专利名称：修饰的硫氧还蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及能调控由体内的内源和/或外源因子导致的异常的细胞生长和/或细胞功能的硫氧还蛋白(称作“TRX”)修饰蛋白，和基本上最小化的肽，编码修饰的蛋白和基本上最小化的肽的DNA，包含该DNA的重组表达载体，以该DNA转化的DNA，生产修饰的TRX蛋白和基本上最小化的肽的方法，以及包含修饰的TRX蛋白和/或基本上最小化的肽的药物或药物组合物。
背景技术：
硫氧还蛋白是12kD的小的多功能蛋白，在其活性位点序列-Cys-Gly-Pro-Cys(“细胞激活的氧化还原调控”，Ann.Rev.Immunol.1997；15351-369)中具有氧化还原活性的二硫键/二巯基。硫氧还蛋白自从大肠杆菌(Escherichia coli)中作为重要的合成脱氧核糖核苷酸的酶，核糖核苷酸还原酶的氢供体而分离之后，其已经从各种原核的和真核的生物中分离和鉴定到。成年T细胞白血病衍生因子(ADF)已首先被本发明人鉴定为感染HTLV-1的T淋巴细胞产生的IL-2受体诱导因子，并且是人硫氧还蛋白。细胞内硫氧还蛋白对清除自由基和调控用于氧化还原的转录因子例如活化蛋白-1和核因子-κB(“AP-1转录活性受硫氧还蛋白和Ref-1之间的直接联系而调控”1997；943633-3638)起着重要作用。此外，人硫氧还蛋白控制p38有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和凋亡信号调控激酶(ASK-1)的信号传导。
同时，我们已经报道硫氧还蛋白被释放到细胞外并作为细胞因子或趋化因子，但其作用机制还不知道。尚未有关细胞外TRX被内吞到细胞中和通过修饰TRX活性位点产生比野生型TRX高得多的细胞内吞活性的报道。
本发明分析TRX的细胞内调控活性和细胞内吞活性，并打算提供基于活性的修饰的TRX和生产修饰的TRX的方法。
附图简述
图1显示实施例2的流式细胞分析的结果。
图2显示实施例2的流式细胞分析的结果。
图3显示实施例2的Western印迹的结果。
图4显示实施例3的凋亡分析的结果。
图5显示使用闪烁计数器测量3H-胸腺嘧啶吸收量的结果。
图6显示实施例4中增强效果-1对抗癌剂作用的结果。在图6中，CDDP(-)和CDDP(+)分别表示3μg/mL顺铂不存在或存在。TRX-WT，TRX-CS和TRX-C35S分别表示野生型硫氧还蛋白，两个位置C32S和C35S修饰的硫氧还蛋白，和C35S修饰的硫氧还蛋白。在CDDP(-)，TRX-C35S中死亡的细胞与4％(TRX-WT)，和3％(TRX-CS)增加大约4倍。在CDDP(+)(3μg/mL)，TRX-C35S中死亡的细胞(26％)与5％(TRX-WT)或13％(TRX-CS)比较增加大约5或2倍。
图7显示实施例4中增强效果-2对抗癌剂作用的结果。在图7中，CDDP，rec(-)和rec(+)分别表示顺铂，重组硫氧还蛋白(C35S-TRX)不存在或存在。右上象限代表双阳性，其是表示细胞死亡的区域(具有抗癌效果的区域)。例如，当用C35S-TRX处理1小时后，在存在10μg/mL C35S-TRX的CDDP(3μg/mL)的情况下双阳性细胞从10％提高2倍到22％。在CDDP(6μg/mL)中，双阳性细胞从18％提高4倍到76％。此外，当用C35S-TRX处理1小时后，在存在10μg/mLC35S-TRX的CDDP(3μg/mL)的情况下双阳性细胞从7％提高4.7倍到33％。在CDDP(6μg/mL)，双阳性细胞从23％提高3倍到70％。
发明内容
本发明人详细分析TRX的细胞内调控活性和细胞内吞活性，并最后成功鉴定细胞外的人重组野生型TRX的内吞活性。此外，他们成功制备了基于活性的修饰的TRX。就是说，本发明的主题如下1.包含以下多肽之一的人修饰的硫氧还蛋白(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸残基被另外的氨基酸取代的氨基酸序列的多肽；(b)具有SEQ ID NO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸残基被化学修饰的氨基酸序列的多肽；(c)具有SEQ ID NO2氨基酸序列中除32和35位之外，优选SEQ ID NO2氨基酸序列中除32到35位之外的位置存在一个或多个取代，缺失，插入或添加的氨基酸的氨基酸序列，并具有诱导凋亡活性的多肽；和(d)由编码在SEQ ID NO2氨基酸序列中半胱氨酸被其他的氨基酸取代的修饰的人氧还蛋白的DNA或能够与其互补链在严格条件下杂交的DNA编码的多肽。
