专利名称：防止蛋白氧化降解的方法和组合物的制作方法
相关申请本申请要求于2002年7月12日申请的美国临时专利申请顺序号60/395,411的权益，所述申请的全部内容通过引用结合到本文中。
背景技术：
蛋白在纯化和贮藏期间经历不同程度的降解。氧化是蛋白的主要降解途径之一，且对蛋白的稳定性有破坏作用。蛋白的氧化降解导致电子的失去，这导致氨基酸残基的破坏、蛋白的聚集[Davies，J.Biol.Chem.2629895-901(1987)、肽键的水解[Kang和Kim，Mol.Cells7553-58(1997)以及因此由于改变蛋白的三级结构而使蛋白不稳定。
氧化经由许多不同且互相联系的途径发生，且被种种的引发条件催化，所述引发条件包括高温、氧含量、氢离子浓度(pH)以及暴露在过渡金属、过氧化物和光之中。通常，导致蛋白的氧化降解的一个重要因素是暴露在氧和金属中。将某些赋形剂配制在药用组合物中，以提供对聚集的阻止；但因为它们含有氧，因而也可增强氧化。例如，吐温含有微量的过氧化物污染物，这些污染物在有低浓度金属的情况下可导致吐温的氧化。氧自由基和金属的组合导致吐温的自动氧化和进一步破坏，因此，提供氧化的催化剂，因而使与所述吐温一起配制的蛋白降解。
供治疗用的人源化抗体和完全人抗体的出现，已产生了通过防止氧化降解来保持药用组合物中的蛋白稳定性的需要。蛋白例如含有单克隆抗体溶液的氧化，可导致所述抗体的降解、聚集和断裂，且因此损失抗体活性。因此，用将会保护蛋白的赋形剂，来配制含有肽且含有抗体的药用组合物，使蛋白免受由于多种引发因子的氧化性损伤，是所希望的。如此，为了提供在一段时期内能承受氧化条件的、含有蛋白的稳定药用组合物，有必要在本领域中确定将对蛋白降解的加速进行补救的物理条件和化学条件。
发明概述本发明提供保护蛋白以防由于氧化损害的、改进的组合物和制剂。所述组合物包含一种或多种蛋白，所述蛋白对氧化敏感、与金属螯合剂以及还可任选一种或多种自由基清除剂(特别是氧自由基清除剂(“ROS”清除剂))配制在一起。所述组合物显示出增强的抗氧化性，导致例如较长的产品保质期、允许室温贮藏的更大稳定性和/或在产品包装方面的更大灵活性。另外，已证明所述组合物显示出显著的保护作用，甚至对常常对氧化性损伤特别敏感的、具有一个或一个以上亚基或多肽链的多单位蛋白质，也显示出所述的保护作用。因此，本发明提供一种用于保护(即稳定)甚至多单位蛋白组合物例如抗体组合物的重要手段。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种包含蛋白的组合物，所述蛋白与选自以下的金属螯合剂组合配制在一起(例如，在例如实验室等级的制备中或在例如药用组合物的制备中)去铁胺(DEF)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和/或二(氨乙基)乙二醇醚N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)。螯合剂的一个优选组合是在防止蛋白氧化方面显示出意想不到的协同作用的DTPA和DEF。另一个优选的螯合剂组合是EGTA和DEF。
本发明的组合物可以还包含一种或多种中和氧自由基的试剂(即ROS清除剂)。合适的ROS清除剂包括例如甘露醇、甲硫氨酸和/或组氨酸。因此，在另一个实施方案中，本发明提供一种包含一种或多种蛋白的组合物，所述一种或多种蛋白与一种或多种金属螯合剂(例如DEF和/或DTPA)以及一种或多种ROS清除剂(例如甘露醇、甲硫氨酸和/或组氨酸)配制在一起。
可以按照本发明来保护且因此稳定任何合适的、对氧化敏感的目标蛋白或多肽(即可以配制在本文中描述的氧化保护性化合物中)。所述蛋白可以呈其天然(例如自然的)状态，或是通过例如微型胶囊化或缀合作用而修饰的。所述蛋白可以是治疗剂或是诊断剂。这样的蛋白包括例如防止氧化性损伤的免疫球蛋白(immunoblobulins)、牛血清白蛋白(BSA)、人生长激素(hGH)、甲状旁腺激素(PTH)和促肾上腺皮质激素(ACTH)。
另外，可以按照本发明来保护对氧化性损伤、蛋白聚集和分解特别敏感的多单位蛋白例如抗体，所述氧化性损伤、蛋白聚集和分解使所述蛋白变得无诊断功能和治疗功能。在一个具体的实施方案中，本发明提供被保护(即稳定)抗体的组合物，例如包括一种或多种单克隆抗体的那些组合物；所述单克隆抗体即包括完全人抗体以及其片段和免疫缀合物(即缀合治疗剂的抗体，所述治疗剂即例如作为毒素、聚合物、造影剂或药物的治疗剂)的单克隆抗体。
本发明的组合物也可以包括一种或多种抑制蛋白聚集的试剂。在一个具体的实施方案中，所述试剂选自聚山梨酯80、聚山梨酯20、甘油和泊洛沙姆聚合物。所述组合物可以再进一步包括保持组合物的pH优选在约pH5.O至约pH8.0的缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、乙酸盐、2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)、琥珀酸、哌嗪双乙磺酸(PIPES)、Bis-Tris、2-(N-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-3-丙磺酸(EPPS)、乙二胺、磷酸和马来酸。
因此，在另一个方面，本发明提供一种制备稳定的蛋白组合物的方法，即通过将蛋白与一种或多种金属螯合剂、ROS清除剂和/或如上所述可任选的其它试剂配制在一起。
根据下面的发明详述和实施例，本发明的其它特征和优点将会是显而易见的，所述实施例不应解释为是限制性的。本申请中引用的所有参考文献、专利和公布的专利申请的内容都通过引用结合到本文中。
发明详述本发明提供用于减少或防止例如导致蛋白分解和聚集的蛋白氧化的方法和组合物。如同本文中所示的，通过将蛋白与氧化保护性化合物(例如过渡金属螯合剂、ROS清除剂及其它活性剂)的不同组合配制在一起，可以达到显著保护。在一个具体的实施方案中，本发明的抗氧化组合物包含易于因氧化机制而损害的、且因此难以保持稳定形态的单克隆抗体。
具体地说，本发明首次证明，精选的螯合剂组合例如与DTPA或EGTA组合的DEF，对由种种试剂以及金属(例如铜和铁)、过氧化物、温度和光等环境因素引起的蛋白氧化，具有显著的保护作用。本发明进一步证明当组合使用DEF和DTPA时的意想不到的结果——DEF和DTPA显示出防止蛋白氧化降解的协同保护作用(即与单独用任一种螯合剂而观察到结果相比，大于所预期的结果)。本发明进一步证明，螯合剂和ROS清除剂的特别组合，例如与甘露醇、甲硫氨酸和/或组氨酸组合的DTPA，提供对蛋白氧化的显著保护作用。
为使本发明更加容易理解，首先定义一些术语。另外的定义在本发明详细说明的全文中提到。
定义当用于本文时，用来描述本发明的下列术语和短语应该有下面提供的含义。
术语“氧化保护性化合物”是指通过例如螯合可导致或促进氧化的金属或者通过清除氧自由基(本文中称之为“活性氧形式”或“ROS”)而防止、限制、减少或在其它方面控制蛋白氧化的任何物质。本发明组合物中所用的氧化保护性化合物通常提供相对保护，从而使至少约10％免遭氧化，优选使至少约20％免遭氧化，更优选使至少约40％免遭氧化，再更优选使至少约60％免遭氧化，最优选使至少约80％或以上免遭氧化。
本文所用的“相对保护”是指与在没有一种或多种氧化保护性化合物情况下发生的氧化相比，由一种或多种氧化保护性化合物提供的保护。在一个具体的实施方案中，相对保护(RP)如下计算Rp＝100％-[(用抗坏血酸(Asc)和金属处理的、含有保护性化合物的样品中特定带的强度)÷(用抗坏血酸和金属处理的、没有保护性化合物的样品中特定带的强度)]本发明的氧化保护性化合物包括例如过渡金属螯合剂(例如DTPA、DEF、EGTA等)、ROS清除剂(例如甘露醇、山梨醇、甲硫氨酸、组氨酸、褪黑激素)及其它防止蛋白氧化的试剂。
