专利名称：用于增强与人类疾病相关的突变蛋白质的降解的物质与方法
技术领域：
本发明用于增强与人类疾病相关的突变蛋白质的降解的物质与方法。
背景技术：
蛋白质必须折叠为其正确的三维构象以达成其生物功能。多肽的 本质构象是被编码于一级氨基酸序列，而且即使氨基酸序列中的单一 突变可损及蛋白质达成其正常构象的能力。当蛋白质无法正确地折叠 时，生物的及临床的效果可被摧毁。蛋白质凝集与折叠为许多人类疾 病的主要出力者，例如常染色体显性遗传视网膜色素变性(autosomal dominant retinitis pigmentosa)、阿耳茨海默氏病、a 1-抗胰蛋白 酶缺乏症、囊胞性纤维症、肾性尿崩症与病原素媒介(prion-mediated) 的感染。其它的蛋白质折叠失调中，例如常染色体显性遗传视网膜色 素变性、帕金森氏病与亨延顿氏舞蹈症、由于错误折叠蛋白质的细胞 毒性效果而有病理结果。
错误折叠蛋白质被ER质量调控系统辨识且作为藉由蛋白酶体的降 解所标的。除了蛋白酶体途径以外，自体吞噬为蛋白质降解的另一主要细胞机制。虽然自体吞噬可被各种细胞内与细胞外的压力所刺激， 包括氨基酸匮乏、错误折叠蛋白质的凝集与损伤胞器的累积，自体吞 噬显现为大致非选择性的步骤。与亨延顿氏舞蹈症有关的倾向于凝集 物的多麸氨酸与多丙氨酸的扩张蛋白质藉由自体吞噬降解，而且于亨 延顿氏舞蹈症的苍蝇与老鼠的模式中，自体吞噬的抑制减低突变亨延 顿氏舞蹈症蛋白质的毒性。自体吞噬亦已显示对累积于ER之蛋白质清 除的贡献。如果增加自体吞噬的方法可行，其可能增强错误折叠蛋白 质的清除，而且清除与错误折叠蛋白质的累积相关的细胞毒性。目前 急切需要用于缓和错误折叠蛋白质的细胞毒性与预防神经功能的方 法。
发明内容
本发明特征的组合物与方法有用于治疗或预防由增强的错误折叠
蛋白质的降解所引起的蛋白质构象紊乱症(PCD)。
于一态样中， 一般而言，本发明提供用于个体预防或治疗蛋白质
构象紊乱症(PCD)的方法，所述的方法包括对所述的个体(例如人类 患者)给药有效量的增强自体吞噬蛋白质降解的化合物。于一具体例 中，所述的化合物(例如雷帕霉素、法尼基转移酶抑制剂、FTI-277或 其类似物)抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)或抑制脑中富集的Ras 同源体(Rheb)。于另一具体例中，所述PCD选自下述所成组群的一者 或多者al-抗胰蛋白酶缺乏症、囊胞性纤维症、亨延顿氏舞蹈症、 帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、肾性尿崩症、癌症及库贾氏症。于又 一具体例中，所述PCD为眼睛的PCD且选自下述所成组群的一者或多 者视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性(例如湿性或干性)、青光 眼、角膜营养不良、视网膜劈裂症、斯塔尔加特病、常染色体显性遗 传脉络膜小疣及贝斯特氏黄斑营养不良。于其它具体例中，所述的方 法进一步包括对个体(例如人类患者)给药11-顺式-视黄醇、9-顺式_ 视黄醇或11-顺式-视黄醇的7-环锁异构物。
于另一态样中，本发明提供用于个体(例如人类患者)预防或治疗 眼的蛋白质构象紊乱症(PCD)的方法，所述的方法包括对所述的个体给 药有效量的增强自体吞噬蛋白质降解的化合物。于另一态样中，本发明提供用于个体(例如人类患者)预防或治疗 视网膜色素变性或黄斑变性的方法，所述的方法包括对所述的个体给 药增强自体吞噬蛋白质降解的化合物；与给药11-顺式-视黄醇或9-顺 式-视黄醇，其中所述的11-顺式-视黄醇或9-顺式-视黄醇与化合物对 所述个体为同时或彼此于14日内给药足量以治疗或预防视网膜色素变 性或黄斑变性。
于另一态样中，本发明提供用于个体(例如人类患者)预防或治疗 蛋白质构象紊乱症(PCD)的方法，其中所述PCD选自下述所成组群的一 者或多者a1-抗胰蛋白酶缺乏症、囊胞性纤维症、亨延顿氏舞蹈症、
帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、肾性尿崩症、癌症及库贾氏症，所述 的方法包括对所述的个体给药增强自体吞噬的化合物足量以治疗或预
防个体的PCD。于一具体例中，本发明进一歩包括鉴定患者为具有PCD
的歩骤。于又一具体例中，本发明进一步包括测量细胞中错误折叠蛋 白质、自体吞噬标记或自体吞噬液泡的浓度或表达。于一具体例中，
所述PCD为囊胞性纤维症且所述的方法进一步包括给药选自下述所成 组群的任选一种或多种药剂:抗生素、维生素A、 D、 E及K补充物、 沙丁氨醇支气管扩张剂、脱氧核糖核酸酶及依普洛芬。于又一具体例 中，所述PCD为亨延顿氏舞蹈症且所述的方法进一步包括给药选自下 述所成组群的任选一种或多种药剂氟呱丁苯、吩噻嗪、利血平、丁
苯那嗪、金刚氨及辅酶QIO。于又另一具体例中，所述PCD为帕金森氏 病且所述的方法进一歩包括给药选自下述所成组群的任选一种或多种
药剂左旋多巴、金刚氨、甲磺酸溴隐亭、培高利特、阿朴吗啡、节
丝肼、麦角乙脲、美舒麦角、麦角乙脲、麦角腈、美金氨、麦角苄酯、 吡贝地尔、对羟基苯乙氨、酪氨酸、苯丙氨酸、马来酸甲磺酸溴隐亭、 马来酸培高利特、抗组织氨、抗抑郁剂及单氨氧化酶抑制剂。于又另
一具体例中，所述PCD为阿耳茨海默氏病且所述的方法进一步包括给
药选自下述所成组群的任选一种或多种药剂多萘哌齐、利凡斯的明、 加兰他敏及他可林。于又另一具体例中，所述PCD为肾性尿崩症且所 述的方法进一步包括给药选自下述所成组群的任选一种或多种药剂 氯噻嗪/盐酸氯噻嗪、阿米洛利及吲哚美辛。于又另一具体例中，所述 的方法进一步包括给药选自下述所成组群的任选一种或多种药剂醋酸阿比特龙、六甲蜜氨、脱水长春碱、奥瑞斯坦丁、贝沙罗汀、必卡
他氨、BMS184476、 2， 3， 4， 5， 6-五氟-N-(3-氟_4-甲氧基苯基)苯磺酰氨、 博来霉素、N，N-二甲基-L-缬氨酰基-L-缬氨酰基-N-甲基-L-缬氨酰基 -N-脯酰氨基-1-L-脯氨酸-第三丁基酰氨、恶病质素、西马多丁、苯丁 酸氮芥、环磷酰氨、3' ，4' -二脱氢-4， _脱氧-8， - noi'vin-长春花 碱(caleukoblastine)、多西赛他、多西泰素、环磷酰氨、卡钼、卡莫 司汀(BCNU)、顺铂、念珠藻环肽、阿糖胞苷、达卡巴嗪(DTIC)、更生 霉素、柔红霉素、海兔毒素、多柔比星(阿霉素)、依托泊甙、5-氟尿 嘧啶、非那留氨、氟他氨、羟基脲及羟基脲紫杉垸、异环磷酰氨、利 阿唑、氯尼达明、洛莫司汀(CCNU)、双氯乙基甲氨(氮芥)、美法仑、 羟乙基磺酸米布尔、利索新、司替尼、链脲霉素、丝裂霉素、甲氨蝶 呤、尼鲁米特、奥那司酮、太平洋紫杉醇、泼尼莫司汀、丙卡巴肼、 RPR109881、磷酸司特目斯汀、黛莫芬、太索内明、紫杉醇、维甲酸、 长春花碱、长春新碱、硫酸长春地辛及维氟明。
于另一态样中，本发明提供增强细胞中(例如眼部细胞、神经元、 上皮细胞)错误折叠蛋白质的降解的方法，所述方法包括使细胞接触有 效量的增强自体吞噬的蛋白质。于一具体例中，本方法进一步包括测 量细胞中(例如哺乳动物细胞，如人类细胞，活体外或活体内)错误折 叠蛋白质、自体吞噬标记或自体吞噬液泡的浓度或表达。于又另一具 体例中，所述的方法进一步包括使所述的眼部细胞接触ll-顺式-视黄 醇、9_顺式-视黄醇或ll-顺式-视黄醇的7-环锁异构物。于又另一具 体例中，所述细胞包括形成凝集物或纤维的突变蛋白质(视蛋白、 myocilin蛋白、脂褐质蛋白、P-H3蛋白)。
于又另一态样中，本发明提供用于治疗PCD的医药组合物，包括 于医药可接受的赋型剂中的mT0R抑制剂或其类似物。
于又另一态样中，本发明提供用于治疗眼部PCD的医药组合物， 包括于医药可接受的赋型剂中的有效量的增强自体吞噬的化合物。
于又另一态样中，本发明提供用于治疗视网膜色素变性或年龄相 关性黄斑变性的医药组合物，包括于医药可接受的赋型剂中的有效量 的11-顺式-视黄醇或9-顺式-视黄醇以及有效量的自体吞噬抑制剂。
于又另一态样中，本发明提供用于治疗眼部PCD的试剂盒，所述试剂盒包括有效量的11-顺式-视黄醇或9-顺式-视黄醇以及有效量的 雷帕霉素或其类似物。
于又另一态样中，本发明提供用于治疗视网膜色素变性或年龄相 关性黄斑变性的试剂盒，所述试剂盒包括有效量的11-顺式-视黄醇或
9-顺式-视黄醇以及有效量的雷帕霉素或其类似物。
于又另一态样中，本发明提供鉴定有用于治疗PCD个体(例如人类 患者)的化合物的方法，所述方法包括于活体外表达错误折叠蛋白质的 细胞接触候选化合物；以及相对于对照细胞决定所述细胞中自体吞噬 的增加，其中于经接触细胞自体吞噬的增加鉴定化合物有用于治疗患 有PCD的个体。
于又另一态样中，本发明提供鉴定有用于治疗患有视网膜色素变 性或年龄相关性黄斑变性个体(例如人类患者)的化合物的方法，所述 方法包括于活体外表达错误折叠蛋白质的细胞接触11-顺式-视黄醇 (11-顺式-视黄醇的7-环锁异构物)或9-顺式-视黄醇，与候选化合物； 以及相对于对照细胞决定所述细胞中自体吞噬的增加，其中于经接触 细胞自体吞噬的增加鉴定化合物有用于治疗患有视网膜色素变性的个 体。 '
于又另一态样中，本发明提供鉴定有用于治疗患有囊胞性纤维症 个体(例如人类患者)的化合物的方法，所述方法包括于活体外表达错 误折叠蛋白质的细胞接触候选化合物；以及相对于对照细胞决定所述 细胞中自体吞噬的增加，其中于经接触细胞自体吞噬的增加鉴定化合 物有用于治疗患有囊胞性纤维症的个体。于一具体例中，所述错误折 叠蛋白质包括突变。于另一具体例中，所述错误折叠蛋白质为视蛋白， 例如包括P23H突变的视蛋白。于又另一具体例中，自体吞噬增强为通 过监控蛋白浓度而测定；通过由监控自体吞噬标记的表达；或通过监 控自体吞噬液泡的数目。
于又另一态样中，本发明提供用于个体(例如人类患者)预防或治 疗蛋白质构象紊乱症(PCD)的方法，所述的方法包括对所述的个体给药 有效量的增强雷帕霉素或FTI-277生物活性的化合物。于一具体例中， 所述化合物与雷帕霉素或其类似物合并给药，或所述化合物与FTI-277 或其类似物合并给药。于又另一具体例中，所述PCD选自下述所成组群的任何一者或多者al-抗胰蛋白酶缺乏症、囊胞性纤维症、亨延 顿氏舞蹈症、帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、肾性尿崩症、癌症及库 贾氏症。于另一具体例中，所述PCD为眼睛的PCD且选自下述所成组 群视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、青光眼、角膜营养不良、 视网膜劈裂症、斯塔尔加特病、常染色体显性遗传脉络膜小疣及贝斯 特氏黄斑营养不良。于另一具体例中，所述方法进一步包括对个体给
药11-顺式-视黄醇、9-顺式-视黄醇或ll-顺式-视黄醇的7-环锁异构物。
于又另一态样中，本发明提供用于个体(例如人类患者)预防或治 疗视网膜色素变性的方法，所述的方法包括对所述的个体给药雷帕霉
素或FTI-277和增强雷帕霉素或FTI-277的生物活性的化合物。于一 具体例中，本发明进一步包括对所述体给药11-顺式-视黄醇或9-顺式 -视黄醇，其中所述的11-顺式-视黄醇或9-顺式-视黄醇与化合物对所 述体为同时或彼此于14日内给药足量以治疗或预防个体的视网膜色素 变性。