2.根据第1项的人修饰的硫氧还蛋白，其中所述另外的氨基酸残基是丝氨酸。
3.由下列任何DNA构成并编码具有诱导凋亡活性的人修饰的硫氧还蛋白的基因(1)编码多肽的多核苷酸，或该多核苷酸的互补链，该多肽具有在氨基酸SEQ ID NO2氨基酸序列中35位半胱氨酸残基被另外的氨基酸取代，并此外在SEQ ID NO2氨基酸序列中除32和35位以外，优选除32到35位以外的位置存在一种或者多种取代，缺失，插入或增加的氨基酸的氨基酸序列，并具有诱导细胞凋亡活性；和(2)编码在SEQ ID NO2氨基酸序列35位的半胱氨酸残基被另外的氨基酸取代的人修饰硫氧还蛋白的DNA，或能够与上述DNA的互补链在严格条件下杂交并编码具有细胞凋亡活性的多肽的DNA。
4.以可表达方式引入第3项的基因的重组表达载体。
5.用第4项的表达载体转化的转化子。
6.用于生产具有诱导细胞凋亡活性的多肽的方法，所述方法包括培养第5项的转化子。
7.一种用于生物活性物质的细胞内吞的多肽，包括-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列。
8.包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽在用于生物活性物质的细胞内吞。
9.生产能够被内吞到细胞中的生物活性物质复合物的方法，该方法包括将生物活性物质结合到包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽。
10.能够被内吞到细胞中的生物活性物质复合物，其中生物活性物质结合到包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽。
11.第10项的复合物，其中包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的35位半胱氨酸残基被另外的氨基酸取代的氨基酸序列的多肽。
12.第10或11项的复合物，其中上述生物活性物质是蛋白或多肽。
13.生产能够被内吞到细胞中的多肽复合物的方法，该方法包括培养转化有重组载体的转化子，该重组载体具有编码复合物的多肽，复合物中生物活性多肽已经结合到包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽。
14.包含第1或2项的修饰的硫氧还蛋白抗癌剂。
15.包含第1或2项的修饰的硫氧还蛋白抗癌增强剂。
16.包含第1或2项的修饰的硫氧还蛋白和另外的抗癌剂的抗癌剂组合物。
17.治疗癌症的方法，该方法包括给药第1或2项的修饰的硫氧还蛋白，如果需要，与另外的抗癌剂一起给药到患癌症的病人。
18.包含第10到12项任意一项的复合物，和如果需要，包括药物可接受的载体，赋形剂或稀释剂的药物或药物组合物。
本发明将在下文中更详细描述。
人硫氧还蛋白(hTRX)这里表示包含SEQ ID NO2代表的105个氨基酸的多肽。
本发明的hTRX属于硫氧还蛋白超家族，和作为示例的是那些在其活性中心具有-Cys-Gly-Pro-Cys-，-Cys-Pro-Tyr-Cys-，-Cys-Pro-His-Cys-，或-Cys-Pro-Pro-Cys-的多肽。其中，活性中心具有-Cys-Gly-Pro-Cys-序列的硫氧还蛋白是优选的。
在本发明的第一个实施方案中，已经发现通过将35位的半胱氨酸转化为另外的氨基酸制备修饰的TRX而表达诱导凋亡活性和抑制细胞生长活性，修饰的TRX有效用作抗癌剂。
本发明的第二个实施方案基于以下的发现，即通过或是将半胱氨酸残基转化为另外的氨基酸以进行修饰或化学修饰半胱氨酸残基(具体是巯基残基)以制备修饰的TRX使得修饰的TRX的细胞内吞急剧增加，并且第一次显示促进细胞内吞效应的实体基于由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸或化学修饰的半胱氨酸)代表的氨基酸序列。
TRX的上述活性位点C端35位的Cys可以用19个氨基酸(Gly，Ala，Met，Ser，The，Lys，Arg，His，Val，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Gly，Asp，Gln，Asn)任一取代，并优选用Ser取代。