术语“抗氧化组合物”是指含有一种或多种氧化敏感性蛋白以及一种或多种氧化保护性化合物的组合物。这样的组合物显示出减弱氧化的倾向，正如由例如存在的氧化相关聚集体或降解物的百分比降低所表明的。这可以用例如SDS-聚丙烯酰胺电泳(PAGE)或者其它的生化技术或生物物理技术来测定；且例如通过测定相对保护来定量。
术语“中和”是指一种或多种氧化保护性化合物例如螯合剂或ROS清除剂防止氧化的能力，即起氧化保护性化合物作用的能力。
术语“螯合剂”、“金属螯合剂”、“过渡金属螯合剂”及其别的语法上的变体可互换使用；且指的是有许多带负电荷的配体和/或多电子配体的多官能分子，所述配体可以以不同的亲和力多价螯合金属离子。合适的多电子官能团包括羧基、羟基和氨基。这些基团在氨基多羧酸、羟基多羧酸、羟基氨基羧酸等中的排列，产生具有结合金属能力的部分，由此除去溶液中的金属并且使它不能与含O2化合物起反应。螯合剂的实例包括氨基多羧酸例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、N-2-乙酰氨基-2-亚氨基二乙酸(ADA)、二(氨乙基)乙二醇醚-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、反式-环己二胺四乙酸(DCTA)、谷氨酸和天冬氨酸，羟基氨基羧酸例如N-羟乙基亚氨基二乙酸(HIMDA)、N，N-二-羟乙基甘氨酸(N-二(羟乙基)甘氨酸)和N-(三羟甲基甲基)甘氨酸(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)，以及N-取代的甘氨酸例如N-甘氨酰甘氨酸。其它的候选螯合剂包括2-(2-氨基-2-氧代乙基)氨基乙磺酸(BES)和去铁胺(DEF)。本发明蛋白制剂中所用的合适螯合剂包括例如结合溶液中的金属离子从而使它们变得不能与存在的O2起作用、由此使·OH官能团的产生减至最小或防止·OH官能团产生的那些螯合剂，所述·OH官能团即可以自由地与蛋白起反应且降解该蛋白的·OH官能团。这样的螯合剂可减少或防止在没有螯合剂保护情况下配制的蛋白的降解。
用于本发明的螯合剂可以以其盐形式存在，所述盐形式即例如上述螯合剂的羧基官能团或其它酸式官能团的盐形式。这样的盐的实例包括与钠、钾、钙及其它弱结合金属离子形成的盐。正如本领域中已知的，所述盐的性质和待中和的电荷数将会取决于存在的羧基数和供给稳定螯合剂时的pH。同样正如本领域中已知的，螯合剂有各不相同的结合特定靶离子的强度。通常，结合重金属离子比结合其同样电荷的较低分子量对应物更强烈。
术语“氧自由基清除剂”、“活性氧形式的清除剂”和“ROS清除剂”可互换使用，且指的是除去溶液中的氧居中的自由基或ROS的化合物。氧居中的自由基是具有氧中心和外层的两个不成对电子的任何自由基。由于不成对电子的存在，自由基是高度活性的。最常见的ROS包括超氧阴离子(O2-)、羟基自由基(·OH)、单线态氧(1O2)和过氧化氢(H2O2)。本发明的合适ROS清除剂包括但不限于甲硫氨酸、组氨酸和甘露醇。
I.影响蛋白稳定性的因素氧损伤/氧化性损伤蛋白的氧化是最常见的降解原因之一，因为它涉及一种普遍存在的元素——氧的参与。包括过氧化氢和游离超氧化物(O2-)以及羟基自由基(·OH)的活性氧形式，可导致蛋白的相当大的损害；包括蛋白的聚集(Davies，JBC 1987第262卷，第9895页、肽键的水解(Kang和Kim，Mol.Cells 1997第7卷，第553页)以及分子间交联的二酪氨酸(Davies，JBC 1987 第262卷，第9908页)。
常用的纯化和贮藏方法可能使蛋白质性生物治疗药物暴露于导致氧化性损伤的条件和组分下。微量(ppm水平)的金属(Cu2+、Fe2+、Co2+和Mn2+，铁和铜是最常见的(Packer，Method Enz.第186卷，第14页)(Ahmed，J.Biol.Chem.1975第250卷，第8477页))，可浸出最终的容器包装材料，例如玻璃小瓶；从而促进酰胺键的水解(Wang和Hanson，J.Parent.Sci.Tech.1988第42卷，第s4-s25页)、增强氧化及导致蛋白聚集。暴露在光中也可以产生参与氧化级联的活性物质。FDA批准的常用表面活性剂——吐温(聚山梨酯)，可以含有活性氧形式，该活性氧形式作为杂质(Packer，Method in Enzymology 1990第186卷)并促进氧化性损伤(Hunt，Biochem.J.1988第250卷，第87页)(Chang和Bock，Anal.Biochem.1980，第104卷，第112页)。另外，常规用来保护小分子以防氧化的某些抗氧化剂，包括例如硫醇衍生物、亚硫酸盐(如硫酸钠)和抗坏血酸，对蛋白是有害的，尤其是对大的蛋白例如单克隆抗体是有害的；因为这些添加剂对二硫键有害。
因此，本发明提供在蛋白制剂方面通过控制一种或多种前面提到的氧化机制而减少氧化性损伤的方法和组合物。这在生产过程中和在贮藏条件方面可导致例如改善的产品稳定性和/或更高的适应性。
温度和pH大多数蛋白的化学降解过程是与温度有关的。然而就氧化而论，却存在矛盾事物。温度越低氧溶解度越大，但降低氧化降解速率；温度越高氧溶解度越低，但增加氧化降解速率(J.Par.Sci Tech.第36卷，1982，第222页)。
pH是影响氧化的另一个因素。当增大pH超过7.0时，氢离子浓度增大；且由于它，氧化电位(能斯特方程)也是如此。已充分证明了pH对肽水解的作用，而在单克隆抗体方面，不但在酸性pH、而且在碱性pH时，所述作用都可以发生。在酸性条件下，蛋白水解可以在具有氨基酸序列——X-Asp-X、Ser/Thr-X、Pro-X的位点发生；或者，在碱性条件下，蛋白水解可以在具有氨基酸序列X-Asn-X、X-Asp-X的位点发生(Volkin，Mol.BioTech.1997第8卷，第105页)(Reubsaet，J.Pharm.BioMed.Anal.1998第17卷，第955页)。在酸性条件下，切开的Ser-X和Thr-X受微环境和N端一侧或C端一侧的相邻氨基酸的影响(Wang和Hanson，J.Parent.Sci.Tech.1988第42卷，第s4-s25页)。在酸性及氧化条件下，Pro-X形成谷氨酰半醛或者在2-吡咯烷酮处被水解而形成新的N-末端(Reubsaet，J.Pharm.Biomed.Ana.1998第17卷，第955页)。
II.不可还原共价蛋白聚集体的形式蛋白聚集体的大多数形式是二硫化物间的新的交联的结果，或者是新形成的、非二硫化物的交联的结果。由氧化引起的两种类型的不可还原交联，涉及色氨酸(Trp)转化为犬尿氨酸(一种开式戊环结构)而导致荧光发射减少和蛋白聚集，或者涉及二酪氨酸间的结合而导致在410-420nm的荧光光谱发射增强(在315nm处激发)(Wold和Moldave，ME，1984第107卷，第377页)。
不可还原二硫化物交联的其它形式是酰胺化作用(在酸性条件下的Lys酰胺+羧基)或转酰胺基作用(在酸性或者碱性条件下的Lys酰胺+Asn/Gln)。在有金属的情况下，可增强/促进蛋白的转酰胺基作用(Hirs和Timasheff，ME.1972第25卷，第411页)。
β消除是二硫键的还原、过硫化物的形成、硫醛变成醛以及在碱性pH时加速的活性脱氢丙氨酸的形成。脱氢丙氨酸可以与酪氨酸(Tyr)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)以及半胱氨酸形成新的不可还原交联，且在酸性条件下，在脱氢丙氨酸的C端一侧发生肽的水解(“Chemical Deterioration of Protein”1980 Whitaker J.ACSSymp Ser.123，第147页)。