于又另一态样中，本发明提供用于个体(例如人类患者)预防或治 疗蛋白质构象紊乱症(PCD)的方法，所述的方法包括合并给药雷帕霉素 或FTI-277其类似物与增强雷帕霉素或FTI-277的生物活性的化合物， 其中所述雷帕霉素或FTI-277及化合物各给药足量以治疗或预防个体 的PCD。
于又另一态样中，本发明提供用于增强细胞中错误折叠蛋白质降 解的方法，所述的方法包括使细胞(例如眼部细胞、神经细胞、上皮细 胞)接触有效量的雷帕霉素、FTI-277或其类似物与增强雷帕霉素或 FTI-277的生物活性的化合物，其中所述雷帕霉素或FTI-277及化合物 各给药足量以增强该蛋白的降解。于一具体例中，所述方法进一步包 括使细胞接触11-顺式-视黄醇、9-顺式-视黄醇或11-顺式-视黄醇的 7-环锁异构物。
于又另一态样中，本发明提供用于治疗眼部PCD的医药组合物， 包括于医药可接受赋形剂中的雷帕霉素、FTI-277或其类似物与增强雷 帕霉素或FTI-277的生物活性的化合物，其中所述雷帕霉素或FTI-277 及化合物各呈现足量以治疗或预防个体(例如人类患者)的PCD。于又另一态样中，本发明提供鉴定有用于治疗患有PCD的个体(例 如人类患者)的化合物的方法，所述方法包括在自体吞噬增强剂的存在 或不存在下，使活体外表达错误折叠蛋白质的细胞接触候选化合物； 以及相对于对照细胞决定所述细胞中自体吞噬的增加，其中于经接触 细胞自体吞噬的增加鉴定化合物有用于治疗患有PCD的个体。
于又另一态样中，本发明提供鉴定有用于治疗患有视网膜色素变 性的个体(例如人类患者)的化合物的方法，所述方法包括使活体外表 达错误折叠蛋白质的细胞接触ll-顺式-视黄醇或9-顺式-视黄醇与雷 帕霉素或FTI-277，与候选化合物；以及相对于对照细胞决定所述细胞
中自体吞噬的增加，其中于经接触细胞自体吞噬的增加鉴定化合物有 用于治疗患有视网膜色素变性的个体。
于又另一态样中，本发明提供鉴定有用于治疗患有囊胞性纤维症
的个体的化合物的方法，所述方法包括使活体外表达错误折叠CFTR蛋 白的细胞接触候选化合物与雷帕霉素或FTI-277;以及相对于对照细胞 决定所述细胞中自体吞噬的增加，其中于经接触细胞自体吞噬的增加 鉴定化合物有用于治疗患有囊胞性纤维症的个体。
于上述任何态样的各种具体例中，所述PCD选自下述所成组群的 任何一者或多者al-抗胰蛋白酶缺乏症、囊胞性纤维症、亨延顿氏 舞蹈症、帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、肾性尿崩症、癌症及库贾氏 症。于上述任何态样的又其它具体例中，所述PCD为眼睛的PCD且选 自下述所成组群的一者或多者视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变 性(例如湿性或干性)、青光眼、角膜营养不良、视网膜劈裂症、斯塔 尔加特病、常染色体显性遗传脉络膜小疣及贝斯特氏黄斑营养不良。 于上述任何态样的再其它具体例中，所述的化合物抑制哺乳动物雷帕 霉素靶蛋白(mTOR)或抑制脑中富集的Ras同源体(Rheb)。于上述任何 态样的一较佳具体例中，所述眼睛的PCD为视网膜色素变性或黄斑变 性，例如年龄相关性黄斑变性(例如湿性或干性)。于上述任何态样的 再其它具体例中，所述的方法进一步包括对个体(例如哺乳动物，如人 类)给药11-顺式-视黄醇、9-顺式-视黄醇或11-顺式-视黄醇的7-环锁 异构物。于上述任何态样的较佳具体例中，所述个体包括影响蛋白质 折叠的突变(例如在视蛋白中的突变，如P23H突变或在CFTR的突变，如AF508)。于上述任何态样的再其它具体例中，所述降解对错误折叠 蛋白质有选择性。于上述任何态样的再其它具体例中，有用于本发明
的方法的化合物为雷帕霉素、法尼基转移酶抑制剂、FTI-277或该等化 合物的类似物。于再其它具体例中，所述的方法进一步包括对个体给 药11-顺式-视黄醇、9-顺式-视黄醇或11-顺式-视黄醇的7-环锁异构 物。于又另一具体例中，所述的化合物抑制哺乳动物雷帕霉素耙蛋白 (mTOR)或抑制脑中富集的Ras同源体(Rheb)。于上述任何态样的各种 具体例中，所述个体(例如人类或兽医动物患者)包括影响蛋白质折叠 的突变，例如在视蛋白中的突变(例如P23H突变)。于再其它具体例中， 所述降解对错误折叠蛋白质有选择性。于再其它具体例中，所述11-顺式-视黄醇或9-顺式-视黄醇与化合物彼此于24小时内、于3日内或 于5日内给药。于上述任何态样的其它具体例中，所述11-顺式-视黄 醇或9-顺式-视黄醇与化合物为同时给药。于再其它具体例中，所述 l卜顺式-视黄醇或9-顺式-视黄醇与化合物为对眼睛给药；例如眼内给 药。于再另一具体例中，所述11-顺式-视黄醇或9-顺式-视黄醇与化 合物为各自并入组合物以提供其长时间的释放(例如微球体、纳米球体 或纳米乳化物)。于再另一具体例中，所述长时间的释放通过药物传递 装置。于再另一具体例中，所述的方法进一歩包括给药维生素A补充 物。于上述任何态样的其它具体例中，自体吞噬增强为通过监控蛋白 浓度而测定；通过由监控自体吞噬标记的表达；或通过监控自体吞噬 液泡的数目。
第1A至II图显示相对于野生型(WT)视蛋白对于错误折叠P23H视 蛋白的选择性降解的自体吞噬。第1A、 1C及1E为免疫墨点分析显示 HEK-293细胞稳定地使用野生型视蛋白(第1A图)或P23H视蛋白(第1C 图)转染且使用雷帕霉素或氨基酸耗竭诱发自体吞噬的视蛋白的蛋白 质表达。第1E图中P23H视蛋白表达细胞进一步使用11-顺式视黄醇处 理。显示为自体吞噬诱发的时程。第1B、 1D及1E图为显示野生型(第 1B图)、P23H视蛋白(第1D图)以及P23H视蛋白使用11-顺式视黄醇解 救(第1F图)的经时降解图。下述状况分别注记为下述符号培养基有氨基酸(令)、氨基酸匮乏(議)、有雷帕霉素(A)以及氨基酸匮乏但有
雷帕霉素(鲁)。第1G、 IH及II图为免疫墨点分析。第1G图显示于野 生型与P23H表达细胞诱发自体吞噬后mTOR的去磷酸化。第1H及II 图显示于细胞表达P23H(第1H图)或细胞表达P23H也使用11-顺式视 黄醇处理(第II图)的自体吞噬状况中，伴随子Bip、钙联蛋白及Hsp70 的蛋白质表达。
第2A至2F图显示相对于野生型引起AF508的增生降解的自体吞 噬。第2A及2C图为免疫墨点分析显示BHK细胞稳定第使用野生型 CFTR (第2A图)或△ F508 (第2C图)转染接着进行氨基酸耗竭(4至6行) 或雷帕霉素处理50mM(7至9行)或两者(10至12行)的HA-标示的CFTR 表达。第2B及2D图为显示野生型CFTR(第2B图)及AF508(第2D图) 的经时降解图。下述状况分别注记为下述符号培养基有氨基酸(命)、 氨基酸匮乏(■)、有雷帕霉素(▲)以及氨基酸匮乏但有雷帕霉素(參)。 第2E图为免疫墨点分析显示于野生型CFTR与AF508表达细胞诱发自 体吞噬后mTOR的去磷酸化。第1H及II图显示于细胞表达野生型CFTR 或AF508的自体吞噬状况中，伴随子Bip、钙联蛋白及Hsp70的调节。
第3A至3B图为显示表达野生型视蛋白(第3A图)或P23H视蛋白 (第3B图)的HEK-293细胞使用免疫荧光染色自体吞噬标记的显微图。 染色显示自体吞噬标记与P23H视蛋白的错误折叠凝集物共定位。视蛋 白(中间组)使用自体吞噬标记(左侧组)Atg7、 LC3及LAMP-1的共定位 系显示于正常与氨基酸耗竭的状况。
第4A至4B图为显示表达野生型CFTR(第4A图)或AF508 (第4B 图)的BHK细胞使用免疫荧光染色自体吞噬标记的显微图。自体吞噬标 记与AF508CFTR蛋白质共定位而保留于ER。 HA-标示CFTR(中间组)使 用自体吞噬标记(左侧组)Atg7、 LC3及LAMP-1的共定位系显示于正常 与氨基酸耗竭的状况。
第5A至5C图显示细胞的三种电子显微图。第5A图显示细胞中 P23H凝集物以视紫质(rhodopsin)与免疫金标识的染色。第5B及5C 图显示于自体吞噬细胞中溶酶体与自体吞噬液泡。
第6图为显示于视网膜色素变性的P23H老鼠模式中雷帕霉素处理 增强视黄醇功能的条状图。对照组P23H1与P23H2为表达一倍体P23H视蛋白的基因转殖小鼠。Rap-P23HA与B为表达一倍体P23H视蛋白且 使用雷帕霉素处理的基因转殖小鼠。WT-1、 2及3为野生型对照小鼠。 Rap-WTA及B为接受雷帕霉素野生型对照小鼠。各条表示单一小鼠的 ERG分析。
第7图为显示于黄斑变性的老鼠模式中雷帕霉素处理增强视黄醇 功能的条状图。各条表示单一老鼠的ERG分析。
第8图为西方墨点分析显示于P23H表达细胞使用法尼基转移酶抑 制剂FTI-277处理的P23H蛋白质降解。用于微管蛋白的西方墨点分析
显示于下方作为负载对照。词语〃馈入〃标记培养状况有氨基酸以及含 血清培养基；词语"F+R"标记馈入与使用雷帕霉素处理；词 语"F+FTI277"标记馈入以及使用10 u M或50 u M的FTI277处理。西 方墨点分析使用微管蛋白为探针显示于下方作为蛋白质负载对照。
第9A至9B图显示FTI-277处理造成P23H视蛋白降解结果。第9A 图为显示于24小时的时程中使用FTI-277的Rheb抑制后P23H视蛋白 浓度的免疫墨点分析。P23H视蛋白表达细胞使用10tiM(8至IO行)或 50 " M(ll至13行)的FTI277处理。雷帕霉素(5至7行)处理使用作为 阳性对照。亦使用氮基酸及血清馈入对照(2至4行)。微1^蛋白作为负 载对照。第9B图为显示于P23H视蛋白表达细胞中，于2小时(h)、 6 小时即12小时的比较雷帕霉素与FTI-277 (50 iiM)处理的免疫墨点分 析的带像素强度的降解图。
第10图为显示伴随子钙联蛋白、钙网蛋白、Hsp70及Hsp90浓度 的免疫墨点分析组。此工作分析以时间依赖方式的FTI-277对于未折 叠蛋白质响应与热休克响应两者的效果，与显示自体吞噬排除UPR与 HSR。
第11A至11C图显示FTI-277阻隔S6K与mTOR磷酸化的免疫墨点 分析组。第11A图显示S6K的磷酸化状态系于雷帕霉素与FTI-277处 理后的两小时内测定。第11B图显示mTOR的磷酸化状态系于12小时 的时程使用雷帕霉素、FTI-277与FTI-277合并氨基酸与血清缺乏而测 定。
第12A至12C图为显示于FTI-277处理后自体吞噬体标记的免疫 共定位的系列显微图。第12A图显示Atg7染色与第12B图显示Atg8染色。该等标记于使用FTI-277处理后观察与P23H视蛋白凝集物的共 定位。氨基酸馈入与雷帕霉素处理的细胞使用作为对照。第12C图显 示细胞使用FTI-277处理的共轭焦影像。共胶影像轻处第显示自体吞 噬体标记Atg7与Atg8与P23H视蛋白凝集物间的细胞间共定位。自体 吞噬体抗体为经TRITC(左)标示与适蛋白为经FITC(右)标示。
第13A至第13C图显示细胞对于FTI-277处理的自体吞噬响应。 第13A图显示使用溶酶体探针作为标记，观察FTI-277处理后细胞中 溶酶体代谢途径的向上调控。第13图显示电子显微图超结构分析，其 于使用FTI-277的细胞处理6小时后进行。使用cMPase细胞化学处理 细胞以目视可见溶酶体以及自体溶酶体。第13C图为显示FTI-277处 理2小时后与6小时后进行形态学分析的结果图。使用氨基酸与血清 馈入比较FTI-277处理后的自体吞噬诱发。
第14图显示于FTI-277处理后HuH7细胞中GFP-LC3的过度表达 的共轭焦分析。