化学修饰的半胱氨酸包括那些半胱氨酸的巯基(SH)基团被SR(R是任意有机基团，其包括，例如，具有1-18碳原子的直链或支链烷基，具有2-18碳原子的直链或支链烯基，具有2-18碳原子的直链或支链炔基，具有2-18碳原子的直链或支链烷氧基烷基，具有1-18碳原子的直链或支链羟烷基，具有1-18碳原子的酰基，具有6-18碳原子的芳基，具有7-18碳原子的芳烷基等，这些基团可以用取代基例如卤原子，羟基，硝基，氨基，单烷基氨基，二烷基氨基，甲氧基，羧基或酯基团取代)代表的基团取代的化学修饰。这样化学修饰的TRX可以使用公知的方法容易地合成。
本发明优选的修饰的硫氧还蛋白和编码修饰的硫氧还蛋白的基因显示于SEQ ID NO11。
已经发现本发明修饰的硫氧还蛋白表达诱导凋亡活性和抑制细胞生长活性，并有效用作抗癌剂。
此外，本发明修饰的硫氧还蛋白能通过与其他的抗癌剂组合而增强抗癌效果。具体地，修饰的硫氧还蛋白通过以小于抗癌有效量的浓度与抗癌剂组合而诱导抗癌效果，增强抗癌剂的效果，并降低副作用。
效果被上述组合增强的抗癌剂包括阿霉素，甲氨蝶呤，紫杉酚，5-氟脲嘧啶，长春碱，长春新碱，丝裂霉素，顺铂，道诺霉素，依托泊甙，泰索帝等。
本发明修饰的硫氧还蛋白和抗癌剂可以同时给药或可以分开给药。
本发明一个优选的实施方案涉及治疗癌症的方法，其中给药修饰的硫氧还蛋白和抗癌剂。
能够被治疗的癌症不是具体限定的，包括胃癌，结肠癌，直肠癌，肝癌，胆囊/胆管癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，膀胱癌，宫颈癌等。
包含本发明的修饰的硫氧还蛋白的抗癌剂的治疗有效量为每个成年癌症患者每天大约0.01到100mg，当用作抗癌增强剂时治疗有效量为大约0.001到10mg。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明修饰的硫氧还蛋白可以基于SEQ ID NO2的人硫氧还蛋白通过公知的基因工程技术而制备。所述修饰的蛋白在SEQ ID NO2氨基酸序列中除32和35位之外，优选除32到35位之外的位置，具有一个或多个取代，缺失，添加或插入的氨基酸，并具有诱导凋亡活性。这样的突变(取代，缺失，添加和插入)包括人工的突变和天然发生的突变(如，等位基因)。产生人工突变的方法可以包括，但不限于，定点突变(Nucleic Acids Res.10，6487-6500，1982)等。只要不丢失诱导凋亡活性，突变的氨基酸的数目不受限制，但优选在20个氨基酸，更优选在15个氨基酸，再优选在10个氨基酸和最优选再5个氨基酸范围内。
在本发明另一个优选的实施方案中，包括编码修饰的人硫氧还蛋白的DNA，该蛋白在SEQ ID NO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸残基被另外的氨基酸取代，或能够与其互补链在严格条件下杂交并编码具有诱导凋亡活性的多肽的DNA，以及DNA编码的蛋白具有诱导凋亡活性。
“严格条件”这里指只发生特异性杂交而没有非特异性杂交的条件。这样的条件通常是等同于大约“1×SSC和0.1％ SDS在37℃”的条件，优选大约“0.5×SSC和0.1％ SDS在42℃”，和更优选“0.2×SSC和0.1％ SDS在65℃”。本发明的DNA通常与编码35位被突变的本发明多肽的DNA(如，SEQ ID NO11描述的DNA)具有高同源性。高同源性指同源性为75％或更多，优选90％或更多，更优选95％或更多和特别是99％或更多。
本发明的蛋白可以通过将后面所述的本发明的基因掺入到表达载体中并在合适的宿主细胞中表达而获得。作为载体，有可能合适地选择并使用那些公知的载体，例如pTrc-HisA等。宿主细胞包括真核细胞如哺乳动物细胞和酵母细胞，以及原核细胞如大肠杆菌(Escherichiacoli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，藻类和真菌的细胞，可以使用其中任意的成员。
无需受理论的限制，相信修饰的TRX表达诱导凋亡活性或抑制细胞生长活性，因为当35位Cys被另外的氨基酸例如Ser取代后，修饰的TRX作为TRX的拮抗剂起作用。
此外，据信在35位Cys被另外的氨基酸例如Ser取代的修饰的TRX以32位Cys结合到细胞表面，由于在35位没有Cys而在35位不结合到细胞表面，结果修饰的TRX被迅速内吞到细胞中。该机制还得到以下事实的支持，即所有Ser32修饰的TRX(35位Cys；SEQ IDNO14)，Ser32Ser35修饰的TRX(SEQ ID NO13)和野生型TRX(32和35位Cys；SEQ ID NO2)很少被内吞到细胞中。
就是说，很明显Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列，尤其是Cys-Gly-Pro-A(A同上)在将生物活性物质内吞到细胞中起着引导肽的作用，并且有可能通过四肽结合到生物活性物质将很难内吞到细胞内的生物活性物质内吞。