III.用于确定蛋白降解程度的分析技术如同本文中描述的，在一个实施方案中，本发明采用依据化合物来确定蛋白降解程度的有效方法。不仅可用该方法来鉴定防止这样降解的化合物，而且可用该方法来确定所提供的保护程度。尤其是所提供的方法涉及增加蛋白的氧化性损伤，且证实这种损伤产生在实时和加速老化期间所观察到的同样的物质。在一个具体的实施方案中，通过使样品暴露于抗坏血酸钠(例如4mM、pH7.5、37℃达48小时)，来模拟氧化条件。通过样品在SDS-PAGE上电泳，继之以银染色，可以目测氧化形式。至于我们的分析，加入3μg材料，这高于银染色的常用加样量；所述银染色具有毫微克水平的灵敏度。这保证甚至在相对低丰度时的物质的检测。为样品间的直接比较而分析凝胶谱带强度的光密度测定法是本领域中已知的。例如可用该方法在各种各样金属的范围内，靠产生氧化的化合物，来评价所提供的保护程度。可以用许多分析法例如反相-高压液相色谱法(RP-HPLC)、紫外测定法、荧光测定法和无梯度洗脱来确定氧化产物的存在(Reubasaet等，(1998)J.Pharm.Biomed Anal.17955-978)。一般通过使样品在pH7.5、37℃暴露于抗坏血酸钠达48小时，来完成恰当的氧化。可以用分析法例如通过银染色的SDS-PAGE的显现法，来证实氧化。
本发明也包括其它识别增加氧化性损伤的方法，所述氧化性损伤即与在实时和加速老化期间发生的损伤相当的氧化性损伤。例如，可以使用许多氧化剂例如碱性介质、铜、铁、过氧化物酶和抗坏血酸。
IV.蛋白用本发明方法和组合物，可以稳定(即保护)对氧化敏感的任何蛋白，包括结合蛋白、免疫球蛋白(immunoglobins)、酶、受体、激素及其片段。获得或产生所述蛋白之源或方式并不重要，例如不管是用适当的纯化方案从细胞或组织材料中分离的，用重组DNA技术生产的，还是用标准肽合成技术化学合成的。例如，可以用本发明的方法和组合物来稳定各种各样的天然蛋白、合成蛋白和/或包括嵌合蛋白和/或融合蛋白在内的重组蛋白。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及稳定抗体(包括单克隆抗体和人抗体)的组合物和方法。术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用，且包括其片段和衍生物。
本发明中所用的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指一群仅包含一种能与特定表位起免疫反应的抗原结合部位的抗体分子。本发明也涉及用本发明组合物和方法稳定的重组抗体。重组抗体包括但不限于嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体(既包含人部分、又包含非人部分)、单链抗体和多特异性抗体。嵌合抗体是抗体分子中不同部分来源于不同动物物种的分子，例如具有来源于鼠单克隆抗体的可变区和来源于人免疫球蛋白恒定区的那些抗体。单链抗体具有一个抗原结合部位且由单一多肽组成。多特异性抗体是具有至少两个特异性结合不同抗原的抗原结合部位的抗体分子。可以用本领域已知的技术来生产这样的分子。人源化抗体是具有一个或多个来自非人类物种的互补性决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区的、来自非人类物种的抗体分子。此外，可以用本发明的制剂和方法来稳定完全人抗体；不管所述抗体来源于人，还是来源于包含人基因的转基因动物。
本领域普通技术人员将会认识到，用本发明组合物和方法配制的抗体可以是抗体片段，特别是包含抗体的抗原结合部分的片段。术语“抗原结合部分”是指一种或多种保持与抗原结合能力的抗体片段。已证明抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。包括在术语抗体的“抗原结合部分”的结合片段的实例包括(i)Fab片段，一种由VL区、VH区、CL区和CH1区组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，一种包含通过二硫键在绞链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH区和CH1区组成的Fd片段；(iv)由抗体一条臂的VL区和VH区组成的Fv片段；(v)由VH区组成的dAb片段(Ward等，1989，Nature 341544-546)；以及(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个区—VL区和VH区是由不同基因编码的，但可以利用重组方法，通过合成接头将连接它们，使之成为单链蛋白，其中VL区和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等，1988，Science 242423-426；以及Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。这样的单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。采用本领域技术人员已知的常规技术，获得这些抗体片段，并且可以以与完整抗体的相同方式，根据用途对所述片段进行筛选。
因此，本发明也提供按照本文所述而配制的稳定的治疗用抗体和/或诊断用抗体组合物。合适的治疗用抗体不仅包括任何抗体或其片段，而且包括抗体衍生物和免疫缀合物(例如与治疗部分例如细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子缀合的抗体)。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何药剂。实例包括泰素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素以及其类似物或同系物。治疗剂包括但不限于抗代谢药(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶decarbazine)、烷化剂(例如氮芥、thioepa、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C以及顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环霉素(例如柔红霉素(从前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如放线菌素D(从前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))以及抗有丝分裂药(例如长春新碱和长春花碱)。用于缀合这样的治疗部分到抗体上的技术是本领域众所周知的。
本发明也提供包括一种或多种用本发明抗氧化组合物稳定的蛋白(例如配制在本发明抗氧化组合物中)的试剂盒，且可任选提供使用说明书。
V.氢化保护性化合物已证明金属螯合剂抑制/减少自由基的形成和吐温(聚山梨酯)氧化。已证明了它们的效力，所述效力随实验条件而变化。已证明最常用的螯合剂EDTA在Cu催化的Fenton反应中抑制自由基的形成。在某些情况下，EDTA在Fe催化的Fenton反应中增强自由基的形成(Bioch.Biophy.Acta 1997，第1337卷，第319页)。因为Fe-EDTA络合物有一种允许羟基自由基(HO●)逃脱的敞开结构，所以发生这一点。也有人提出EDTA在溶液中抑制Fe，阻止它在生理pH时沉淀(ME1990，第186卷，第16页)。
DTPA可减少依赖铁的、由O2和H2O2而来的羟基自由基(HO●)的形成(Packer，ME 1990，第186卷，第42页)。去铁胺是依赖铁的脂质过氧化的强有力抑制剂(Packer，ME 1990，第186卷，第42页)。虽然已在蛋白制剂中使用过这两种螯合剂；但是以前从来没有一起使用过它们，例如在保护蛋白以防氧化的制剂中。
本发明其它氧化保护性化合物包括本领域公认的自由基清除剂，包括例如甘露醇、FDA批准的赋形剂和OH●清除剂(Kocha，BBA第1337卷，1997，第319页)、组氨酸(Kammeyer，BBA第49卷，1999，第117页)以及褪黑激素(自由基清除剂)(Reiter，Nutr.1998第19卷，第691页)。