第15A与15B显示FTI-277诱发自体吞噬。第15A图显示使用自 体吞噬抑制剂3MA处理细胞后所进行的免疫墨点分析。3MA抑制藉由 FTI-277诱发的P23H视蛋白降解。氨基酸与血清匮乏细胞(顶行)使用 作为对照以观察24小时的P23H视蛋白的累积。类似地，FTI-277处理 于3MA存在时(淡灰条)呈现P23H视蛋白降解。相较于单独以FTI-277 处理(深灰调)，于3MA处理的细胞于12小时观察到视蛋白的最大累积。 第15B图显示P23H过度表达细胞于馈入(淡灰条)与FTI-277处理(深 灰条)状况使用蛋白酶体抑制剂，MG132,处理12小时，显示MG132于 缺乏中未干扰错误折叠P23H视蛋白的降解。
第16图为胰岛素/T0R/S6K代谢途径的示意图，显示藉由FTI-277 与雷帕霉素的抑制位置。PI3激酶的活化导致Akt的磷酸化。TSC1/2 作用微GAP以活化Rheb，换言之为磷酸化mTOR。 mTOR的抑制导致细胞 自体吞噬的诱发。藉由FTI-277之Rheb的强力抑制所诱发的自体吞噬 类似于藉由雷帕霉素的mTOR抑制所诱发的自体吞噬。
具体实施方式
定义
"哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)"意为对于GenBank读取编号P42345具有至少85%或95%同一性的多肽序列。
"抑制mTOR"意为降低至少10。/。的至少一种相关于mT0R的生物活 性。范例的"mTOR生物活性〃包括mTOR激酶活性、细胞中自体吞噬的 诱发、细胞循环进程的调控、DNA重组与DNA损伤侦测。抑制mTor与 S6激酶的磷酸化的化合物也抑制mTOR生物活性。
"脑中富集的Ras同源体(rheb)"意为对于GenBank读取编号 NP—005605具有至少85%或95%同一性的多肽序列。
"抑制rheb"意为降低至少10%的至少一种相关于mTOR的生物活 性。范例的"rheb生物活性"包括自体吞噬的诱发、inTOR的磷酸化、 鸟嘌呤核苷酸结合活性与GTPase活性。
"蛋白质构像疾病"意为疾病或疾患的病理有关于错误折叠蛋白 质的存在。于一具体例中，当错误折叠蛋白质干扰细胞、组织或器官 的正常生物活性而引起蛋白质构像疾病。
"雷帕霉素生物活性"意为自体吞噬的增强、mTOR抑制、T-淋巴 球增生的抑制、淋巴因子(lymphokine)分泌的抑制、酵母细胞增生的 抑制、蛋白质降解的增强、或相关于雷帕霉素对细胞或有机体给药的 任何其它效果。
"自体吞噬蛋白质降解"意为藉由自体吞噬实质上发生的降解。 "类似物"意为结构性相关于参考化合物且与参考化合物共享主 要相同功能的化合物。类似物亦意为参考化合物的衍生物或代谢物。 "增强〃亦为至少10%、 15%、 25%、 50%、 75%或100%的正转变。 "错误折叠蛋白质〃意为相对于参考蛋白质具有影响其三级结构 的转变的蛋白质。错误折叠蛋白质的范例包括视蛋白的突变形式(例如 P23H视蛋白)，亦即相对于视蛋白参考序列(例如GenBank读取编号 應—000539及NP—000530)具有序列转变的形式以及人类CFTR的突变 形式(例如，具有[Delta]F508突变)，亦即相对于CFTR参考序列(例 如，GenBank读取编号AAA35680， NP—000483， P13569)具有序列转 变的形式。
词语"微球体"意指具有生物活化物质并如其中的实质上球型胶 体结构物。 一般而言，微球体具有于约0.5uM至约500uM范围内的
尺寸分布。当结构物直径小于1微米，则可使用相对应词语"纳米球体"。
"纳米乳化物"意指包含小的液体结构物的油于水中分散物。于
一实施例中，纳米乳化物包含具有约0. 5至5微米平均粒径的液滴的 油相。
"降低"意为至少10%、 25%、 50%、 75%或100%的负转变。 "选择性降解"意为优先地影响错误折叠蛋白质的降解，因此正 确折叠蛋白质实质上不受影响。于各种具体例中，少于45%、 35%、 25%、 15%、 10%或5%的正确折叠蛋白质受到降解。
如使用于本文，词语〃治疗〃、"处理"、"处置"(treat、 treating、 treeatment)等意指降低或缓和疾病及/或与疾病相关的症 候。应明了，虽然不排除，治疗疾病或症状不需要所述的疾病、症状 或与其相关的症候为完全地消除。
如使用于本文，词语，，予页防，，(prevent 、 preventing 、 preventation)、"预防性治疗"等意指降低于个体发展疾病或症状的 可能性，该个体不具有但处于可能发展失调或症状的风险。
本发明特征为组合物与方法，有用于增强活体内错误折叠蛋白质 的降解。 一般而言，本发明系基于发现本发明的化合物(例如雷帕霉素、 FTI-277、其类似物与变异物)增强突变蛋白质的降解。有利地，突变 蛋白质为特定地降解，而期望野生型式的浓度保留大量地未改变。错 误折叠蛋白质可干扰正常细胞功能，且可引起细胞毒性，导致人类蛋 白质构像紊乱症(PCD)。 PCD包括c:l-抗胰蛋白酶缺乏症、囊胞性纤维 症、亨延顿氏舞蹈症、帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、肾性尿崩症、 癌症及病原素媒介的疾患(例如库贾氏症)。本发明的组合物与方法特 别有用于预防或治疗眼的PCD，包括视网膜色素变性、年龄相关性黄斑 变性(湿性型与干性型)、青光眼、角膜营养不良、视网膜劈裂症、斯 塔尔加特病、常染色体显性遗传脉络膜小疣及贝斯特氏黄斑营养不良。 本发明的组合物可使用于治疗PCD，以减缓受影响细胞的死亡，缓和 PCD所引起的症候，或从起始的第一位置预防PCD。
自体吞噬增强剂
自体吞噬为用于细胞质中细胞组成降解的演化上保留机制，且于饥饿细胞中作为细胞救赎机制。于自体吞噬中，细胞质小片由细胞膜 封为囊，形成自体吞噬液泡，该液泡可能与溶酶体融合而使其内含物
降解。自体吞噬增强剂可独立使用或与11-顺式视黄醇、、9-顺式-视黄 醇或11-顺式-视黄醇的7-环锁异构物组合用于治疗PCD。自体吞噬增
强剂雷帕霉素特别有用于治疗视网膜色素变性与其它眼的疾病以及用 于囊胞性纤维症与相关于错误折叠蛋白质或蛋白质凝集物的其它疾 病。自体吞噬增强剂有用于本发明的方法包括，但不限于雷帕霉素、
FTI-277与其盐或其类似物。 雷帕霉素
雷帕霉素 (Rapamune , sirolimus， Wyeth)为由吸水链霉菌 (&e^湖yc6^勿^roscc^'cz^)所生产的环状内酯。雷帕霉素微免疫抑 制性药物，其抑制T-淋巴球活化与增生。雷帕霉素结合至且抑制哺乳 动物的雷帕霉素标耙(mTOR)，为细胞循环进展所需要的激酶。mT0R激 酶活性的抑制阻隔T-淋巴球增生与淋巴因子分泌。
雷帕霉素结构与功能类似物包括单酰基化-与二酰基化雷帕霉素 衍生物(美国专利编号4， 316,885);雷帕霉素水溶性前药(美国专利编 号4， 650， 803) ; (PCT Publication No. WO 92/05179);氨基甲酸酯类(美 国专利编号5，118，678);酰氨酯类(美国专利编号5， 118， 678);生物素 酯类(美国专利编号5， 504， 091);氟化酯类(美国专利编号5， 100， 883); 縮醛类(美国专利编号5,151,413);硅烷酯类(美国专利编号 5， 120， 842);双环衍生物(美国专利编号5, 120， 725);雷帕霉素二量体 (美国专利编号5， 120， 727) ; 0-芳基，0-烷基，0-烯基与0-炔基衍生 物(美国专利编号5，258，389);与重氢化雷帕霉素(美国专利编号 6， 503， 921)。其它的雷帕霉素类似物包括CCI-779、 (Wyeth Ayerst)、 他克莫司(tacrol imus)、卩比维莫司(pimecrolimus) 、 AP20840 (Ariad Pharmaceutics) 、 AP23841 (Ariad Pharmaceutics)与ABT-578 (Abbott Laboratories) 、 SAR943 (32-脱氧基雷帕霉素，Eynott等人， Immunology. 109 (3) : 461-7， 2003)与依维莫司(everolimus) (SDZ RAD)。依维莫司Everolimus (40-0-(2-羟乙基)雷帕霉素(CERTICAN， Novartis)为结构性类似于雷帕霉素的免疫抑制大环内酯。其它的雷帕霉素类似物叙述于美国专利编号5， 202， 332与5， 169, 851。
雷帕霉素目前用于口服给药为液体与锭剂配方物。RAPAMUNE. TM. 液体含有1 mg/mL雷帕霉素而于给药前稀释于水或柳橙果汁中。含有1 或2 mg雷帕霉素的锭剂亦可取得。雷帕霉较加为每日给药一次。口服 给药后吸收快速且完全。典型地，雷帕霉素的患者剂量根据患者状况 而改变，但某些标准建议剂量提供于下文。雷帕霉素的起始负载剂量 为6 mg。后续维持剂量典型为2 mg/day。或者，3 mg、 5 mg、 10 mg、 15 mg、 20 mg或25 mg的负载剂量可与1 mg、 3 mg、 5 mg、 7 mg或10 mg 的每日维持剂量使用。体重低于40kg的患者，雷帕霉素剂量典型地基 于体表面积而调整； 一般而言，使用3 mg/mVday负载剂量与1 mg/m7day 维持剂量。
法尼基转移酶抑制剂
法尼基转移酶抑制剂抑制法尼基化，法尼基化为蛋白质的后转译 修改而增加经修改的蛋白质的亲水性而引起其定位于细胞膜的表面。 对细胞膜的定位典型地为法尼基化蛋白质的正常功能所需。法尼基受 体部分已于各种蛋白质中特征化为于标靶蛋白质的羧基端发现四个氨 基酸序列。此四个氨基酸序列已特征化为-C-A-A-X，其中"C"为半胱氨 酸残基，"A"为任何脂肪族氨基酸与"X"为任何氨基酸。法尼基转 移酶抑制剂(FTIs)，例如FTI-277，抑制Ras与其它法尼基化蛋白质(例 如Rheb)的后转译脂质代谢。如同更详细的下文所述，FTI-277为范例 的法尼基转移酶抑制剂，具由去活化mT0R而于细胞诱发自体吞噬。mT0R 负调控自体吞噬作为响应于氨基酸的AKT/PKB的下游标靶。根据部分 的本发明，其它抑制法尼基转移酶的药剂亦可有用于本发明的方法。
有用于本发明方法的法尼基转移酶抑制剂已知于此项技术且叙述 于，例如美国专利编号:7， 022， 704、 6， 936， 431 、 6， 800， 636、 6， 790， 633、 6, 740, 661、 6， 737， 410、 6， 576, 639、 6， 528， 523、 6， 498' 152、 6， 440， 974、 6， 432， 959、 6,410,541、 6,399,615、 6， 372， 747、 6， 362， 188;于其它 具体例中，叙述3-巯基吡咯啶酮类FTIs，例如美国专利编号6, 946， 468; 5-经取代四氢萘酮类(tetralones)FTIs叙述于，例如美国专利编号 6， 943， 183;双环抑制剂叙述于美国专利编号6， 528， 535;与三唑类作为法尼基转移酶抑制剂叙述于，例如美国专利编号20050234117。有用于 本发明的方法的其它范例的FTIs叙述于美国专利申请案编号 20060079530、 20050148609、 20050059672与20050020516;与于下述 科学文献Santucci等人，Cancer Control 10:384-387， 2003; Megnin- Chanet等人，BMC Pharmacology, 2:2， 2002, BMS-214662; 与Appels等人，(The Oncologist, 10: 565-578, 2005)。范例的法 尼基转移酶抑制剂包括但不限于为Santucci等人所叙述的Rl 15777、 GGTI-2166 、 BMS-214664， Cancer Control 10:384-387， 2003; Megnin-Chanet等人所叙述的RPR-130401， BMC Pharmacology, 2:2， 2002; BMS-214662 (Bristol-Myers Squibb， Princeton, NJ) ; L778123 (Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ) ; tipifarnib(试验 的名称，Rl 15777; Zarnestra(TM) ; Ortho Biotech Products, L. P.， Bridgewater， NJ) ; lonafarnib (试验的名称，SCH66336; Sarasar(TM); Schering-Plough Corporation, Kenilworth， NJ); FTI-277 (Calbiochem， EMD Biosciences, San Diego);与L744832 (Biomol International L.P. ， Plymouth Meeting, PA)。
