反的排斥作用。
[0040] 图4为PIK3CA突变体对下游信号AKT和ERK1/2的磷酸化表达的影响。处理药物 分别为氟尿嘧啶（5-FU)和西妥昔单抗，+表示经过处理；-表示未经处理。
[0041] 图5为PIK3CA突变体对药物敏感性的影响。Mock为阴性转染细胞，E542K、E545K、 H1047R为文献报告的在肿瘤组织中检测到热点突变。L938*、V952A为本研宄在肿瘤组织中 检测到的突变。F930S、K944N、V955G、V955I、K966E突变型细胞的AKT磷酸化表达明显升 高，且不受西妥昔单抗或西妥昔单抗联合5FU的影响，ERK1/2磷酸化表达在西妥昔单抗作 用时未受影响，在两药联合作用时ERK1/2磷酸化表达略有降低，但仍比阴性转染细胞高。
【具体实施方式】
[0042] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0043] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0044] 实施例1、采用西妥昔单抗进行治疗发生耐药的转移性结直肠癌患者循环肿瘤DNA(ctDNA)中基因突变的筛选和确认 [0045] 一、供试患者及研宄样本的采集
[0046] 入选的患者为病理学证实的转移性结直肠癌，治疗前以直接测序法检测肿瘤组织 KRAS12、13密码子和BRAFV600E均为野生型，适合接受西妥昔单药土化疗的患者。这些 患者完成了至少4-6周的西妥昔单抗土化疗治疗，且经过CT检查并采用双盲方式评估肿 瘤大小，采用RECIST1.1进行疗效评价。在治疗前收集供试患者的肿瘤组织、全血细胞，用 于分析肿瘤相关的基因突变，同时收集治疗前、治疗过程中和发生耐药后患者的系列血浆 标本，用以分析ctDNA中肿瘤相关基因突变的动态变化。所有患者均签署知情同意书。无 进展生存期（PFS)多6周即判定为继发耐药的患者，PFS〈6周即为原发耐药。首先在继发 耐药的共32例患者中筛选耐药相关基因突变，然后到12例原发耐药患者中去验证，这些突 变是否也与原发耐药相关。32例供试继发患者中，共有20例收集到了治疗期间系列时间点 (每隔4周）的133份血浆标本，另外12例收集了至少包括治疗前和疾病进展（PD)后的 2-3个时间点的血浆共30份。12例原发耐药患者共收集了治疗前和/或治疗后的26份血 浆标本。
[0047] 二、循环肿瘤DNA(ctDNA)中基因突变的筛选和确认
[0048] 1、样品处理和扩增子测序
[0049] 从肿瘤组织、全血细胞和血浆标本中提取DNA并定量，对如下的目标基因进行扩 增子深度测序：NRAS基因（外显子2、3和4)、KRAS基因（外显子2、3和4)、BRAF基因（外 显子15)、PIK3C基因（外显子8和19)、AKT1基因（外显子3)、TP53基因（外显子5、6和 7)、PTEN基因（外显子5、7和8)和EGFR基因（外显子10和12)。对于PIK3CA基因，因为 在既往研宄中发现外显子9和20中的热点突变与EGFR单抗耐药无关，因此，本发明选择了 检测外显子8和19。外显子8编码部分细胞膜结合区，外显子19与外显子20相似，编码部 分活化环和ATP结合口袋。与热点突变相似，PIC3CA的这些部分的突变也会导致酶的结构 性活化。
[0050] 针对目标基因片段设计扩增子引物，总共41对引物（见表1)，分为2个引物池。以 lOngDNA上样进行PCR扩增，之后经末端修复、连接（加接头）、PCR扩增，完成扩增子文库的 构建。经过纯化和定量后，采用2100生物分析仪（Agilent公司）进行毛细管电泳确定片段 长度和浓度，最后建库产物统一稀释为26pM上机测序。测序使用Life公司ProtonSystem 的IonProton平台（CatNo. 4476610,IonPISequencing200Kitv3CatNo. 4488315)或 PGM平台（CatNo. 4462921，Ion318?ChipKitCatNo. 4466617)。测序深度在肿瘤组织和 全血细胞为1000X，血浆标本为10000X。
[0051] 表1针对不同目标基因片段的扩增子引物序列
[0052]
【主权项】