本发明氧化保护性化合物也可以是与防止蛋白聚集的试剂组合在一起的。这有助于进一步防止蛋白样品和蛋白制剂的损伤与失活。合适的试剂包括例如聚山梨酯(例如聚山梨酯80和/或聚山梨酯20)、甘油、泊洛沙姆聚合物(例如泊洛沙姆407和泊洛沙姆188)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮以及苄泽。这样的试剂是市场上买得到的，且是本领域众所周知的。
VI.药用组合物可以把本发明氧化保护性化合物掺入到适合于给药的药用组合物中。也可以将本发明氧化保护性化合物掺入到适合于诊断目的和/或实验室目的的组合物中。这样的组合物一般包括目标蛋白以及氧化保护性化合物和药学上可接受载体的组合。本文所用的术语“药学上可接受的载体”是用来包括与给药不矛盾的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。在本领域中，适合于药用活性物质的这样的介质和试剂的使用，是众所周知的。除非任何常规介质或药剂与所述活性化合物是不相容的；否则，期待其在所述组合物中的应用。也可以把补充的活性化合物掺入到所述组合物中。
因此，本发明不仅进一步提供包含稳定蛋白的诊断用药用组合物及治疗用药用组合物，而且进一步提供通过将蛋白与氧化保护性化合物和药学上可接受载体的组合配制在一起而制备这样组合物的方法。这样的组合物可以还包括另外的试剂，包括不同浓度的聚山梨酯和不同浓度的甘油，以及保持pH例如在约5.O至约8.0的、各种各样的缓冲剂。因此，在一个具体的实施方案中，本发明提供一种通过将一种或多种蛋白与DEF和EGTA或DTPA配制在一起(任选配合ROS清除剂以及药学上可接受的载体)而制备抗氧化组合物的方法。
当然，药用组合物的适当剂量取决于普通技能医生、兽医或研究人员的知识范围内的诸多因素。所述剂量会变化，例如随受治疗者或被处理样品的身份、大小以及条件而改变；另外，会随准备给予所述组合物的途径而变化；如果是能应用的，则因按照本发明配制的蛋白组合物，而会随主治医师希望所述药剂有的作用而改变。当为了调节本发明蛋白的表达或活性而准备把一种或多种的这些组合物给予动物(例如人)时，医生、兽医或研究人员在开始时例如可以规定一种相对小的剂量，其后增大剂量直到获得适当的反应为止。另外，不用说，任何特定动物受治疗者的具体剂量水平将取决于各种各样的因素，包括所用具体药剂的活性、受治疗者的年龄、体重、一般健康状况、性别以及饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、任何药物组合和所调节的表达或活性的程度。
本发明的药用组合物是配制得适合于其预定的给药途径的。给药途径的实例包括胃肠外给药例如静脉内给药、真皮内给药、皮下给药，口服给药(例如吸入)，透皮给药(局部给药)，经粘膜给药以及直肠给药。为了胃肠外应用、皮内应用或皮下应用而采用的溶液剂或混悬剂可以包括下列组分无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它的合成溶剂，抗菌剂例如苯甲醇或对羟苯甲酯，缓冲剂例如乙盐酸、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节渗涨度的试剂例如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠来调节pH。可以用由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多次剂量的小瓶，来包装所述的胃肠外制剂。
适合于注射用的药用组合物包含无菌水溶液(水溶性之处)或分散体系以及适合于用无菌注射溶液或分散体系临时配制的无菌粉针剂。至于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)。就一切情况而论，所述组合物必须是无菌的，而且应该是液体，使得存在易于注射性。它必须在生产和贮藏条件下稳定，必须加以防腐以抵抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。所述载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如通过应用包衣，例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒径，以及通过利用表面活性剂，可以维持适当的流动性。用各种各样的抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、硫柳汞等，可以确保防止微生物的作用。在许多情况下，在所述组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠，将是更好的。靠在所述组合物中包括延迟吸收的药剂例如一硬脂酸铝和明胶，可以导致所述注射用组合物的长期吸收。
通过以所需要的量将活性化合物(例如多肽或抗体)掺入到具有一种上面列举成分或上面列举成分组合的合适溶剂中，可以配制无菌注射液；在需要时，继之以过滤除菌。一般而言，通过将所述活性化合物掺入到含有基本分散介质和上述的所需其它组分的无菌载体中，制备分散体。就供制备无菌注射液用的无菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由预先过滤除菌的其溶液得到的所述有效成分加上任何额外的所需组分的粉末。
口服的组合物通常包含惰性稀释剂或可食用的载体。可以用明胶胶囊包装它们或将其压制成片剂。为了口服治疗性给药，所述活性化合物可以与赋形剂掺混在一起，并且可以将所述活性化合物以片剂、药片或胶囊形式使用。也可以用用作漱口剂的液体载体，来制备口服组合物；在那方面，口服而发嗖嗖声地应用该液体载体中的所述化合物，并且将其吐出或吞服。
可以包括药学上相容的粘合剂和/或辅料作为所述组合物的一部分。所述片剂、丸剂、胶囊剂、药片等可包含下列任何成分或类似性质的化合物粘合剂例如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶，赋形剂例如淀粉或乳糖，崩解剂例如海藻酸、羧甲基淀粉钠或玉米淀粉，滑润剂例如硬脂酸镁或Sterotes，助流剂例如胶态二氧化硅，甜味剂例如蔗糖或糖精，或者矫味剂例如薄荷、水杨酸甲酯或橙矫味剂。
至于通过吸入给药，以来自喷雾器或包含合适抛射剂(例如气体，所述气体例如二氧化碳)的分散器或雾化吸入器的气溶胶喷雾形式，递送所述化合物。
系统给药也可以通过经粘膜途径或透皮途径。对于经粘膜给药或透皮给药，将适合于待透过屏障的渗透剂用于所述制剂中。这样的渗透剂通常是本领域中已知的，且对于透过粘膜给药，包括例如去垢剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。通过使用鼻喷雾剂或栓剂，可完成透过粘膜的给药。对于透皮给药，正如本领域中通常已知的，将所述活性化合物配制成软膏剂、药膏、凝胶剂或乳膏剂。
也可以以栓剂形式(例如，用常规栓剂的基质例如可可脂及其它甘油酯)，或可以以用于直肠递送的滞留型灌肠剂形式；来配制所述化合物。
在一个实施方案中，所述的活性化合物可以与保护所述化合物抵抗被机体迅速清除的载体例如控释制剂(包括植入物和微胶囊递药系统)一起制备。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。
对于本领域技术人员，用于配制这样制剂的方法将是显而易见的。也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc在市场上获得所述材料。也可以将脂质体悬浮液(包括含有单克隆抗体的脂质体，所述单克隆抗体即掺入到脂质体中或结合在其上的单克隆抗体)用作药学上可接受的载体。按照本领域技术人员已知的方法，可制备所述的这些；例如，正如美国专利4,522,811号中所描述的。