FTIs的建议临床^flj量典型地为每日界于100 ug与10， 000 mg。给 药可为此项技术所知的任何方法。特别地tipifarnib口服给药150、 200、 300、 400、 500与600 mg的剂量每日两次持续21日。Lonafarnib 口服给药100、 200、 300，与400 mg的剂量每日两次于连续疗程。 BMS-214662典型地为静脉内给药每3周一次输注1小时以100 mg/m2、 200 mg/m2、 275 mg/m、 300 mg/m2》24小时输注；或者BMS-214662 以每周排程300 mg/m2与每周排程102 mg/m2。 BMS-214662给药的每日 基准为81 mg/m2亦有用于本发明的方法。给药FTIs的其它模式已知于 此项技术，且叙述于例如Appels等人(The Oncologist, 10: 565-578， 2005)。
目艮蛋白质构"(象紊舌L症(Ocular Protein Conformational Disorders)
本发明的组合物特别有用于实质的任何眼蛋白质构像紊乱症 (Ocular Protein Conformational Disorders; PCD)。.该疾患特征化 为于眼内错误折叠蛋白质的累积为蛋白质凝集物或纤维化。本发明的组合物选择性地增强错误折叠蛋白质的降解而保留正确折叠蛋白质的 浓度大幅地未受影响。视网膜色素变性为范例的眼PCD其相关于视蛋 白的错误折叠蛋白质(例如P23H视蛋白)(GenBank读取编号 NM—000539与NP—000530)，以及与碳酸酐酶IV (CA4)的突变)(GenBank 读取编号NM—000717 and NP—000708) (Rebello等人，Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Apr 27; 101 (17) : 6617-22) 。 CA4为糖基化磷脂酰肌 醇锚定蛋白质，其为高度表达于人类眼睛的脉络膜微血管。R14W突变 引起CA4蛋白质为不正确折叠且带有此突变的患者患有常染色体显性 遗传视网膜色素变性。增强CA4多肽的突变型的降解的本发明的组合 物有用于与CA4多肽的突变相关的常染色体显性遗传视网膜色素变性 的治疗。
X染色体串联视网膜裂损症(X-linked juvenile retinoschisis (RS))为另一眼PCD。 RS为男性青少年黄斑退化(juvenile macular degeneration)的常见成因。于RSI (NM—000330， NP—000321)的突变、 或retinoschesin基因有责于X关联视网膜裂损症，于男性为常见、 早发型黄斑变性，而结果导致视网膜内层的分裂以及视力的严重损失。 于RSI的突变破坏蛋白质折叠(J Biol Chem. 2005 Mdr 18:280(11): 10721 -30)。增强RSI突变型的降解的本发明组合物有用于视网膜裂 损症的治疗。
青光眼为眼PCD与myocilin蛋白质的突变有关。Myocilin蛋白质 为普遍表达于许多人类器官(包括眼睛)的未知功能的分泌性糖蛋白。 于此myocilin蛋白的突变引起一种型的青光眼，为世界上失明的主要 原因。突变的myocilin蛋白累积于转染细胞的内质网作为不溶性凝集 物(Aroca-Aguilar等人，Biol Chem. 2005 Jun 3; 280 (22) : 21043-51; GenBank读取编号NMJ300261与NP—000252)。增强myocilin蛋白的 突变型降解的本发明组合物有用于myocilin蛋白相关的青光眼的治 疗。
类斯塔尔加特黄斑病为眼PCD且与EL0VL4的突变相关。EL0VL4 (非 常长链脂肪酸4的延长)为参予非常长链脂肪酸生合成的蛋白质ELO家 族的成员。EL0VL4的突变已于患有常染色体显性遗传类斯塔尔加特黄 斑病(STGD3/adMD)的患者受到鉴定。EL0VL4突变蛋白质于转染细胞累积为大凝集物(Grayson等人，J Biol Chem. 2005 Jul 21; Epub) (GenBank读取编号NM—022726 and NP一073563)。增强EL0VL4突变的 降解的本发明组合物有用于类斯塔尔加特黄斑病的治疗。
遗传性黄斑改变性疾病(Malattia Leventinese; ML)与多恩巢状 式网膜萎縮(Doyne honeycomb retinal dystrophy; DHRD)为两种常染 色体显性遗传PCDs其特征化为累积于视网膜色素细胞(RPE)下方的己 知为小疣的黄-白沉积物。EFEMP1于脉络膜小疣形成扮演要角且肾及黄 斑变性的病原学(Stone等人，Nat Genet. 1999 Jun; 22 (2) : 199-202) (GenBank读取编号NM_004105与NP—004096)。突变的EFEMP1为错物 折叠且保留于细胞内。增强EFEMP1突变型的降解的本发明组合物有用 于常染色体显性遗传脉络膜小疣的治疗。
贝斯特氏黄斑营养不良为常染色体显性遗传PCD，其由编码 Bestrophin蛋白的VMD2 (hBESTl)的突变所引起，为CI (-)通道(Gomez 等人，DNA Seq. 2001 Dec; 12(5-6) :431-5) (GenBank i卖取编号 NM—004183与NP—004174)。于bestrophin蛋白的突变似乎引起蛋白质 错物折叠。增强正确折叠bestrophin蛋白的突变型的降解的本发明组 合物有用于贝斯特氏黄斑营养不良的治疗。
5q31 -关联的角膜营养不良为常染色体显性遗传PCDs其特征化 为年龄依赖性进展的角膜蛋白质沉积物的累积且接着视力损伤。于 5Z&M基因(GenBank读取编号醒_000358)，亦称为7^7^，/(转型生长 因子-0-诱发；transforming growth factor-[beta]-induced)对此 状况的全族群有责。Arg-124以及其它残基的取代，经由参予改变角膜 组织蛋白质更新的不同凝集途径。导致角膜特异的编码蛋白质 (GenBank读取编号.NP—000349)的沉积。增强正确折叠蛋白质的突变 型的降解的本发明组合物有用于5q31 -关联的角膜营养不良的治疗。
治疗方法
技术领域：
本发明提供治疗PCDs疾病及/或疾患或其症候(例如细胞毒性)的 方法，藉由选择性增强错误折叠蛋白质的降解。本方法包括对本文所 述个体(例如哺乳动物，如人类)给药有效量的含有化合物(例如mT0R 抑制剂，如雷帕霉素、法尼基转移酶抑制剂(如FTI-277))的医药阻合物。因此， 一具体例为治疗个体患有或怀疑有蛋白质构像疾病或疾患 或其症候的方法。所述方法包括对哺乳动物给药治疗量的本文化合物 足量以治疗疾病或疾患或其症候，以使疾病或疾患受到治疗的条件。
本发明的方法包括对个体(包括鉴定为需要改治疗的个体)给药足 量的本文所述化合物或本文所述组合物，以产生该效果。鉴定需药该 治疗的个体可为个体的或健康照护专业的判断且可为主动性(例如意 见)或被动性(例如由测试或诊断方法测量)。
本发明的治疗方法，包括预防疗法， 一般包括给药医疗有效量的 本文所述化合物，例如对有需要的个体(例如动物、人类)，包括哺乳 动物(特别是人类)给药化合物的配方物。该治疗适合对个体给药，包 括人类，患有、具有、怀疑有或有风险于疾病、疾患或其症候。该等 个体有无处于风险的测定可藉由诊断测试或个体或健康照护提供者的 意见(例如基因测试、酵素或蛋白质标记、标记(如本文所述)、家族使 等)的任何被动性或主动性的判定。本文所述组合物亦可适用于治疗蛋 白质折叠(包括错误折叠)可能引起的任何其它疾病。
于一具体例中，本发明提供侦测治疗进展的方法。本方法包括于 患有或怀疑有与蛋白质折叠(包括错误折叠)相关的疾病或其症候的个 体，测定诊断标记(标记)(例如藉由本文所述化合物所调节的任何本文 所述的标耙，蛋白质或其指示剂等)浓度或诊断测定(例如筛选、分析) 的步骤，其中该个体经给药治疗量的本文所述化合物足以治疗该疾病 或其症候。本发明方法中标记浓度的测定可与健康正常对照组或其它 患病患者中的标记相比较以建立该个体的疾病状态。于较佳具体例中， 个体中标记的次级浓度于第1浓度测定后的时间点测定，且比较两浓 度以侦测疾病的进展或治疗的疗效。于某些较佳具体例中，个体中标 记的治疗前浓度根据本发明于开始治疗前测定；标记的治疗前浓度可 与疗法后的个体中标记浓度相比较，以测定治疗的疗效。
医药组合物
本发明特征为医药制剂，包括与医药可接受付型剂的化合物，其中， 该化合物提供错误折叠蛋白质的选择性降解。该制剂具有治疗与预防 两种应用。于一具体例中，医药组合物包括l卜顺式视黄醇或9-顺式视黄醇与增强错误折叠化合物的化合物组合。该11-顺式视黄醇或9-
顺式视黄醇与该化合物为一起或分别配方。本发明化合物可为医药组 合物的一部分给药。组合物应为无菌且含有适合对个体给药的医疗有 效量的该多肽的重量或容积单位。本发明的组合物与组合可为医药包 装物的一部分，其中各化合物呈单独的剂量。
如使用于本文，本发明化合物(包括本文所述配方物的化合物)定义 为包括其医药可接受的衍生物或前药。"医药可接受的衍生物或前 药"为本文化合物的任何医药可接受的盐、酯、酯的盐或其它衍生物， 于对接受者给药能提供(直接或间接)本发明的化合物。特别较佳的衍 生物与前药为当对哺乳动物给药(例如允许口服给药化合物更容易地 于血液中吸收)增加本发明化合物的生体可利用率或相对于母化合物 增强母化合物对生物组成(例如脑或淋巴系统)的传递。较佳的前药包 括衍生物，其中的基团增强水溶性或活化经由肠膜的传递子，付于本