这里的“修饰的TRX”用于表示包含变体和修饰物的术语。
生物活性物质包括被内吞而作用的药物化合物，寡肽，多肽，单糖，二糖或多糖，脂等，优选示例药物化合物，寡肽和多肽(包括糖蛋白)。有可能通过包含上述四肽的合适的序列结合到引导肽的N或C末端而增强对靶细胞的选择性。示例的药物化合物如生物活性物质，抗癌剂，抗病毒剂等。示例的生物活性肽如酶，抗体，激素等。
本发明的引导肽如果需要可以通过间隔肽结合到生物活性物质。例如，当生物活性物质是多肽，上述引导肽通过间隔肽结合到生物活性多肽而形成复合物，并且有可能通过将编码复合物的DNA引入到合适的重组载体中，转化宿主细菌例如大肠杆菌，动物细胞例如CHO，或酵母，并培养转化子而制备复合物。
通过引入细胞内可切除的短链肽作为间隔，有可能细胞内引入生物活性物质，尤其是生物活性寡肽或多肽。这样的可切除的肽包括-AYVHDAPVK-，其是人前白介素1β(pro-IL-1β)切割位点被半胱氨酸蛋白酶(caspase)-1特异性切割的序列，和-GDEVDGVK-，其是人聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)切割位点被半胱氨酸蛋白酶-3和-7等切割的序列。
本发明最佳实施方案本发明参照以下实施例以更多细节进行描述，但这些例子仅表示示例的目的，而不是将本发明的范围进行限制。
重组野生型TRX和修饰的TRX的生产1.大肠杆菌(E.coli)表达系统构建通过取代SEQ ID NO1的TRX基因对应位置的核苷酸，使TRX多肽的32和/或35位半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代。在32位用丝氨酸残基取代了半胱氨酸残基的基因变体(TRX-C32S；SEQ ID NO14)通过将人TRX基因(SEQ ID NO1)插入载体pcDNA3.1的质粒DNA作为模板，使用引物5′-GGA TCC GTG AAG CAG ATC GAG AGC AAG-3′(SEQ ID NO3)和5′-CTT GAT CAT TTT GCA AGG CCC AGA CCA-3′(SEQ ID NO5)以及引物5′-GTC GAC TTA GAC TAA TTC ATTAAT GGT GGC-3′(SEQ ID NO4)和5′-TGG TCT GGG CCT TGCAAA ATG ATC AAG-3′(SEQ ID NO6)的PCR而得到。随后，扩增的两条DNA片段等量混合，并添加引物5′-GGA TCC GTG AAG CAGATC GAG AGC AAG-3′(SEQ ID NO3)和5′-GTC GAC TTA GAC TAATTC ATT AAT GGT GGC-3′(SEQ ID NO4)，然后通过PCR扩增全长TRX-C32S。PCR以循环条件95℃ 1分钟，56℃ 1分钟退火，和72℃ 2分钟延伸来进行。相似的，在TRX35位用丝氨酸残基取代半胱氨酸残基的基因变体(TRX-C35S；SEQ ID NO12)或在TRX的32和35位用丝氨酸残基取代半胱氨酸残基的基因变体(TRX-C32S/C35S；SEQID NO13)使用引物5’-CTT GAT CAT TTT GGA AGG CCC ACACCA-3’(SEQ ID NO7)和5’-TGG TGT GGG CCT TCC AAA ATGATC AAG-3’(SEQ ID NO8)或5’-TGG TCT GGG CCT TCC AAA ATGATC AAG-3’(SEQ ID NO9)和5’-CTT GAT CAT TTT GGA AGG CCCAGA CCA-3’(SEQ ID NO10)代替用于制备TRX-C32S基因的引物通过PCR来制备。野生型TRX(TRX-WT)通过用人TRX cDNA(SEQ IDNO1)已经被插入到载体pcDNA3.1中的质粒DNA作为模板使用引物5′-GGA TCC GTG AAG CAG ATC GAG AGC AAG-3′(SEQ ID NO3)和5′-GTC GAC TTA GAC TAA TTC ATT AAT GGT GGC-3′(SEQ IDNO4)通过PCR扩增全长TRX-WT而获得。通过PCR扩增的TRX-WT，TRX-C32S，TRX-C35S或TRX-C32S/C35S的DNA片段被连接到TOPO克隆载体(购自Invitrogen)并随后引入到E.coli宿主细胞中。从转化的克隆中收集质粒DNA，通过DNA测序鉴定插入的DNA的序列。随后，质粒DNA用限制性内切酶BamHI和SalI切割，得到的片段连接到添加组氨酸标记的重组蛋白表达载体pQE80L(购自Qiagen)，然后转化E.coli宿主细胞XL-1Blue。