1. 一种用于检测或辅助检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药的试剂盒，含有用于 检测PIK3CA基因第19外显子是否发生基因突变的物质。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有记载有如下内容 的说明书： 若作为待测者的拟接受西妥昔单抗治疗或正在接受西妥昔单抗治疗尚未发生耐药 的转移性结直肠癌患者的PIK3CA基因第19外显子发生了如下（a)-(e)突变中的至少一 种，则所述待测者在接受或继续接受西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌时会或候选会发生耐 药： (a) 所述PIK3CA基因编码蛋白的第944位氨基酸由赖氨酸突变为天冬酰胺； (b) 所述PIK3CA基因编码蛋白的第930位氨基酸由苯丙氨酸突变为丝氨酸； (c) 所述PIK3CA基因编码蛋白的第955位氨基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸； (d) 所述PIK3CA基因编码蛋白的第955位氨基酸由缬氨酸突变为甘氨酸； (e) 所述PIK3CA基因编码蛋白的第966位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于： 所述（a)为所述PIK3CA基因第19外显子的第48位由A突变为T ; 所述（b)为所述PIK3CA基因第19外显子的第5位由T突变为C ; 所述（c)为所述PIK3CA基因第19外显子的第79位由G突变为A ; 所述（d)为所述PIK3CA基因第19外显子的第80位由T突变为G ; 所述（e)为所述PIK3CA基因第19外显子的第112位由A突变为G。
4. 用于检测PIK3CA基因第19外显子是否发生基因突变的物质，在制备用于检测或辅 助检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药的试剂盒中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述PIK3CA基因第19外显子的基因突 变为如下中的至少一种： (a) 所述PIK3CA基因编码蛋白的第944位氨基酸由赖氨酸突变为天冬酰胺； (b) 所述PIK3CA基因编码蛋白的第930位氨基酸由苯丙氨酸突变为丝氨酸； (c) 所述PIK3CA基因编码蛋白的第955位氨基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸； (d) 所述PIK3CA基因编码蛋白的第955位氨基酸由缬氨酸突变为甘氨酸； (e) 所述PIK3CA基因编码蛋白的第966位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于： 所述（a)为所述PIK3CA基因第19外显子的第48位由A突变为T ; 所述（b)为所述PIK3CA基因第19外显子的第5位由T突变为C ; 所述（c)为所述PIK3CA基因第19外显子的第79位由G突变为A ; 所述（d)为所述PIK3CA基因第19外显子的第80位由T突变为G ; 所述（e)为所述PIK3CA基因第19外显子的第112位由A突变为G。
7. 根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，或权利要求4-6中任一所述的应用，其特征 在于：所述用于检测PIK3CA基因第19外显子是否发生基因突变的物质为引物对1和/或 引物对2 ; 所述引物对1为由序列表中序列2和序列3所示的两条单链DNA分子组成的引物对； 所述引物对2为由序列表中序列4和序列5所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药的试剂盒。该试剂盒含有用于检测PIK3CA基因第19外显子基因突变的物质，还可含记载有如下内容的说明书：若作为待测者的拟接受西妥昔单抗治疗或正在接受西妥昔单抗治疗尚未发生耐药的转移性结直肠癌患者的PIK3CA基因第19外显子发生了K944N、F930S、V955G、V955I和K966E突变中的至少一种，则所述待测者在接受或继续接受西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌时会或候选会发生耐药。实验证明，PIK3CA的第19外显子突变与KRAS突变一样，在西妥昔单抗的继发耐药中发挥着重作用，本发明对于临床上检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药具有重要意义。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104531854
【申请号】CN201410779781
【发明人】徐建明, 王岩, 王焱
【申请人】中国人民解放军第三〇七医院
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月16日