文所述配方物的结构物。参照Alexander, J.等人y0wr;2W i/edicjW C力簡'"2T 1988， 31， 318-322; Bundgaard, H. "esi卵of 尸ro(ir收5"; Elsevier: Amsterdam, 1985; pp 1-92; Bundgaard， H.; Nielsen, N. M.ofi/ec/2'ci朋7 C/ ,'stry 1987， 30， 451-454; Bundgaard, H. A Text^cia^ of Z r收"ew'卵a/7(^"ei^/ci，e/^; Harwood Academic Publ. : Switzerland, 1991; pp 113-191; Digenis, G. A. 等人j7a/ 必o。A Zy/ erj'7Z7e/7力aJ尸力ar鹏ccJo《y 1975, 28， 86- 112; Friis， G. J. ; Bundgaard, H. A r^YZ^oc^: of Z r收/fe57'卵朋J "eyeJop膨/^; 2 ed. ; Overseas Publ. : Amsterdam, 1996; pp 351-385; Pitman, I. H. i/ec/ici朋2 / esearc力j eriew^ 1981， 1， 189-214; Sinkula， A. A. ; Yalkowsky. TowztjsJ 0/ ,AgiTM3cew力ic37 5"cie/7ces 1975， 64， 181-210; Verbiscar， A. J. ; Abood, L. G加，J o/" GWs^T 1970，13，1176-1179; Stella， V.J.; Himmelstein， K. J. Towr朋2 i/eo^'ci朋7 C力e肌'str7 1980， 23， 1275-1282; Bodor， N. ; Kaminski， J. J.y e/ orz^ i/7 C力簡'Wir 1987， 22， 303-313。
本发明的化合物可'经由补充的合适功能性修改而增强选择性生物 性质。该等修改已为此项技术所知且包括增加生物穿透性至指定的生物组成(例如血液、淋巴系统、神经系统)，增加口服可利用率、增加 溶解性以允许藉由注射给药、改变代谢与改变排初速率者。 本发明化合物的医药可接受盐类包括该等衍生自医药可接受无机与有 机的酸类与碱类。适合的酸盐类的范例包括醋酸盐、己二酸盐、褐藻 酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、重硫酸盐、酪酸盐、柠檬 酸盐、樟脑盐、樟脑磺酸盐、葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、 甲酸磺酸盐、延胡索酸盐磺酸盐、葡庚酸盐、羟乙酸盐、半磺酸盐、 庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟乙基磺酸盐、 乳酸盐、顺丁烯二酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、 硝酸盐、波莫酸盐、果酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味 酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、 硫氰酸盐、甲苯磺酸盐与十一垸酸酯盐。其它酸类，例如草酸，虽然 其本身不为医药可接受的，但可作为获得本发明化合物及其医药可接 受的酸加成盐类的中间体，应用于盐类的制备。衍生自合适碱的盐类
包括碱金属(例如钠)、碱土金属(例如镁)、铵与N-(烷基)/盐类。本发
明亦设想揭示于本文化合物的任何含氮基团的四级化
(quaternization)。水可溶或油可溶或可分散的产物可由该四级化获 得。
本发明的医药组合物使用于预防或治疗给药应为无菌。无菌容易 地藉由通过无菌过滤膜(例如0.2um膜)过滤、藉由伽玛射线、或藉由 任何此项技术领域已知的合适方法而完成。 一般而言，治疗的多肽组 合物放置于具有无菌组合件的容器，例如静脉内溶液袋或具有可藉由 皮下注射针头穿刺的栓塞的小瓶。该等组合物习惯性地储存于单位或 单位剂量容器，例如，密封的安瓶或小瓶，为水溶液或为用于重组成 的冻干配方物。
化合物可藉由选择性地与医药可接受的付型剂组合。使用于本文 的词语"医药可接受的付型剂"意指适合对人类给药的一种或多种相 容的固体或液体填充物、稀释剂或封囊物质。词语"载剂"注记为有 机或无机成分，为天然或合成的，与活性成分组合而有助于给药。医 药组合物的成分亦能与本发明的分子、与其彼此，以使其无实质上损 伤所欲医药疗效的干扰的方式而共混合。付型剂较佳含有例如增强渗透性与化学稳定性的物质的微量添加 物。该等材料于施用剂量及浓度对接受者为无毒性，且包括缓冲液例 如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐、乳酸盐、酒石酸盐与其它 有机酸类或其盐类；三羟基甲基氨基甲烷(TRIS)、碳酸氢盐、碳酸盐 与其它有机碱类与其盐类；抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量(例如 少于10个残基)多肽，例如多精氨酸、多离氨酸、多麸氨酸与多天冬 氨酸；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合 物，例如聚乙烯基吡咯啶酮(PVP)、聚丙二醇(PPGs)与聚乙二醇(PEGs); 氨基酸，例如甘氨酸、麸氨酸、天冬氨酸、组氨酸、离氨酸或精氨酸； 单糖类、双糖类与其它碳水化合物包括纤维素或其衍生物，葡萄糖、 甘露糖、蔗糖、葡聚糖类或硫酸化碳水化合物衍生物，例如肝素、软 骨素硫酸盐或湖精硫酸盐；多价金属离子，例如二价金属离子，包括 钙离子、镁离子与锰离子；螯合剂，例如乙二氨四乙酸(EDTA);糖醇， 例如甘露糖醇或山梨糖醇；抗衡离子，例如钠或铵；及/或非离子性界 面活性剂，例如聚脱水山梨醇或泊洛沙姆(poloxamer)。其它衍生物可 包括，例如稳定剂、抗微生物剂、惰性气体、流体与营养补充剂(例如 林格氏葡萄糖)、电解质补充剂等，其可一惯用量存在。
如上所述，该组合物可给药有效量。有效量将依据给药模式、欲 处理的特定状况与所欲结果。亦可依据症状状态、个体的年龄与生理 状况、同时疗法的本质与医学实施者所熟知的任何因素。对于治疗应 用，量应足以达成医学上所欲结果。
对于具有蛋白质构像紊乱疾病或疾患的患者，有效量为足以增加 细胞中正确折叠蛋白质的浓度。对于具有相关于错误折叠蛋白质的剂 并或疾患的患者，有效量为足以稳定、降低或减低相关病原学的症候。 一般而言，本发明化合物的剂量形成每日约0. 01 mg/kg至每日约1000 mg/kg。期望剂量范围由约50至约2000 mg/kg为适合。较低剂量将导 致由某些给药型式，例如静脉内给药。于起始施用剂量为不充足的个 体反应的情况中，可额外施用于患者耐受性允许的较高剂量(或由不 同、更定位化的传递途径的有效较高剂量)。每日多次剂量可仔细考虑 以达成本发明组合物的合适全身性浓度。
有多种给药途径。 一般而言，本发明的方法可使用医学上可接受的任何给药模式，意指产生活性化合物的有效浓度而不引起临床上不 可接受的化效果的任何模式。于一较佳具体例中，本发明的组合物为 眼内给药。给药的其它模式包括口服、直肠的、局部的、眼内的、舌 下的、阴道内的、脑池内的、脑室内的、气管内的、鼻腔、穿皮的、 植入物内/上或肠胃外的途径。词语〃肠胃外的"包括皮下的、气管内 的、静脉内的、肌肉内的、腹腔内的或输注。包括本发明组合物的组 合物可添加至生理性流体，例如添加至玻璃体液(intravitreal humor)。用于CNS给药，有多种技术可选择用于促进疗法横过血脑屏 障的转移，包括藉由手术或注射的破坏、瞬间开启界于CNS血管内皮 细胞间的黏合接触与有助于通过该等细胞的转位的化合物。由于对患 者的便利性以及剂量排程，口服给药较佳可用于预防疗法。
本发明的医药组合物可视需要的迸一步如所欲的含有一种或多种 其它蛋白质，包括血浆蛋白质、蛋白酶与其它生物材料，只要对个体 给药不引起坏效果。合适的蛋白质或生物材料可藉由公开且为此项技 术领域已知的方法，由人类或哺乳动物血浆获得；由重组组织培养物 的上清液、萃取物或溶解物、病毒、酵母、细菌或含有根据标准重组 DNA技术导入表达人类或哺乳动物的血浆蛋白质的基因者；或由流体 (例如血液、乳、淋巴、尿液等)或含有根据标准重组DNA技术导入表 达人类或哺乳动物的血浆蛋白质的基因的基因转殖动物。
本发明的医药组合物可包括一种或多种pH缓冲化合物，以维持配 方物的pH于反应生理pH的预先决定的浓度，例如约5. 0至约8. 0的 范围。使用于液体配方物的pH缓冲化合物可为氨基酸或氨基酸的混合 物，例如组氨酸或例如组氨酸与甘氨酸的氨基酸的混合物。或者，pH 缓冲化合物较佳地为维持配方物的pH于预先决定的浓度(例如约5.0 至约8. 0的范围)的药剂，且该剂量不螯合钙离子。该等pH缓冲化合 物的说明实例包括但不限于咪唑与醋酸盐离子。pH缓冲化合物可以合 是于维持配方物的pH于预先决定的浓度的任何量存在。
本发明的医药组合物亦可含有一种或多种渗透调节剂，亦即调节 配方物的渗透性质(例如张性(tonicity)、渗透压及/或渗透压力)于接 受者个体的血流与血细胞可接受浓度的化合物。渗透调节剂可为任何 不螯合钙离子的试剂。渗透调节剂可为对熟习此项技术领域者为已知或可取得的调节配方物渗透性质的任何化合物。熟习此项技术领域者 可依经验地决定使用于本发明配方物的指定渗透调节剂的适合性。渗 透调节剂的合适型态的说明实例包括但不限于盐类，例如氯化钠与 醋酸纳；糖类，例如蔗糖、葡萄糖与甘露糖；氨基酸，例如甘氨酸； 与该等试剂及/或试剂型态的一种或多种的混合物。渗透调节剂可以足 以调节配方物的渗透性质的任何浓度存在。
包括本发明化合物的组合物可含有多价金属离子，例如钙离子、 镁离子及/或锰离子。有助于稳定组合物且对接受者个体无坏影响的任 何多价金属离子皆可使用。熟习此项技术领域者，基于两个准则，可 依经验地测定合适的金属离子与该等金属离子的合适来源为已知，且 包括无机与有机盐类。
本发明的医药组合物亦可为非水性液体配方物。任何合适的非水 性液体皆可使用，只要其对含于其中的活性成分提供稳定性。较佳地， 该非水性液体为亲水性液体。合适的非水性液体的说明实例包括甘 油；二甲亚碾(DMSO);聚二甲基硅氧烷(PMS);乙二醇，例如乙二醇、
二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇(PEG)200、 PEG300与PEG400;与聚丙 二醇，例如二丙二醇、三丙二醇、聚丙二醇(PPG)'425、 PPG725、 PPG1000、 PPG2000、 PPG3000与PPG4000。
本发明的医药组合物亦可为经混合的水性/非水性液体配方物。任 何合适的非水性液体配方物，例如上文所述者，可单独与任何水性液 体配方物，例如上文所述者， 一起施用，只要经混合的水性/非水性液 体配方物对含于其中的化合物提供稳定性。较佳地于该配方物中的非 水性液体为亲水性液体。合适的非水性液体的说明实例包括甘油； DMS0; PMS;乙二醇，例如PEG200、 PEG300与PEG400;与聚丙二醇， 例如PPG425、 PPG725、 PPG1000、 PPG2000、 PPG3000与PPG4000。
合适的稳定配方物可允许活性成分于冰冻或于未冰冻液体状态的
储存。依据组合物的性质，稳定的液体配方物可储存于至少-7crc的温
度，但亦可储存于至少0。C的较高温度或界于约0. rC与约42'C之间。 一般而言，对熟悉此项技术领者已知蛋白质与多肽对pH、温度与可影
响治疗效果的其它因子的多重性的变化敏感。