2.产生重组TRX野生型或修饰的TRX的E.coli细胞的培养转化有质粒DNA pQE80L的E.coli细胞在预培养后被接种到3Lterrific broth液体培养基(BRL)(含100μg/mL氨苄青霉素)中，并培养4小时，该质粒中已经插入了TRX野生型基因或修饰的TRX基因。随后，添加IPTG到终浓度1mM，培养物被继续培养2到4小时。
3.重组TRX野生型和修饰的TRX的纯化收集的细胞被悬于含2mM溶菌酶的裂解缓冲液(蛋白酶抑制剂，0.8mM咪唑，2-巯基乙醇)，使用超声仪破碎。在15,000rpm离心30分钟后，收集上清，并上样到用PBS平衡的Ni琼脂糖柱上(Qiagen提供)(Ni柱已事先替换过PBS)。在上样后，柱用含20mM咪唑的PBS洗涤，并用含80mM咪唑的PBS洗脱。洗脱的样品溶液使用PD-10柱替换为PBS溶液。
重组TRX野生型或修饰的TRX内吞到培养的细胞中1.与细胞结合的能力终浓度为1μg/ml的荧光标记的TRX-WT，TRX-C35S或TRX-C32S/C35S被添加到5×105HTLV-1感染的人T细胞系ATL2的细胞中，在4℃孵育30分钟，然后用缓冲液(0.1％含叠氮钠的磷酸盐缓冲液)洗涤用于流式细胞技术。进行流式细胞技术的分析(图1)。结果，鉴定到只有TRX-C35S能结合到细胞。还鉴定到该结合被过量共存的TRX-WT所抑制(图2)。
2.细胞内吞组氨酸标签的重组蛋白，TRX-WT，TRX-C35S或TRX-32S/C35S以终浓度10μg/mL添加到ATL2细胞中，并在4℃或37℃温育一小时。随后，收集细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤，然后1×107细胞被悬浮在低渗的缓冲液中，并通过氮气细胞匀浆器(购自Pearl)而破裂。在1,000g离心之后，收集上清，并通过在10,000g离心收集上清的胞质溶胶级分。胞质溶胶级分通过Western印迹法使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和抗-TRX单克隆抗体分析(图3)。结果，鉴定在胞质溶胶级分只检测到TRX-C35S。
TRX野生型或修饰的TRX的生物活性1.诱导细胞凋亡活性其中已经引入TRX-WT，TRX-C35S或TRX-C32S/C35S基因的人T细胞系Jurkat，在无血清RPMI培养基中培养72小时以分析诱导的细胞凋亡(图4)。结果，与已经引入TRX-WT或TRX-C32S/C35S的Jurkat细胞相比较，具有细胞内高表达TRX-C35S的Jurkat细胞的细胞凋亡被进一步促进。
2.抑制细胞生长的活性5×105人外周血单核细胞被悬浮在1ml含有10％胎牛血清的RPMI培养基中，然后加入终浓度28ng/ml的pHA和10μg/mL的TRX-WT，TRX-C32S/C35S或TRX-C35S，并进行培养。96小时后，添加3H-胸腺嘧啶核苷并通过闪烁计数器测量其吸收量(图5)。结果，鉴定与没有TRX的细胞相比，具有重组TRX-WT蛋白的细胞中细胞增殖能力被增强，而在具有重组TRX-C35S蛋白的细胞中细胞增殖被抑制。
1.抗癌剂性能的增强效果1终浓度3μg/mL顺铂(CDDP；顺-铂(II)-二胺二氯化物，Sigma)被加到TRX基因高表达的细胞，该细胞通过引入野生型(WT)TRX，C32S/C35S衍生的(CS)TRX或C35S衍生的-TRX基因到人T细胞系Jurkat中而建立。在细胞培养24小时后，膜联蛋白V-FITC和二碘化丙锭(Medical Biological Laboratories CO.，LTD)被结合到细胞，通过流式细胞仪分析显示细胞凋亡的双阳性的细胞的数量。结果，鉴定高水平表达C35S-TRX的细胞系中膜联蛋白V-FITC和二碘化丙锭双阳性的死细胞的数量，与表达WT-TRX或CA-TRX的细胞系相比大约提高4倍。
2.抗癌剂性能的增强效果2重组C35S-TRX蛋白以浓度10μg/mL添加进人T细胞系Jurkat的培养物中，温育一个小时或三个小时然后添加顺铂至终浓度3μg/mL或6μg/mL。在培养24小时之后膜联蛋白V-FITC和二碘化丙锭被结合到细胞，通过流式细胞仪分析显示细胞凋亡的双阳性细胞的数量。结果，在已经预先添加重组C35S-TRX蛋白的组中，膜联蛋白V-FITC和二碘化丙锭双阳性细胞的数量与没有添加重组蛋白质的组相比增加，并在具有3μg/mL顺铂的组增加大约2倍和在具有6μg/mL顺铂的组增加大约4倍。在用C35S-TRX蛋白预处理3小时的组比预处理1小时的组的效果更高。