尤其有利的是配制单位剂型的口服组合物或胃肠外组合物，以便于给药和给药的一致性。本文所用的单位剂型是指对于待治疗的受治疗者适合作为单位剂量的物理上分离的单位；每个单位含有计算用以与所需药用载体结合产生所需疗效的预定量的活性化合物。对于本发明的单位剂型的规定由以下因素决定或者直接取决于以下因素所述活性化合物的独特特性和待达到的特定疗效，和用于治疗个体的敏感性的这样一种活性化合物的配制领域中固有的限制。
至于抗体，优选的剂量是0.1mg/kg体重到100mg/kg体重(通常10mg/kg到20mg/kg)。如果所述抗体必须在脑中起作用，则50mg/kg到100mg/kg的剂量通常是合适的。一般而言，部分人抗体和完全人抗体在人体内具有比其它抗体长的半寿期。因此，较低的剂量和较不频繁的给药常常是可能的。可以用例如脂质化(lipidation)的修饰，来稳定抗体；从而增强摄取和组织穿入(例如，到结肠上皮中)。抗体脂质化的一种方法是由Cruikshank等描述的((1997)J.AcquiredImmune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14193)。
VII.示范性组合物的配制本小节提供按照本发明来制备示范性组合物的限度和配方。熟练的主治医师可以容易地仅仅用常规实验法来配制更多的在本发明范围内的其它组合物。
合适的组合物可以包括一种或多种蛋白，所述蛋白的浓度为约1μg/ml至约500mg/ml、约50μg/ml至约300mg/ml或者约1mg/ml至约100mg/ml。
可以包括浓度在下列示范性范围内的一种或多种金属螯合剂。合适的组合物可以包括浓度为约1μM至约10mM、约10μM至约10mM、约50μM至约5mM或者约75μM至约2.5mM的DTPA和/或EGTA。另外或者可以包括浓度为约1μM至约5mM、约10μM至约1mM或者约20μM至约250μM的DEF。
可以配制包括一种或多种ROS清除剂的组合物，来包含浓度在下面示范性范围中的ROS清除剂。合适的组合物可以包括浓度约0.01％至约25％、0.1％至约25％、约0.5％至约12％或者约1％至约5％的甘露醇。另外或者所述组合物可以包括浓度为约10μM至约200mM、约100μM至约200mM、约500μM至约100mM或者约15mM至约35mM的甲硫氨酸。另外或者合适的组合物可以包括浓度约10μM至约200mM、约100μM至约200mM、约500μM至约100mM或者约15mM至约35mM的组氨酸。
合适的组合物可以包括一种或多种浓度约为0.0005％到12％、约0.001％至约0.1％或者约0.005％至约0.1％的聚山梨酯(例如聚山梨酯80和/或聚山梨酯20)。另外或者合适的组合物可以包括浓度约0.1％至约20％或者约1％至约5％的甘油。另外或者合适的组合物可以包括一种或多种浓度约0.001％至约30％或者约0.2％至约10％的泊洛沙姆(例如泊洛沙姆407和/或泊洛沙姆188)。
合适的组合物可以任选包括缓冲剂，以保持约5.0至约8.0或者约5.5至约7.5的pH。缓冲剂的浓度可以为约5mM至约100mM或者约20mM至约50mM。
一个示范性的组合物包含结合蛋白、约50μM至约5mM的DTPA、约10μM至约1mM的DEF、保持所述组合物的pH在约5.0到8.0的缓冲剂和一种或多种下列试剂，所述下列试剂即约0.0005％至约12％的聚山梨酯20、约0.0005％至约12％的聚山梨酯80、约0.1％至约20％的甘油、约0.001％至约30％的泊洛沙姆407以及约0.001％至约30％的泊洛沙姆188。该组合物也可包含另外的试剂，包括甲硫氨酸、组氨酸和/或甘露醇。
在另一个示范性组合物方面，该组合物包含结合蛋白，约50μM至约5mM的DTPA，一种或多种下列试剂——约0.5％至约12％的甘露醇、约500μM至约100mM的组氨酸和约500μM至约100mM的甲硫氨酸，一种或多种下列试剂——约0.0005％至约12％的聚山梨酯20、约0.0005％至约12％的聚山梨酯80、约0.1％至约20％的甘油、约0.001％至约30％的泊洛沙姆407和约0.001％至约30％的泊洛沙姆188，以及保持所述组合物pH在约5.0到8.0的缓冲剂。
又一个示范性组合物包含DTPA、甘露醇、聚山梨酯、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠以及抗体或抗体片段。
实施例材料与方法1.蛋白氧化试验使蛋白遭受氧化的许多方法是本领域中已知的，且可以用这些方法来试验按照本发明的制剂，测试它们针对氧化条件的保护能力。通常采用的方法包括使蛋白暴露于H2O2或抗坏血酸+金属和O2中(暴露在空气中)(Reubsaet，J.Pharm.Biomed.Ana.(1998)17955)。在本实施例中，通过用pH7.5的抗坏血酸钠(浓度4mM)、1μM铜或铁在37℃一般保温48小时处理样品，来模拟氧化条件。除非注释，所用蛋白样品的浓度是1mg/ml。
2.促进稳定性研究对于促进稳定的精确研究，选择合适的温度是重要的。高温可导致由部分解折叠结构发生的蛋白的不可逆变性是本领域众所周知的。这样的变化可使稳定性研究复杂化，因为在蛋白解折叠转变开始的温度时或在超过这温度时进行的促进稳定的研究中，所观察到的化学改变可能并不代表在适合于装入小瓶终产物的常用贮藏条件例如4℃下发生的真实变性。可以用生物物理学技术例如量热学和荧光光谱学，来证实高温是否会导致这样的变化。因此，对于这项研究，发现37℃并不导致蛋白质结构的解折叠。
3.金属螯合剂、铜和铁的溶液针对铜和铁介导的氧化性损伤，为了研究金属螯合剂对蛋白的保护作用，在如同上面小节1描述的促进氧化的条件下所进行的一系列研究中，试验了EDTA、EGTA、DTPA和DEF等金属螯合剂。用SDS-PAGE、气相分配色谱-高压液相色谱(GPC-HPLC)和酶联免疫吸附测定(ELISA)分析了蛋白样品(精选的样品)。
4.SDS-PAGF用Bio-Rad的Criterion凝胶(对于还原的样品，4-20％；对于非还原的样品，4-15％)，进行SDS-PAGE。以每孔3μg样品的恒定加样量，对所有凝胶(孔)进行加样。利用一根Tosohaas TSK3000 SWXL柱(7.8mm×30cm)，用75μg注射液进行GPC-HPLC分析。
5.生物活性研究用特异性的ELISA，测定抗T淋巴细胞抗原的抗体的生物活性。用可溶性T淋巴细胞抗原包被96孔板。以各种各样的浓度向所述板中加入所述抗体，并让所述抗体结合可溶性T淋巴细胞抗原。用抗人IgG的碱性磷酸酶缀合的抗体、继之以所述磷酸酶底物——对硝基苯磷酸，来检测结合抗体。用ELISA板读出器来测定OD405。所记录的活性以暴露在既没有氧化剂又没有氧化保护性化合物中的参考标准——抗T淋巴细胞抗原抗体的100％结合活性为基准。
6.评价防止氧化的效力在升高的但比蛋白解折叠所必需的转变温度低的温度(37℃)，温育蛋白样品达48小时。为分析防止氧化的保护程度，用还原性SDS-PAGE电泳所述蛋白样品，而且用银染色，来目测观察。用光密度测定法来测定蛋白带的强度的量。比较对照组合物中氧化相关物质的强度与抗氧化组合物相应物质的强度。
把保护的限度分类如下谱带强度减少10％或以上，或者至少约10％的相对保护；谱带强度减少20％或以上，或者至少约20％的相对保护；
谱带强度减少40％或以上，或者至少约40％的相对保护；谱带强度减少60％或以上，或者至少约60％的相对保护；谱带强度减少80％或以上，或者至少约80％的相对保护。
实施例1螯合剂对铜和抗坏血酸诱导的蛋白氧化的影响将螯合剂加到抗坏血酸处理过的、包含单克隆抗体和添加的铜的样品中，以及将螯合剂加到抗坏血酸处理过的、包含单克隆抗体而没有添加铜的样品中；并评价三个时间点(48小时、96小时、144小时)的降解。另外，也评价包含吐温-80(有DTPA和没有DTPA)的样品。结果示于表1中。
表1