其它传递系统可包括经时释放、延迟释放或持续释放传递系统。该等系统可避免本发明组合物的重复给药，增加个体与医生的便利性。 已有许多型态的释放传递系统且为熟悉此项技术领域者所知。包括基
本系统例如聚乳酸(美国专利3，773,919;欧洲专利58, 481)、聚(乳酸 -甘醇)、共聚草酸酯、聚己内酯、聚酯酰氨、聚正交酯、聚羟基丁酸(例 如聚-D-(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利133，988)、 L-麸氨酸与Y-乙基-L-麸氨酸酯的共聚物(Sidman， K. R.等人，Biopolymers 22: 547-556)、 聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或醋酸伸乙基乙烯酯(Langer， R.等人，J. Biomed. Mater. Res. 15:267-277; Langer， R. Chem. Tech. 12:98-105) 与聚酸酐。
持续释放组合物的其它实例包括微形塑物(例如膜或微胶囊)形式 的半可渗透性聚合物基材。传递系统亦可包括非聚合物系统为；脂质 包括固醇类，例如胆固醇、胆固醇酯与脂肪酸或中性脂肪(例如单-、 二-与三-甘油酯；水凝胶(hydrogel)释放系统，例如生物性衍生的生 物可吸收水凝胶(亦即几丁质水凝胶或甲壳素水凝胶)；黏液系统；肽 为主系统；蜡被覆物；使用传统黏合剂与付型剂的压缩锭剂；部分融 合植入物等。具体实例包括但不限于；(a)剥蚀系统，其中试剂含有 鱼基质内的如叙述于美国专利编号4， 452， 775、 4， 667， 014、 4， 748， 034 与5,239,660以及(b)扩散系统，其中活性成分准许于经调控的速率 由聚合物渗透，例如叙述于美国专利编号3, 832， 253与3, 854， 480。
可使用于本发明的方法与组合物的传递系统的另一型态为胶体分 散系统。胶体分散系统包括脂质为主的系统(包括油于水中乳化物)、 胶团(micelles)、混合胶团与微脂体。微脂体为人工的膜管，其有用 于活体内或活体外的传递载体。大的单层管(LUV)，尺寸范围由0.2至 0.4wm，可包囊大的巨分子于水性内层中且可于生物活性型式传递至 细胞(Fraley， R. ， and Papahadjopoulos， D. ， Trends Biochem. Sci. 6: 77- 80)。
微脂体可藉由将微脂体耦合制特定配体(例如单株抗体、糖、糖脂 质或蛋白质)而标靶至特定组织。微脂体可由GibcoBRL商业取得，例 如，为LIPOFECTIN 与LIPOFECTACE ，其为阳离子性脂质，例如N-[I -(2， 3 二油酰基氧基)-丙基]-N, N， N-三甲基铵氯化物(DOTMA)与二 甲基二十八垸基铵溴化物(DDAB)。用于制造微脂体的方法已为此项技术领域所知且经叙述于许多文献，例如于德国专利3,218,121; Epstein等人,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980); EP52，322;欧洲专利36,676;欧洲专利88， 046;欧洲专利143,949; 欧洲专利142,641;日本专利申请案83-118008; U.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545; and欧洲专利102,324. Liposomes also have been reviewed by Gregoriadis， G. , Trends Biotechnol.， 3: 235-241)。
载体的另一形态为生物兼容性微球体或适合用于移植至哺乳动物 接受者的植入物。有用于本方法的生物可蚀性植入物的范例叙述于PCT 国际专利申请案号PCT/US/03307 (公开案号W0 95/24929，名称为 "Polymeric Gene Delivery System") 。 PCT/US/0307揭示生体可相容， 较佳地为生物可降解性聚合物基质，于合适启动子的调控下用于含有 外源性基因。该聚合性基质可使用于达成该外源性基因或基因产物于 个体的持续释放。
该聚合性基质较佳地为微颗粒形式，例如为微球体(其中试剂分散 于固体聚合物基质)或微胶囊(其中试剂储存于聚合物壳的芯)。上述含 有药物的聚合物的微胶囊例如叙述于美国专利5， 075， 109。用于含有试 剂的聚合物基质的其它形式包括膜、被覆物、胶、植入物与支架。聚 合物基质装置的尺寸与组成为选择使结果为于基质导入其中的组织中 的较佳释放动力学。聚合物基质的尺寸迸一歩依据所使用的传递方法 加以选择。较佳地，当使用气雾途径时，聚合物基质与组合物为包封 于界面活性剂载体。该聚合物基质组合物可选择为具有较佳降解速率 且亦可为生物黏合性材料的形式，以进一步增加转移有效性。该基质 组合物亦可选择为不降解，但经由扩散于延长的时间而释放。该传递 系统亦可为生物兼容性微球体，适合于定位、位置特定的传递。该微 球体叙述于Chickering， D. E.，等人，Biotechnol. Bioeng. ， 52: 96-101; Mathiowitz， E.,等人，Nature 386: 410-414。
非生物可降解性与生物可降解性的聚合物基质两者可使用对个体 传递本发明的组合物。该等聚合物可为天然的或合成的聚合物。聚合 物依据所欲释放的时间历程而加以选择， 一般而言，于数小时至一年或更长的顺序。典型地，释放的时间范围界于数小时与3至12个月之 间为最合宜。聚合物视需要地为水凝胶形式，可吸收约其重量90%的水， 且迸一步视需要地与多价离子或其它聚合物交联。
可使用于形成生物可降解传递系统的合成的聚合物的范例包括聚 酰氨、聚碳酸酯、聚烯、聚伸垸二醇、聚环氧烷、聚对酞酸伸烷酯、 聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯啶酮、 聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯与其共聚物、烷基纤维素、羟烷基纤维 素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸系与甲基丙烯酸系酯 的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟基-丙基甲基 纤维素、羟丁基甲基纤维素、纤维素醋酸酯、纤维素丙酸酯、纤维素 醋酸酯丁酸酯、纤维素醋酸酯酞酸酯、羧乙基纤维素、纤维素三醋酸 酯、纤维素硫酸酯钠盐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、 聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、 聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯 酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙 烯酸癸酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(对酞 酸伸乙酯)、聚(乙烯醇)、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙 烯吡咯啶酮与乳酸与甘醇酸的聚合物、聚酸酐、聚(正)酯聚(丁酸)与 聚(乳酸-共己内酯)，以及天然的聚合物例如褐藻酸盐与其它多醣类包 括糊精与纤维素、胶原蛋白、其化学衍生物(化学基团的取代、加成， 例如烷基、伸垸基、羟基化、氧化与其它为熟悉此项技术领域者所惯 常使用的修改)、白蛋白与其它亲水性蛋白质、玉米蛋白与其它醇溶蛋 白与疏水性蛋白质、共聚物与其混合物。 一般而言，该等材质于活体 内藉由酵素性水解或暴露于水，藉由表面或整块剥蚀而降解。
传递至肺上皮细胞的方法
于某些具体例中，例如用于囊胞性纤维症的治疗，其希望直接对肺 上皮细胞给药本发明的化合物，所希望的途径可为藉由肺气雾。用于 肺传递的药物可于卤化烃推进剂中作为水性配方物、作为悬浮物或溶 液，或作为干燥粉末给药。水性配方物必须藉由水性气雾器气雾化施 用于水利或超音速原子化，以推进剂为主的系统需要合适的加压的剂量计量吸入器，以及干燥粉末需要可有效地分散药物物质的干燥粉末 吸入器装置。对于水性与其它非加压的液体系统，各种气雾器(包括小 容积气雾器)可用于气雾化配方物。压缩器驱动的气雾器合并有注射技 术与使用压缩空气以产生液体气雾。超音波气雾器依赖机械能源以压 晶体管的振动形式产生适于呼吸的液体液滴。推进剂驱动吸入器于各 驱动释放经计量的医药品剂量。医药品配方为于合适推进剂中的药物 物质的悬浮物或溶液。干燥粉末吸入气正常为依赖吸入气体的爆发而 于该单位引出以传递药物剂量。该等装置叙述于例如美国专利
4， 807， 814与5， 785， 049。
肺部药物传递经由口与喉咙的器物的吸入而达成。具有约2至约5 微米直径的颗粒为够小而可达上-至中-肺部区域(导通气道)，但太大 而无法到达肺泡。甚至更小的颗粒，亦即约0.5至约0.2微米，始能 接近肺泡区域。具有直径小于约0.5微米的颗粒亦可藉由沉降于肺泡 区域沉积，然而非常小的颗粒可能被呼出。用于制备气雾传递系统的 技术已为熟悉此项技术领域者所知。参照美国专利案号4， 512， 341、 4， 566， 452、 4,746,067、 5， 008， 048、 6,796,303与美国专利申请案号 20020102294。熟悉此项技术领域者可轻易地修改各种参数与条件用于 生产肺气雾而不造成过度实验。
眼部传递的方法
技术领域：
本发明的组成物(例如自体吞噬增强剂、mTOR抑制剂(例如雷帕霉 素)、法尼基转移酶抑制剂(例如FTI-277))特别适合用于治疗眼蛋白质 构像紊乱症，例如视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、青光眼、 角膜营养不良、视网膜劈裂症、斯塔尔加特病、常染色体显性遗传脉 络膜小疣及贝斯特氏黄斑营养不良。
于一方向中，本发明的组合物为经由适合于经由眼睛的玻璃体直接 植入的眼部装置给药。本发明的组合物可提供为持续释放组合物，例 如叙述于美国专利5， 672， 659与5， 595， 760者。发现该等装置提供用 于治疗眼睛的多种组合物的持续调控释放，且无局部或全身性的不利 副作用。此眼部传递方法的目的为使含于眼内装置的药物或植入物的 量最大化而最小化其尺寸以延长植入物的历时。参照美国专利5， 378， 475; 6， 375, 972与6， 756， 058以及美国专利申请案20050096290 与200501269448。该等植入物可为生物可降解性及/或生物可兼容性植 入物，或可为非生物可降解性植入物。生物可降解性眼植入物叙述于 例如美国专利申请案20050048099。植入物对活性试剂可为可渗透性或 不可渗透性，且可插入眼腔室，例如前眼或后眼腔室或可移植入巩膜、 脉络裂入空间、或玻璃体外的无血管区域。或者，隐形眼镜可作为本 发明组合物的储存处亦可使用于药物传递。
于一较佳具体例中，植入物可放置于无血管区域，例如巩膜上，以 使药物的穿巩膜扩散至所欲的治疗位置，例如眼内空间与眼的黄斑部。 再者，穿巩膜扩散的位置较佳地为接近黄斑部。用于传递组合物的植 入物的范例包括但不限于叙述于下述美国专利的装置；3， 416， 530;
3， 828，777;4， 014， 3354，300， 5574, 327， 7254， 853， 224
