述PIK3CA基因编码蛋白的第955位氨基酸由缬氨酸突变为甘氨酸 (V955G)；
[0026] (e)所述PIK3CA基因编码蛋白的第966位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸 (K966E)〇
[0027] 在本发明中，以上各突变对应于基因水平，具体体现为：
[0028] 所述（a)为所述PIK3CA基因第19外显子的第48位由A突变为T;
[0029] 所述（b)为所述PIK3CA基因第19外显子的第5位由T突变为C;
[0030] 所述（c)为所述PIK3CA基因第19外显子的第79位由G突变为A;
[0031] 所述（d)为所述PIK3CA基因第19外显子的第80位由T突变为G;
[0032] 所述（e)为所述PIK3CA基因第19外显子的第112位由A突变为G。
[0033] 其中，所述PIK3CA基因第19外显子（野生型）的核苷酸序列如序列表中序列1 所示。
[0034] 在所述试剂盒，或所述应用中，所述用于检测PIK3CA基因第19外显子是否发生基 因突变的物质为引物对1和/或引物对2 ;
[0035] 所述引物对1为由序列表中序列2和序列3所示的两条单链DNA分子组成的引物 对；所述引物对2为由序列表中序列4和序列5所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
[0036]本发明借助深度测序技术，分析治疗前或治疗过程中血浆ctDNA的突变，希望藉 此对西安昔单抗耐药相关的突变有一个更综合的认识。最终确认了ctDNA中与西安昔单抗 的耐药显著相关的PIK3CA基因第19外显子的5种点突变，分别是K944N、F930S、V955I、 V955G和K966E。在全部32例继发耐药患者中，7例（21.9%)患者出现了PIK3CA突变，8例 (25% )患者出现KRAS突变，在12例原发耐药患者的治疗前血浆中，有5例出现了PIK3CA 突变。因此，PIK3CA基因突变对西妥昔单抗耐药的贡献与KRAS基因相似。体外实验表明， 与野生型的PIK3CA相比，PIK3CA突变体可显著促进下游信号AKT的磷酸化，并可导致结肠 癌细胞DiFi对西妥昔单抗耐药。本发明证实了PIK3CA基因突变是导致西妥昔单抗耐药的 重要因素；在耐药相关的基因突变研宄中，基于治疗前和治疗过程中系列血浆标本的目标 基因扩增子深度测序是可行且有效的方法。且PIK3CA基因突变的出现早于影像学评价的 耐药时间，这对于指导转移性结直肠癌患者的临床用药具有重要意义。
【附图说明】
[0037] 图1为ctDNA中的耐药相关突变在各个基因中的分布情况。
[0038] 图2为ctDNA中基因突变频率与影像学疗效评价和肿瘤标志物的动态趋势比较。 A为2号患者；B为12号患者；C为7号患者；D为17号患者。每个图的上半部代表结直肠 癌常用的肿瘤标志物CEA(ng/ml)、CA199(U/ml)在治疗过程中的动态变化，横坐标代表影 像学疗效评价结果：Baseline基线（治疗前），SD疾病稳定，PR部分缓解（有效），疾 病进展（耐药）。下半部代表ctDNA中检测到突变基因的百分率的动态变化，横坐标代表开 始治疗的天数，时间上与上半部横坐标一致。AF:突变基因的百分率。在影像学确定疾病进 展之前突变基因已经出现ctDNA中，并呈现上升趋势。
[0039] 图3为PIK3CA突变基因的蛋白结构建模。1，F930侧链可与Tyr836侧链形成JT 键相互作用；2，F930S突变后，该作用消失；3，K944侧链可与a调节亚单位的D464形成酸 碱吸引作用；4,K944N突变后，该作用消失，N944侧链可与a调节亚单位的N453、Q457和 R577侧链形成氢键相互作用，会造成PIK3CA在此处发生较大构象变化。5,V952和V955均 形成疏水侧链；6, 7,V952A和V955G突变均使相应位置的疏水侧链变小；8,V955I突变使相 应位置的疏水侧链变大；9,K966的碱性侧链可与E976、D891和D895的酸性侧链形成酸碱 吸引作用；10,K966E突变后，D1中的酸碱吸引作用变为相