结果正如由银染色的SDS-PAGE凝胶所显现的，抗坏血酸在37℃处理达48小时的、包含抗T淋巴细胞抗原抗体的样品无疑地增强降解和聚集。观察到新的带，且因抗坏血酸处理而使通常与低水平所述单克隆抗体(即以小于所述带总强度的5％强度的参考标准存在的)有关的特异性聚集体和分解产物增加。由于所述铜离子的存在而使氧化性损伤变得更坏，形成约12条的带，表示聚集体和分解产物两者。添加EDTA(0.1mM或者1mM)则增强氧化性损伤。
比较起来，在没有铜期间和在存在铜期间，DTPA(0.1mM和1mM)有强烈的保护作用(即减弱氧化，正如由所述抗体的聚集体和分解产物的减少所表示的)。虽然当不存在铜时，DEF提供一些防止氧化性损伤的保护，但探测到用DEF处理过的包含DEF铜的样品中的损伤。向包含抗T淋巴细胞抗原抗体和0.02％吐温-80的溶液中加入1mM DTPA也是保护性的，大大地减少反映大量氧化性损伤的所述谱带的数目和强度。
当增加温育时间时，也增大氧化性损伤的程度；通过SDS-PAGE，以存在多肽分解产物的谱带强度增大最多达十倍且新的多肽分解产物形成新谱带的形式，使这具体化。例如，温育144小时，无保护的样品受到强烈的氧化；这以SDS-PAGE的模糊成片条带的形式显现。但是，重要的是甚至在较长的温育时间后，DEF和DTPA的保护作用是明显的；正如通过SDS-PAGE由谱带强度的极小增强和最小限度的新带形成所显现的。
用0.1mM DTPA与1.0mM DTPA处理过的样品的谱带强度没有显著性差异，提示在较低浓度时达到最大的保护。因此，测试较低的螯合剂浓度以确定用于保护的最低浓度。
因为抗坏血酸处理是相对粗糙的，产生氧化的物质；所以进行另外的实验，来研究通过高温而不是加入抗坏血酸和金属而产生的蛋白形式。使没有抗坏血酸和金属的、在较高温度(45℃和53℃)温育达几个星期的、抗T淋巴细胞抗原抗体的样品与已遭受到抗坏血酸和金属处理的样品一起在SDS-PAGE凝胶上电泳。不但在还原条件下，而且在非还原条件下，所看到的来自抗坏血酸处理泳道的氧化形式(正如SDS-PAGE的谱带)和非抗坏血酸处理泳道的是一样的(根据SDS-PAGE谱带的顺序)。这证明了导致所述抗体的相关聚集和分解形式的抗坏血酸处理方案的有效性。
实施例2螯合剂、吐温-80和蛋白浓度对金属和抗坏血酸诱导的蛋白氧化的影响下面的实验聚焦在两个主要参数上螯合剂的有效浓度(例如，低于实施例1所用那些浓度的试验浓度)和基于不同金属处理的有差别的效力。
用0.025mM、0.05mM、0.075mM和0.1mM的螯合剂处理含有抗T淋巴细胞抗原的单克隆抗体和0.02％吐温-80的样品，并在37℃温育48小时。另外，或者用铜或者用铁或者不用金属处理所述样品。同样，另外的蛋白样品在其暴露于铜和抗坏血酸处理期间时有较高(5mg/ml)的蛋白浓度。结果示于表2中。
表2
</claim><claim>6.根据前述权利要求中任一项的层压制品，其特征在于各层具有根据下表的厚度
</claim><claim>7.根据前述权利要求中任一项的层压制品，其特征在于各层在每种情况下单独或以组合的方式包含根据下表的材料
</claim><claim>8.制备管和类似的箔片型包装用的多层层压制品的方法，所述多层层压制品具有包埋的阻挡层(30)，金属箔片，特别是铝箔(60)，和非必要地外部结构(70)，特别是外膜和/或密封膜(70)，其特征在于DEF在保护蛋白使其免受铁介导的氧化性损伤方面的实用性。
这些数据清楚地显示出由不同金属螯合剂提供的防止氧化的作用随金属而定的差异。DTPA针对铜保护则较好，而DEF针对铁保护。此外，较高的抗体浓度似乎并不影响DTPA的保护作用，因为通过SDS-PAGE，对于含有5mg/ml抗体的样品，观察到如同1mg/ml样品的一样带型的谱带。
实施例3DTPA和DEF的组合对防止蛋白氧化的协同作用上述的研究(实施例2)显示，DTPA和DEF具有金属特异性的、防止氧化的保护作用。具体地说，针对铜介导的蛋白损伤，DTPA有保护作用；而针对铁介导的损伤，DEF有保护作用。因为通常发现药品级玻璃中的铜和铁，所以研究同时用铜和铁处理、以及分别用铜和铁处理DTPA和DEF组合的影响。另外，也研究了在有铁的情况下是否较高浓度的DTPA(大于0.1mM)防止氧化。因此，对含有单克隆抗体、0.02％吐温-80、铜或铁或者这两种金属、以及不同浓度的DTPA浓度或DTPA/DEF组合的蛋白样品进行评价。
结果在较高的DTPA浓度(0.5mM和1.0mM)时，在用铁处理的样品方面，有看得出的保护作用。在用铜或铁或者这两种金属处理的样品方面，有看得出的、由于DTPA与DEF组合的显著保护作用。具体地说，如实施例1和实施例2中所示的，依据SDS-PAGE谱带的不同带型，或者用0.1mM DTPA或者用0.1mM DEF处理的蛋白样品，显示出一些氧化性损伤。然而，与所观察到的、来自各个螯合剂的保护相比，0.1mM DTPA和DEF的组合处理则有比预期的保护作用大得多的保护作用。此外，1mM DTPA和0.1mM DEF的组合提供比所述0.1mM DTPA/DEF组合的保护少的保护。
除实施例1和实施例2中试验的抗T淋巴细胞抗原抗体的样品外，在所试验的其它蛋白样品中，也观察到DTPA和DEF防止蛋白氧化的这种协同保护作用。例如，对于某些抗体，降解产物是更多的。对于某些抗体，两种或更多种氧化保护性化合物使谱带强度恢复回原状——直到在没用抗坏血酸和金属处理的样品方面所看到的程度；而对于其它抗体，所述组合减弱该强度，但显示出小于完全保护的保护。在实施例4中进一步研究DTPA和DEF之间的意想不到的协同作用。
实施例4在防止蛋白氧化方面螯合剂浓度对DTPA和DEF之间的协同作用的影响通过用不同浓度的DTPA和DEF配制蛋白组合物，来研究DTPA和DEF对防止蛋白制剂氧化的协同保护作用。具体地说，使含有抗体、0.02％吐温-80的蛋白样品同时暴露于铜和铁并用不同浓度的DTPA/DEF处理。
结果所有测试的样品都显示出在一定程度上保护抗体免遭氧化性损伤。一些组合有助于防止较高分子量的聚集，但不阻止物质形成，这些物质在重链带和轻链带之间洗脱出来。在用1mM DTPA/0.5mMDEF、0.02mM DTPA/0.1mM DEF和0.1mM DTPA/0.5mM DEF处理的样品方面，观察到最大的保护。
在银染色后，用BIO-RAD GS-800光密度计扫描SDS-PAGE凝胶。光密度分析提供“校正的强度”(即表示带的强度总和的且对任何染色背景进行过校正的带强度)。利用Quantity One软件来比较谱带的强度，从而用数量表示保护作用；这些谱带代表在整个实验期间不断观察到的具体的氧化形式，包括聚集体和抗体的分解产物。
根据来自代表性带/氧化形式的光密度数据的校正强度，显然的是，防止氧化和DTPA/DEF浓度之间的关系不是简单相加的。对于使一种形式极小化有效的DTPA和DEF的组合，未必阻止另一种形式的形成。最有效的具体浓度范围(即使氧化谱带减到最少的)是0.1mM到0.5mM的DTPA浓度与0.02mM到0.1mM的DEF浓度。这些结果表明，甚至在极低的螯合剂浓度时(例如，0.02mM DEF/0.1mMDTPA)，DTPA和DEF的组合提供显著的保护。
实施例5DTPA、DEF和EGTA对于由EDTA增强的氧化性损伤的影响DTPA和DEF之间协同作用的实验导致进行多项研究，以确定这两种螯合剂中任何一种或两种螯合剂是否可“拯救”由EDTA增强的氧化性损伤。另外，研究了单独提供保护作用或配合先前研究的螯合剂提供保护作用的EGTA的能力。具体地说，使含有0.02％吐温-80和EGTA或EDTA的蛋白样品与其它螯合剂一起共同暴露于铜和/或铁并进行评价。
结果在有DTPA、DEF或这两种螯合剂的情况下，观察到用EDTA处理的样品中的严重的氧化性损伤。1mM EGTA，对基于铜的氧化，有相当大的保护作用(可与对照相比较的)；且针对由铁引起的氧化，有较小的保护作用(与对照相比，正如由增加的聚集体和分解产物所表示的)。1mM EGTA+0.1mM DTPA显示出略微增强的氧化，而1mM EGTA+0.1mM DEF显示出良好的保护(可与对照相比较的)。然而，1mM EGTA+0.1mM的DEF和0.1mM的DTPA却提供较差的保护。有趣的是，与EDTA或者EGTA一起的、较高浓度(1mM)的DEF和DTPA未能显示出改进。