如上所述，已经描述本发明优选的实施方案，本领域技术人员应该理解可以进行各种变化和改进而不偏离本发明的实质。因此，本发明的范围应该仅仅由权利要求确定。
根据本发明，有可能稳定和大规模地生产具有高抑制细胞生长活性的修饰的TRX蛋白并开发运用来源于能够被快速内吞入细胞中修饰的TRX的肽序列的载体。与修饰的TRX蛋白或来源于修饰的TRX的肽融合的生物活性物质(蛋白质，脂类，核酸，有机化合物，无机化合物)可以被用于各种领域疾病的治疗和/或预防。
序列表<110>独立行政法人产业技术综合研究所(NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY)<120>修饰的硫氧还蛋白(Thioredoxin derivatives)<130>SCT053879-47<160>14<170>Patentln version 3.1<210>1<211>318<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(1)..(318)<223>
<400>1atg gtg aag cag atc gag agc aag act gct ttt cag gaa gcc ttg gac 48Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Thr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asp1 5 10 15gct gca ggt gat aaa ctt gta gta gtt gac ttc tca gcc acg tgg tgt 96Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys20 25 30ggg cct tgc aaa atg atc aag cct ttc ttt cat tcc ctc tct gaa aag144Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys35 40 45tat tcc aac gtg ata ttc ctt gaa gta gat gtg gat gac tgt cag gat192Tyr Ser Asn Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp50 55 60gtt gct tca gag tgt gaa gtc aaa tgc atg cca aca ttc cag ttt ttt240Val Ala Ser Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe65 70 75 80
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<210>3<211>27<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3ggatccgtga agcagatcga gagcaag 27<210>4<211>30<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4gtcgacttag actaattcat taatggtggc 30<210>5<211>27<212>DNA<213>Homo sapiens<400>5cttgatcatt ttgcaaggcc cagacca 27<210>6<211>27<212>DNA<213>Homo sapiens<400>6tggtctgggc cttgcaaaat gatcaag 27<210>7<211>27<212>DNA<213>Homo sapiens<400>7cttgatcatt ttggaaggcc cacacca 27
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<221>misc_feature<222>(103)..(105)<223>nnn stands for any base for coding Lys，Asn，Arg，Ser，Thr，Ile，Met，Glu，Asp，Gly，Ala，Val，Gln，His，Pro，Leu，Tyr，Trp，or Phe.