4， 946，450;4， 997， 6525，147， 6475， 164， 1885， 178, 635
5， 300，114;5， 322， 6915，403, 9015， 443， 5055， 466， 466
5， 476，511;5， 516， 5225，632， 9845， 679， 6665， 710， 165
5， 725，493;5， 743, 2745，766， 2425， 766， 6195， 770， 592
5， 773，019;5， 824， 0725，824， 0735， 830， 1735， 836' 935
5， 869，079，5, 902， 5985，904， 1445， 916， 5846， 001， 386
6， 074， 661; 6， 110'485; 6,126,687; 6,146,366; 6， 251， 090; 与 6， 299， 895，以及于W0 01/30323 and W0 01/28474，其全部并入本文 作为参考文献。
实例包括但不限于下述者；持续释放药物传递系统，包括内容器(包 括有效量的试剂以有效的获得所欲局部性或全身性的生理或药物学效 果)，不可渗透至试剂通道的内管，该内管具有第一末端与第二末端且 包覆至少部份的内容器，内管的材质的尺寸与形式为使内管能支持其 本身重量，位置于内管第一末端的不可渗透膜，该不可渗透膜预防药 剂经由内管的第一末端通出容器，以及位置于内管第二末端的可渗透 膜，该可渗透膜允许试剂经由内管第二末端扩散至容器外；用于对眼 治疗给药本发明化合物的方法，该方法包括植入持续释放装置以对眼 的玻璃体传递本发明化合物的步骤，或植入物、用于对眼治疗给药本 发明化合物的持续释放装置；持续释放药物传递装置包括a)药物芯，包括医疗有效量的至少一种第一药剂以有效的获得诊断效果或有效的 获得所欲的局部性或全身性的生理或药学效果；b)至少一种一元式杯 果(unitary cup)基本上不可渗透至试剂通道且定义内部间隔以接受药 物芯，该一元式杯果包括具有环绕于该一元式杯果的开放顶端至少某 些部分的至少一嵌壁式沟的开放顶端；c)可渗透栓塞，其可渗透至试 剂通道，该可渗透栓塞位于该一元式杯果的开放顶端，其中该沟与可 渗透栓塞交叉于其位置且封闭该开放顶端，该可渗透栓塞允许试剂通 道于药物芯外，经过该可渗透栓塞，且通出于该一元式杯果的开放顶 端；以及d)至少一第二试剂有效于获得诊断效果或有效于获得所欲的 局部性或全身性生理或药物学的效果，或持续释放药物传递系统包括 内芯，其包括有效量的具有所欲稳定性与聚合物被覆层的试剂，该聚 合物层可渗透至该试剂，其中该聚合物被覆曾完全包覆内芯。
用于眼部传递的其它方向包括微脂体对眼睛标靶本发明化合物的 使用，且较佳地为对视黄醇色素上皮细胞及/或布氏膜(Bruch' s membrane)。例如，化合物可依上述方式与微脂体复合，且此化合物/ 微脂体复合物注射至具有眼PCD的患者，始用静脉注射将化合物导至 所欲眼部组织或细胞。直接注射微脂体复合物至视网膜色素上皮细胞 或布氏膜附近，亦可提供用于标靶复合物与某些眼部PCDs的形式。于 一具体实例中，化合物经由眼内持续传递(例如VITRASERT或ENVISION) 给药。于一具体实例中，化合物经由后筋膜下注射传递。于另一具体 实例中，含有本发明组合物的微乳化物颗粒传递至眼部组织以由布氏 膜、视网膜色素上皮细胞或两者取得脂质。
纳米颗粒为胶体担体系统，已显示藉由延长血清半衰期包囊药物有 改良的疗效。聚垸基氰基丙烯酸酯类(PACAs)纳米颗粒为于临床发展中 的聚合物胶体药物传递系统，叙述于Stella等人，J. Pharm. Sci., 2000. 89: p. 1452—1464; Brigger等人，Int. J. Pharm. ， 2001. 214: p. 37-42; Calvo等人，Pharm. Res. ， 2001. 18: p. 1157-1166; and Li等人，Biol. Pharm. Bull., 2001. 24: p. 662-665。生物可降解 聚(羟基酸类)，例如聚(乳酸)(PLA)与聚(乳酸-共-乙交酯)的共聚物为 强力地使用于生医应用且己受到FDA核准用于某些临床应用。此外， PEG-PLGA纳米颗粒具有许多期望的担体特征包括(i)欲包囊的试剂包括总担体系统的合理的高重量分率(负载)；(ii)使用于包囊处理的第 一步骤的试剂量以合理的高浓度并入最终担体(包封率)；(iii)该担体 具有冷冻干燥能力且于溶液中无凝集的重新组成；(iv)该担体微生物 可降解的；(V)该担体系统为小尺寸；以及(vi)该担体增强颗粒持久性。
纳米颗粒使用实际上任何生物可降解的壳而合成已为此项技术领
域所知。于一具体例中，使用聚合物，例如聚(乳酸)(PLA)或聚(乳酸-共-甘醇酸)(PLGA)。该等聚合物微生物可兼容与生物可降解，且进行 修改以期望增加纳米颗粒的光化学效果与循环生命期。于一具体例中， 该聚合物以终端羧基(C00H)修改而增加颗粒的负电合且因此限制与负 电荷核酸适体的交互作用。纳米颗粒亦可以聚乙二醇(PEG)修改，其亦 增加颗粒于循环中的半衰期与稳定性。或者，该C00H基团转为N-羟基 琥珀酰氨(NHS)酯用于共价连结至酰氨修改的适体。
有用于本发明的组合物与方法的生物可降解聚合物包括但不限于 聚酰氨、聚碳酸酯、聚烯、聚伸垸二醇、聚环氧烷、聚对酞酸伸烷酯、 聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯啶酮、 聚乙交酯、聚硅氧垸、聚氨酯与其共聚物、烷基纤维素、羟烷基纤维 素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸系与甲基丙烯酸系酯 的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟基-丙基甲基 纤维素、羟丁基甲基纤维素、纤维素醋酸酯、纤维素丙酸酯、纤维素 醋酸酯丁酸酯、纤维素醋酸酯酞酸酯、羧乙基纤维素、纤维素三醋酸 酯、纤维素硫酸酯钠盐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、 聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、 聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯 酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙 烯酸癸酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙垸)、聚(对酞 酸伸乙酯)、聚(乙烯醇)、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙 烯吡咯啶酮、聚玻尿酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酸酐、聚丙烯、 褐藻酸盐、甲壳素、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲 基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲 基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚 (丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸癸酯)与其任何组合。于一具体例中，本发明的纳米颗粒包括PEG-PLGA 聚合物。
本发明的组合物亦可为局部传递。用于局部传递，组合物于以核准 用于眼部传递的任何医药可接受的付型剂中提供。较佳地，该组合物 为液滴型式传递至眼睛表面。用于某些应用，组合物的传递依赖于化 合物通过巩膜至眼睛内部的扩散。
熟悉此项技术领域者应了解使用本发明的化合物治疗眼部PCD的
最佳治疗法可为直接测定。此非试验性质疑而是一种最适化，此点微 经常性地于医学技术领域中进行。于裸鼠的活体内研究经常提供最适 化剂量与传递法的起始点。经常于某些小鼠研究中，注射频率由每周 一次开始。然而，此频率可最适化调整由一天至每两周至每月，根据 由起始临床试验以及特定患者需求所获得的结果。
用于本发明组合物的人类剂量(例如自体吞噬增强剂，mTOR抑制剂 (例如雷帕霉素)、法尼基转移酶抑制剂(例如FTI-277))可启始由使用 于小鼠的化合物量推知而测定，熟悉此项技术领域者可辨知于相对于 动物模式，于此项技术领域中经常性地修改人类剂量。于某些具体例 中，设想剂量可由约1 mg化合物/Kg体重至约5000 mg化合物/Kg体 重；或由约5 rag/Kg体重至约4000 mg/Kg体重或由约10 mg/Kg体重 至约3000 mg/Kg体重；或由约50 mg/Kg体重至约2000 mg/Kg体重； 或由约100 mg/Kg体重至约1000 mg/Kg体重；或由约150 mg/Kg体重 至约500 mg/Kg体重。于其它具体例中，剂量可约l、 5、 10、 25、 50、 75、 100、 150、 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1000、 1050、 1100、 1150、 1200、 1250、 1300、 1350、 1400、 1450、 1500、 1600、 1700、 1800、 1900、 2000、 2500、 3000、 3500、 4000、 4500、 5000 mg/Kg体重。于其它具 体例中，设想可使用较高剂量，该剂量可为约5 mg化合物/Kg体重至 约20mg化合物/Kg体重的范围。于其它具体例中，剂量可为约8、 10、 12、 14、 16或18 mg/Kg体重。其中雷帕霉素可使用每天1 mg、 2 mg、 3 mg、 5 mg、 7 mg、 10 mg、 15 mg、 20 mg或25 mg的齐lj量。当然， 此剂量可向上或向下调整，作为该处理程序中的经常性操作，根据起 始临床研究的结果与特定患者的需求。筛选分析
如本文所讨论者，错误折叠蛋白质经常干扰细胞的正常生物功能且 引起PCD。于许多情况中，错误折叠蛋白质的累积为蛋白质凝集物引起 细胞损伤与细胞毒性。使用增强该等蛋白质降解的化合物，因而缓和 细胞毒性。有多数种方法可供选择进行鉴定该等化合物的筛选分析。 于一方向中，无法适于野生型构像的突变蛋白质于细胞中表达(例如细 胞活体外或活体内)；使细胞与候选化合物接触；以及化合物对于自体 吞噬的效果使用本文所叙述的此项技术领域中已知的任何方法分析。 增强自体吞噬的化合物使用任何标准方法(例如免疫分析)经由测量错 误折叠蛋白质浓度的降低、经由测量细胞毒性的降低、经由测量自体 吞噬液泡存在的增加、或经由测量自体吞噬标记(例如磷酸化的mTOR 或S6激酶)浓度的增加。相对于位接触化合物的对照细胞，降低接触 细胞中错误折叠蛋白质的存在量的化合物，考虑为有用于本发明的方 法。分析错误折叠蛋白质量的降低，例如经由测量细胞内蛋白质凝集 物的降低、经由测量细胞毒性的降低或经由测量蛋白质浓度的降低。 较佳地，错误折叠蛋白质为选择性的降解。于相关方向中，于雷帕霉 素、FT工-277、 l卜顺式视黄醇、9-顺式视黄醇或其类似物或其衍生物 的存在下筛选。有用的化合物降低错误折叠蛋白质的量为至少10%、15% 或20%,或较佳地为25%、 50%或75%;或更较佳地为至少100%、 200%、 300%或甚至400%。