实施例6螯合剂、吐温-80、蛋白浓度、甘露醇、甲硫氨酸和/或组氨酸对金属和抗坏血酸诱导的蛋白氧化的影响为研究上述实施例中提出的抗氧化组合物的通用性，使两种单克隆抗体和五种其它蛋白和肽暴露于金属和抗坏血酸以及附加的螯合剂和涉及氧的自由基(称为活性氧形式或“ROS”)清除剂的组合。这些实验表明，可以使用本发明防止氧化且稳定化的、包括各种各样蛋白的组合物，所述蛋白即有各种各样分子量、浓度以及生物物理学和生物化学特征的蛋白。
1.对单克隆抗体氧化的影响在有附加的螯合剂和ROS清除剂组合的情况下，研究了两种单克隆抗体(一种抗T淋巴细胞抗原的抗体和一种抗肿瘤表面抗原的抗体)。
用最适于所述抗体分子量的凝胶浓度，通过SDS-PAGE，来测定防止氧化的保护程度。将凝胶银染色，然后用BIO-RAD GS-800光密度计扫描。利用有关的Quantity One软件，检测出不断探测到的、表示氧化相关物质种类(不但聚集体、而且分解产物)的所述谱带并将其定量。光密度分析提供“校正的体积”，即表示带的强度总和的、且对任何染色背景进行过校正的带强度。最合适的保护剂混合物应该使这些校正的强度值减到最小。
用4mM抗坏血酸和金属(1μM Cu和1μM Fe)处理所有的抗体样品。所测试的附加的组合包括没有螯合剂，100μM DTPA和20μMDEF，100μM DTPA和3％甘露醇，100μM DTPA和25mM甲硫氨酸，100μM DTPA和25mM组氨酸，100μM DTPA、20μM DEF和25mM甲硫氨酸，以及100μM DTPA、20μM DEF和3％甲硫氨酸。所述抗体蛋白溶液包含溶于PBS中的1mg/ml的蛋白与或者0.01％吐温-80或者2％甘油。在室温下温育所有的样品达至少48小时，然后将其贮藏在4℃。结果(对于测试的两种单克隆抗体，结果是类似的)示于表3中。
表3
也测定防止氧化的相对保护值如下RP＝100％-[(用保护性化合物的谱带强度)÷(在没有保护性化合物情况下的谱带强度)]在表4中显示了所述单克隆抗体蛋白样品的防止氧化的相对程度的结果。(A＝抗T淋巴细胞抗原的抗体，B＝抗肿瘤表面抗原的抗体)表4
结果在不存在螯合剂组合或螯合剂与ROS清除剂的组合的情况下，这两种单克隆抗体蛋白样品都显示出氧化；不仅通过银染色的SDS-PAGE，通过目测明显的新谱带，而且通过相当于导致氧化、分解和聚集的化合物例如抗坏血酸、金属、吐温-80以及甘油的已知谱带的强度增强，来看出这一点。对于含有螯合剂组合或螯合剂与ROS清除剂的组合的每一种情况，蛋白样品的分解和聚集都被显著地减少，正如通过大大地减少凝胶上的谱带强度所表示的。
2.对IgG、BSA、hGH、PTH和ACTH氧化的保护作用在有附加的螯合剂与ROS清除剂的组合的情况下，研究了人的免疫球蛋白G(IgG)、牛血清白蛋白(BSA)、人生长激素(hGH)、甲状旁腺激素(PTH)和促肾上腺皮质激素(ACTH)。用最适于所述蛋白或肽分子量的凝胶浓度，通过SDS-PAGE，来测定保护的程度。将凝胶银染色，然后用BIO-RAD GS-800光密度计扫描。利用有关的QuantityOne软件，检测出不断探测到的、表示氧化相关物质种类(不但聚集体、而且分解产物)的所述谱带并将其定量。光密度分析提供“校正的体积”，即表示带的强度总和的、且对任何染色背景进行过校正的带强度。最合适的保护剂混合物应该使这些校正的强度值减到最小。将所述蛋白样品的浓度与对应的凝胶浓度概括于表5中。
表5
用4mM抗坏血酸和金属(1μM Cu和1μM Fe)处理所有的蛋白样品。所测试的附加的组合包括没有螯合剂，100μM DTPA和20μMDEF，100μM DTPA和3％甘露醇，100μM DTPA和25mM甲硫氨酸，100μM DTPA和25mM组氨酸，100μM DTPA、20μM DEF和25mM甲硫氨酸，以及100μM DTPA、20μM DEF和3％甲硫氨酸。所述抗体蛋白溶液包含溶于PBS中的1mg/ml的蛋白与或者0.01％吐温-80或者2％甘油。在室温下温育所有的样品达至少48小时，然后将其贮藏在4℃。
结果因暴露在金属和抗坏血酸中，IgG不仅显示出氧化诱导的分子量较高的聚集体的增加，而且显示出所述抗体氧化的分解产物和迁移到重链与轻链之间的物质；这种IgG与先前实施例中所研究的抗体相似。把氧化保护性化合物组合引入到IgG样品中，则减少氧化降解。
因暴露在金属与抗坏血酸中，BSA显示出两种主要的降解产物(强度大于原来“主带”的强度(即通过银染色的SDS-PAGE，对应于样品中最大量的主要蛋白种类的带))。DTPA和DEF的所有组合以及螯合剂与ROS清除剂的所有组合，阻止这些氧化物质的形成(没有可探测出的带)。
因暴露在金属和抗坏血酸中，人生长激素显示出有略微小些的表观分子量的带，可能起因于异构化。在含有DTPA和DEF组合的样品中，以及在含有这些螯合剂与ROS清除剂的组合的样品中，检测不出该带。
在PTH方面，暴露在金属和抗坏血酸中，则增加聚集物质的数量。用DTPA和DEF组合处理，以及用这些螯合剂与ROS清除剂的组合处理，则减少所述的聚集物质。
在ACTH方面，暴露在金属与抗坏血酸中，则产生许多聚集物质。在含有DTPA与DEF组合样品中，以及在含有这些螯合剂和ROS清除剂的组合的样品中，这些物质被减少。
表6概述了用前面提到的蛋白和肽的实验结果。总的说来，包含DTPA和DEF的组合，以及包含这些螯合剂和ROS清除剂的组合，导致在各种各样的蛋白浓度、蛋白大小和蛋白类型(抗体、激素等等)方面的可以计量的保护作用。
表6
实施例7同研究蛋白氧化的GPC-HPLC方法的相关性GPC-HPLC除银染色的SDS-PAGE外，用GPC-HPLC来探查蛋白聚集的发生以及起因于氧化的分子量和/或三级结构的变化。在整个这项研究期间，采用抗T淋巴细胞抗原的抗体。本研究的焦点在单体主峰(即全部(未受影响的)蛋白(一般在12-12.2分钟洗脱出))的变化上以及在聚集体峰的演变上。遭受到氧化性损伤的样品不但在主峰保留方面显示出相当大的变化(减少)，而且在主峰形状方面显示出相当大的变化(变宽)。对于氧化性损伤规模大的蛋白样品，看到保留时间为9-9.5分钟及7.3分钟的两个另外的峰(这些对应于柱空体积)。抗坏血酸和金属螯合剂一般以14-16分钟的保留时间洗脱出来，而对应的峰被忽略不计。
在暴露于铜和抗坏血酸的样品方面，观察到各螯合剂之间的保护的差异。DTPA处理过的样品显示在12.175分钟的尖的单体峰，表示天然抗体结构的特征，而DEF的该样品的主峰是变宽且位移的(提示与天然完整抗体相比的抗体结构的变化)，其保留时间为11.5分钟。与通过SDS-PAGE而观察到的最大量氧化性损伤有关的EDTA也有宽的、位移的单体峰和另外的聚集体峰。
在用抗坏血酸和铁处理的一套类似的蛋白样品中，GPC-HPLC的层析谱类似于SDS-PAGE的结果；即DTPA提供较差的保护，这以一种变宽且位移的峰的形式被观察到，而去铁胺处理的样品有一种较靠近所述天然抗体峰的单体峰。EDTA处理的样品的层析谱清楚显示出氧化性损伤的存在。
生物活性/结合亲和性挑选四个有代表性样品来测定生物活性。通过测定滴定抗原所需要的抗体浓度，来确定结合亲和性；用ELISA来测定生物活性。在表7中显示了结果。
表7
结果所有三个方法SDS-PAGE、GPC和ELISA一致地显示氧化导致对蛋白结构破坏，结果是活性的相当大的损失；而加入防止氧化的赋形剂例如DTPA、DEF及其组合，则防止由于氧化过程的生物活性损失。
实施例8同研究蛋白氧化的光氧化方法的相关性在样品的光氧化方面，用SDS-PAGE而观察到的谱带与化学氧化和实时稳定性研究中看到的谱带一致。蛋白样品的分子量和通过凝胶的洗脱图提示聚集体和分解产物是有关的产物，例如，重链和轻链的氧化交联体(linkages)。本实验聚焦较短时标的光氧化实验，与化学氧化实验平行地进行。这允许一起比较由两种类型的氧化过程产生的物质。