<220>
<221>CDS<222>(1)..(318)
<223>The’Xaa’at location 35 stands for Lys，Asn，Arg，Ser，Thr，Ile，Met，Glu，Asp，Gly，Ala，Val，Gln，His，Pro，Leu，Tyr，Trp，or Phe.
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<400>14atg gtg aag cag atc gag agc aag act gct ttt cag gaa gcc ttg gac 48Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Thr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asp1 5 10 15gct gca ggt gat aaa ctt gta gta gtt gac ttc tca gcc acg tgg tct 96
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1.含以下多肽之一的修饰的人硫氧还蛋白a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸残基被另外的氨基酸取代的氨基酸序列的多肽；b)具有SEQ ID NO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸残基被化学修饰的氨基酸序列的多肽；c)具有SEQ ID NO2氨基酸序列中除32和35位之外，优选除32到35位之外的位置存在一个或多个取代，缺失，插入或添加的氨基酸的氨基酸序列，并具有诱导细胞凋亡活性的多肽；和d)由编码在SEQ ID NO2氨基酸序列中半胱氨酸残基被另外的氨基酸取代的修饰的人硫氧还蛋白的DNA或能够与其互补链在严格条件下杂交的DNA编码的多肽。
2.根据权利要求1的修饰的人硫氧还蛋白，其中所述另外的氨基酸残基是丝氨酸。
3.含有下列任何DNA并编码具有诱导凋亡活性的修饰的人硫氧还蛋白的基因(1)编码多肽的多核苷酸，或该多核苷酸的互补链，该多肽具有在SEQ ID NO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸残基被另外的氨基酸取代，此外在SEQ ID NO2氨基酸序列中除32和35位之外，优选除32到35位之外的位置存在一种或者多种取代，缺失，插入或增加的氨基酸的氨基酸序列，并具有诱导细胞凋亡活性；和(2)编码在SEQ ID NO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸残基被另外的氨基酸取代的修饰的人硫氧还蛋白的DNA，或能够与其上述DNA的互补链在严格条件下杂交并编码具有细胞凋亡活性的多肽的DNA。
4.以可表达方式引入权利要求3的基因的重组表达载体。
5.用权利要求4的表达载体转化的转化子。
6.用于生产具有诱导细胞凋亡活性的多肽的方法，所述方法包括培养权利要求5的转化子。
7.一种用于生物活性物质的细胞内吞的多肽，其包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列。
8.包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽用于生物活性物质的细胞内吞。
9.生产能够被内吞到细胞中的生物活性物质复合物的方法，该方法包括将生物活性物质结合到包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽。
10.能够被内吞到细胞中的生物活性物质复合物，其中生物活性物质被结合到包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽。
11.权利要求10的复合物，其中包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸残基被另外的氨基酸取代的氨基酸序列的多肽。
12.权利要求10或11的复合物，其中上述生物活性物质是蛋白或多肽。
13.生产能够被内吞到细胞中的多肽复合物的方法，该方法包括培养转化有重组载体的转化子，该重组载体具有编码复合物的多肽，复合物中生物活性多肽已被结合到包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽。
14.包含权利要求1或2的修饰的硫氧还蛋白的抗癌剂。
15.包含权利要求1或2的修饰的硫氧还蛋白的抗癌增强剂。
16.包含权利要求1或2的修饰的硫氧还蛋白和另外的抗癌剂的抗癌剂组合物。
17.治疗癌症的方法，该方法包括给药权利要求1或2的修饰的硫氧还蛋白，如果需要，与另外的抗癌剂一起给药到患癌症的病人。
18.药物或药物组合物，包含权利要求10到12任意一项的复合物，以及如果需要，包含药物可接受的载体，赋形剂或稀释剂。
全文摘要
本发明涉及修饰的人硫氧还蛋白，其包括以下任何多肽(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列中35位半胱氨酸残基被另外的氨基酸改变或化学修饰的氨基酸序列的多肽；和(b)具有SEQ ID NO2氨基酸序列中除32和35位之外，优选在SEQ ID NO2氨基酸序列中除32到35位之外的位置存在一个或多个取代，缺失，插入或添加的氨基酸的氨基酸序列，并具有诱导凋亡活性的多肽。
文档编号C12N1/19GK1798837SQ200480015060
公开日2006年7月5日 申请日期2004年3月30日 优先权日2003年3月31日
发明者石井保之, 淀井淳司, 中村肇, 近藤则彦 申请人:独立行政法人产业技术综合研究所