把包括抗体的、浓度1mg/ml的蛋白样品(抗免疫受体(immunoreceptor)的抗体和抗T淋巴细胞抗原的抗体)用作试验蛋白。缓冲条件包括如同先前描述的PBS，而且也包括DTPA(1mM)、甘露醇(10％)、甲硫氨酸(15mM)和组氨酸(50mM)。也组合DTPA(1mM)和甘露醇(10％)。为了产生化学氧化，使样品暴露于4mM抗坏血酸和1μM铜及1μM铁中。通过银染色的SDS-PAGE，来分析样品。
对于这两种蛋白样品，在一天10X的光照处理后，观察到性质不同的光氧化物质的演变。观察到光氧化的抗免疫受体抗体物质和化学氧化的物质之间的同样的谱带顺序。然而，在抗T淋巴细胞抗原的抗体方面，在光氧化物质谱带和化学氧化谱带之间，有明显的差异。这表明本发明的制剂在减少起源于不同类型机制的氧化性物质方面是有效的。
结果用1mM DTPA处理的样品显示出超过无保护样品的某些改善。用甘露醇、DTPA/甘露醇和组氨酸处理的样品也显示出保护作用。在减少所目测的在SDS-PAGE的重链和轻链之间的光氧化物质形成方面，甲硫氨酸是特别有用的。
结论上述实施例表明，氧化导致蛋白(特别是单克隆抗体)的相当大的破坏，而通过将蛋白与金属螯合剂的精选组合配制在一起，可减少氧化性损伤；所述金属螯合剂即或者单独包括DTPA、EGTA和DEF的金属螯合剂，或者包括配合一种或多种ROS清除剂(例如甘露醇、组氨酸和/或甲硫氨酸)的DTPA、EGTA和DEF的金属螯合剂。上述实施例进一步显示DTPA和DEF对减少氧化有意想不到的协同作用。尤其是，或者有ROS清除剂或者没有ROS清除剂的至少0.1mMDTPA和0.02mM DEF的组合，作为通用的添加物，在保护抗体及其它蛋白制剂的防止氧化方面，是有效的。上述实施例更进一步显示螯合剂EDTA具有的对蛋白的破坏作用，以及上述组合物可以防氧化或“拯救”受该EDTA影响的蛋白。
等同实施方案本领域技术人员将会认识到或者仅仅用常规实验就能够确定，本文中描述的本发明具体实施方案的许多等同实施方案。所附权利要求书包括这样的等同实施方案。本申请中所引用的所有参考文献、专利和出版的专利申请的全部内容通过引用结合到本文中。
权利要求
1.一种包含蛋白的组合物，所述蛋白与DTPA和DEF配制在一起。
2.一种包含蛋白的组合物，所述蛋白与EGTA和DEF配制在一起。
3.权利要求1或2的组合物，所述组合物还包含选自以下的ROS清除剂甘露醇、甲硫氨酸和组氨酸。
4.一种包含蛋白、DTPA和ROS清除剂的组合物，所述ROS清除剂选自甘露醇、甲硫氨酸和组氨酸。
5.权利要求1、3或4中任一项的组合物，其中所述DTPA的浓度为约1μM至约10mM。
6.权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述DEF的浓度为约1μM至约5mM。
7.权利要求3-5中任一项的组合物，所述组合物包含浓度约0.01％至约25％的甘露醇。
8.权利要求3-5中任一项的组合物，所述组合物包含浓度约10μM至约200mM的甲硫氨酸。
9.权利要求3-5中任一项的组合物，所述组合物包含浓度约100μM至约200mM的组氨酸。
10.权利要求1-9中任一项的组合物，所述组合物还包含抑制蛋白聚集的试剂。
11.权利要求10的组合物，其中所述抑制蛋白聚集的试剂选自聚山梨酯80、聚山梨酯20、甘油和泊洛沙姆聚合物。
12.权利要求11的组合物，其中所述抑制蛋白聚集的试剂是浓度0.001％至约0.1％的聚山梨酯80或聚山梨酯20。
13.权利要求1-12中任一项的组合物，所述组合物还包含保持组合物的pH在约5.0至约8.0的缓冲剂。
14.权利要求13的组合物，其中所述缓冲剂选自磷酸盐、柠檬酸盐、Tris、乙酸盐、MES、琥珀酸、PIPES、Bis-Tris、MOPS、ACES、BES、TES、HEPES、EPPS、乙二胺、磷酸和马来酸。
15.权利要求1的组合物，所述组合物包含甘露醇、聚山梨酯、Tris和氯化钠，其中所述蛋白是抗体或其片段。
16.权利要求1-15中任一项的组合物，其中所述蛋白的浓度为约1μg/ml至约500mg/ml。
17.权利要求1-16中任一项的组合物，其中所述蛋白是抗体或其片段。
18.权利要求17的组合物，其中所述抗体是单克隆抗体或其片段。
19.权利要求17的组合物，其中所述抗体是人抗体或其片段。
20.权利要求17-19中任一项的组合物，其中所述抗体与选自以下的试剂缀合毒素、聚合物、造影剂和药物。
21.权利要求1-20中任一项的组合物，其中所述蛋白是微囊化的。
22.权利要求1-21中任一项的组合物，其中所述组合物是药用组合物。
23.一种用于制备稳定蛋白组合物的方法，所述方法包括将蛋白与DTPA和DEF配制在一起。
24.一种用于制备稳定蛋白组合物的方法，所述方法包括将蛋白与EGTA和DEF配制在一起。
25.权利要求23或24的方法，所述方法还包括添加选自以下的ROS清除剂甘露醇、甲硫氨酸和组氨酸。
26.一种用于制备稳定蛋白组合物的方法，所述方法包括将蛋白与DTPA和ROS清除剂配制在一起，所述ROS清除剂选自甘露醇、甲硫氨酸和组氨酸。
27.一种用于保护蛋白以防氧化的方法，所述方法包括将所述蛋白与DTPA和DEF配制在一起。
28.一种用于保护蛋白以防氧化的方法，所述方法包括将所述蛋白与EGTA和DEF配制在一起。
29.权利要求27或28的方法，所述方法还包括添加选自以下的ROS清除剂甘露醇、甲硫氨酸和组氨酸。
30.一种用于保护蛋白以防氧化的方法，所述方法包括将所述蛋白与DTPA和ROS清除剂配制在一起，所述ROS清除剂选自甘露醇、甲硫氨酸和组氨酸。
31.权利要求23-30中任一项的方法，其中所述DTPA或EGTA的浓度为约1μM至约10mM。
32.权利要求23-30中任一项的方法，其中所述DEF的浓度为约1μM至约5mM DEF。
33.权利要求25、26和29-32中任一项的方法，其中所述氧化保护性化合物选自约0.01％至约25％的甘露醇、约10μM至约200mM的组氨酸和约10μM至约200mM的甲硫氨酸。
34.权利要求23-33中任一项的方法，所述方法还包括向所述组合物中加入抑制蛋白聚集的试剂。
35.权利要求23-33中任一项的方法，所述方法还包括向所述组合物中加入保持pH在约5.0至约8.0的缓冲剂。
36.权利要求35的方法，其中所述缓冲剂选自约5mM至约100mM的磷酸盐、柠檬酸盐、Tris、乙酸盐、MES、琥珀酸、PIPES、Bis-Tris、MOPS、ACES、BES、TES、HEPES、EP、乙二胺、磷酸和马来酸。
37.权利要求36的方法，其中所述组合物包含甘露醇、聚山梨酯、Tris和氯化钠，其中所述蛋白是抗体或其片段。
38.权利要求23-37中任一项的方法，其中所述蛋白的浓度为约1μg/ml至约500mg/ml。
39.权利要求23-38中任一项的方法，其中所述蛋白是抗体或其片段。
40.权利要求39的方法，其中所述抗体是人抗体或其片段。
41.权利要求39或40的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或其片段。
42.权利要求39-41中任一项的方法，其中所述抗体与选自以下的试剂缀合毒素、聚合物、造影剂或药物。
43.权利要求23-42中任一项的方法，其中所述蛋白是微囊化的。
44.权利要求23-43中任一项的方法，其中所述组合物是药用组合物。
全文摘要
提供用于防止蛋白、尤其是抗体的氧化性损伤的方法和组合物。所述组合物包括金属螯合剂例如DTPA、EGTA和/或DEF的组合；并且可以还包括一种或多种自由基清除剂、特别是氧自由基清除剂。还公开了用本发明组合物来增强蛋白稳定性的方法。
文档编号C08K5/17GK1703233SQ03821189
公开日2005年11月30日 申请日期2003年7月11日 优先权日2002年7月12日
发明者J·K·茨尼, A·D·纳吉 申请人:米德列斯公司