需要时，经鉴定化合物的疗效于具有PCD(例如视网膜色素变性、 囊胞性纤维症、亨延顿氏舞蹈症、帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、肾 性尿崩症、癌症(例如相关于p53突变的癌症)以及病原素相关的疾患 (例如库贾氏症))动物模式中分析。
雷帕霉素活性增强剂的筛选
本发明系直接关于用于PCD治疗的增强自体吞噬的方法。增强雷帕 霉素或FTI-277生物活性的化合物期望增强错误折叠蛋白质的降解。 因此，化合物经鉴定作为增强雷帕霉素或FTI-277的生物效果，有用 于本发明的方法。于一具体例中，增强雷帕霉素生物活性的小分子使用小分子标靶鉴定策略于酵母细胞中鉴定。雷帕霉素抑制野生型酵母 细胞的生长。增强酵母细胞生长的抑制效果的化合物可使用经常性方 法鉴定，例如化学基因修改筛选。该筛选已知于此项技术领域且叙述
于例如雷帕霉素Huang等人，PNAS 101: 16594-16599， 2004。雷帕霉
素治疗诱发营养匮乏回应状态唤起，经常导致生长抑制的结果。使用 化学基因修改筛选雷帕霉素的小分子增强剂(SMERs)，于酵母细胞 (& cc力ar，yces cerew'w'ae)中增强(例如增加至少5%、 10%、 25%、 50%、 75%、 85%、 90%或95%)雷帕霉素的效果。以生物素化SMERs探试 蛋白质体芯片将鉴定修改雷帕霉素的细胞效果的公认的细胞内标耙蛋 白质。于一具体例中，雷帕霉素于候选化合物的在或不存在下添加至
酵母细胞的培培养基。酵母细胞继续培养以及侦测酵母细胞的增生(例
如使用光学密度)。与雷帕霉素组合而降低酵母细胞增生的化合物鉴定
为SMER。该等化合物单独或与雷帕霉素组合似乎有用于增强自体吞噬。
需要时，SMER对于自体吞噬的效果使用本文所述的任何方法(例如自体
吞噬标记的增加、自体吞噬液泡的增加、错误折叠蛋白质降解的增强)
或以致于此项技术领域者进行分析。
测试化合物与萃取物
一般而言，于细胞中能降低错误折叠蛋白质的量或增加该等蛋白质 的选择性降解的化合物，根据此项技术领域已知的方法，由天然产物 或合成(或半合成)萃取物的大数据库或化学数据库鉴定。熟悉药物发 现与开发的领域者应了解测试萃取物或化合物的精确来源，对于本发 明的筛选步骤并不重要。因此，设想为数众多的化学萃取物或化合物 可使用本文所述的方法进行筛选。该等萃取物或化合物的范例包括但 不限于植物为主的、真菌为主的、原核生物为主的或动物为主的萃取 物，酸酵液与合成化合物，以及现存化合物的修改者。亦可使用数种 方法产生任意数目的化学化合物的随机或直接的合成(例如半合成或 全合成)，包括但不限于糖类为主的、脂质为主的、肽为主的与核酸为 主的化合物。合成的化合物数据库为商业上可取得自Brandon Associates (Merrimack, N. H.)与 Aldrich Chemical (Milwaukee, Wis.)。或者，为细菌、真菌、植物与动物萃取物型式的天然化合物的 数据库可由商业上数种来源取得，包括Biotics (Sussex, UK) 、 Xenova(Slough, UK) 、 Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, FIa.)与Pha皿Mar， U.S.A. (Cambridge, Mass.)。此夕卜，天然与合 成的产物数据库需要时可根据此项技术领域已知的方法(例如标准萃 取与划分的方法)产生。再者，需要时，任何数据库或化合物容易地使 用标准化学的、物理的或生化的方法加以修改。
此外，熟悉药物发现与开发的领域者容易了解已知于正确折叠蛋白 质中己知对其活性用于去冗余(der印lication)(例如命名学去冗余、 生物去冗余与化学去冗余、或其任何组合)的方法或复制物的去除或材 料的重复应尽可能的施用。
当发现粗萃取物修正错误折叠蛋白质的构像且进一步划分正向先 导性萃取物为必要以单离话反应于所观察得效果的化学组成。因此， 萃取、划分与纯化步骤的目标为于增加正确折叠蛋白质产生的粗萃取 物中仔细地特征与鉴定化学体。该异源萃取物的划分与纯化的方法已 知于此项技术领域。需要时，显示有用于相关于错误折叠蛋白质或蛋 白质凝集物的任何病理的治疗用试剂可根据此项技术领域中已知方法 进行化学性修改。 合并疗法
有用于治疗PCD(例如视网膜色素变性、亨延顿氏舞蹈症、帕金森 氏病、阿耳茨海默氏病、肾性尿崩症、癌症及库贾氏症)的本发明组合 物，需要时，可与已知于此项技术领域的任何标准疗法合并。对于视 网膜色素变性，标准疗法为维生素A补充剂。于帕金森氏病的情况中， 标准疗法包括给药下述多巴氨受体激动剂/左旋多巴的任何一者或多 者金刚氨、甲磺酸溴隐亭、培高利特、阿朴吗啡、苄丝肼、麦角乙 脲、美舒麦角、麦角乙脲、麦角腈、美金氨、麦角苄酯、吡贝地尔、 对羟基苯乙氨、酪氨酸、苯丙氨酸、马来酸甲磺酸溴隐亭、马来酸培 高利特；其它标准疗法包括抗组织氨、抗抑郁剂、多巴氨激动剂及单 氨氧化酶抑制剂。对于亨延顿氏舞蹈症，标准疗法包括给药下述的任 何一者或多者氟呱丁苯、吩噻嗪、利血平、丁苯那嗪、金刚氨及辅 酶QIO。对于阿耳茨海默氏病，标准疗法包括给药下述的任何一者或多 者多萘哌齐(Aric印t)、利凡斯的明(Exelon)、加兰他敏(Razadyne) 及他可林(Cognex)。对于肾性尿崩症，标准疗法包括给药下述的任何一者或多者氯噻嗪/盐酸氯噻嗪、阿米洛利及吲哚美辛。对于囊胞性 纤维症，标准疗法包括给药下述黏膜薄化药物(例如阿法链道酶 (dornase alfa)的任何一者或多者支气管扩张剂(例如沙丁氨醇)与 治疗感染的抗生素。对于癌症，标准疗法包括给药下述的任何一者或 多者醋酸阿比特龙、六甲蜜氨、脱水长春碱、奥瑞斯坦丁、贝沙罗 汀、必卡他氨、BMS184476、 2， 3， 4， 5， 6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基) 苯磺酰氨、博来霉素、N， N-二甲基-L-缬氨酰基-L-缬氨酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-N-脯酰氨基-l-L-脯氨酸-第三丁基酰氨、恶病质素、西马多 丁、苯丁酸氮芥、环磷酰氨、3， ，4， _二脱氢-4， _脱氧-8， - norvin-长春花碱(cal.eukoblastine)、多西赛他、多西泰素、环磷酰氨、卡铂、 卡莫司汀(BCNU)、顺铂、念珠藻环肽、阿糖胞苷、达卡巴嗪(DTIC)、 更生霉素、柔红霉素、海兔毒素、多柔比星(阿霉素)、依托泊甙、5-氟尿嘧啶、非那留氨、氟他氨、羟基脲及羟基脲紫杉烷、异环磷酰氨、 利阿唑、氯尼达明、洛莫司汀(CCNU)、双氯乙基甲氨(氮芥)、美法仑、 羟乙基磺酸米布尔、利索新、司替尼、链脲霉素、丝裂霉素、甲氨蝶 呤、尼鲁米特、奥那司酮、太平洋紫杉醇、泼尼莫司汀、丙卡巴肼、 RPR109881、磷酸司特目斯汀、黛莫芬、太索内明、紫杉醇、维甲酸、 长春花碱、长春新碱、硫酸长春地辛及维氟明。 试剂盒
本发明提供适剂盒以治疗或预防PCD或其症候。于一具体例中，试 剂盒包括包含有效量的雷帕霉素或其类似物的医药包装物。于其它具 体例中，所述试剂盒包括雷帕霉素与11-顺式视黄醇或9-顺式视黄醇。 于另一具体例中，所述试剂盒包括有效量的法尼基转移酶抑制剂(例如 FTI-277)。较佳地，所述组合物微单位剂量型式。于一些具体例中， 试剂盒包括无菌容器，且该容器含有治疗或预防组合物；该容器可为 盒子、安瓶、瓶、小罐、管、袋、药包、撕碎包或已为此项技术所知 的其它适合容器型式。该等容器可由塑料、玻璃、层合纸、金属箔、 或适合载持医药品的其它材质。
如果需要时，本发明的组合物或其组合与对具有或处于发展PCD的 风险的个体给药的指示一起提供。 一般而癌，所述指示将包含有关用 于治疗或预防PCD的化合物的使用情报。于其它具体例中，所述指示包括至少下述一者化合物或化合物组合的叙述；用于治疗PCD或其 症候的剂量排程与给药；注意事项；警告；指示；窗口指示；过度剂 量情报；副作用；动物药动学；临床研究；及/或参考文献。所述指示 可直接印刷于容器(有容器时)，或作为标签应用于容器，或作为个别 纸张、小册、或夹页应用至或与容器。
下述实施例提供用于说明本发明，而非限制本发明。熟悉此项技术 领域者将了解下述所提供的具体结构物可使用多种方法变化，只要与 上述发明一致性者且保留化合物或其组合的重要性质。
实施例
视网膜色素变性(RP)为PCD包括导致感细胞光受体死亡的遗传性 视网膜异常的异源族群。光受体的死亡导致夜盲以及由于患有视网膜 色素变性患者的周边视力的损失进展所引起的后续的视力窄化。具有 常染色体显性遗传视网膜色素变性(ADPR)的患者的20致25%于视紫质 基因有突变，最常见的突变为P23H。 P23h突变导致无法与11-顺式视 黄醇结合的错误折叠蛋白质。错误折叠P23H蛋白质保留于细胞中而形 成凝集物(Saliba等人2002. JCS 115: 2907-2918; Illing等人2002. JBC 277: 34150-34160)。此凝集物行为分类某些RP突变，包括P23H， 为蛋白质构像紊乱症(PCD)。
编码囊胞性纤维穿膜导通调节子(CFTR)的基因缺陷引起囊胞性纤 维症，其位另一PCD。囊胞性纤维症最常见于高加索人种，美国约有
30， ooo囊胞性纤维症患者。形成cr通道的CFTR于许多器官中为上皮cr 运送系统的重要组成，包括肠、胰脏、肺、汗腺与肾脏。于cr分泌肠 上皮细胞中，"—经由位于基侧膜的讨^-}(+-2cr共运子进入细胞且经由
CFTR存在于顶端膜；接着渗透水分。编码CFTR基因的缺陷减低其Cl—运
送能力或其细胞表面表达浓度而引起囊胞性纤维症。此氯运送的缺陷 导致受损的空气通道分泌物的清洁以及容易受到细菌感染。虽然囊胞 性纤维症为多系统疾病，呼吸衰竭为死亡的主要原因。 虽然下述实施例直接使用特定的突变蛋白质以鉴定化合物增强突
变性视蛋白或CFTR蛋白质的降解，但本发明不为此所限。化合物经鉴 定为有用于选择性增强细胞中错误折叠视蛋白或错误折叠CFTR的降解(例如自体吞噬降解)，分别有用于视网膜色素变性或囊胞性纤维症的 治疗。该等化合物似乎增强任何错误折叠蛋白质的降解，且一般有用 于实际上任何蛋白质构像疾病的治疗。使用于进行下述试验的方法叙
述于 Noorwez 等人 ，Journal of Biological Chemistry 279:16278-16284 (2004)，其全部内容并入本为作为参考文献。 实施例l:自体吞噬诱发导致错误折叠蛋白质的降解
使用HEK293四环霉素诱发的稳定细胞株表达P23H或野生型视蛋 白，巨自体吞噬由氨基酸耗竭或由雷帕霉素暴露所诱发。第IA图显示 自体吞噬由氨基酸耗竭单独(4至6行)或由雷帕霉素(7至9行)或由氮 基酸耗竭与雷帕霉素暴露的组合(10至12行)诱发时，野生型视蛋白的 免疫墨点降解图。第IB图于试验的时间历程中比较野生型视蛋白的相 对量且显示于自体吞噬诱发的24小时历程中，野生型视蛋白的浓度主 要未改变。相对地，细胞中当自体吞噬经由任何该等方法诱发时，P23H 视蛋白的量快速地降低(第1C图)。P23H视蛋白的降解图(第1D图)显 示当自体吞噬由氨基酸耗竭所诱发时，33%的错误折叠视蛋白于2小时 内降解(第1D图，方±央)。当自体吞噬由雷帕霉素所诱发时，46%的蛋 白质于治疗的6小时内降解(第1D图，三角形)。当氨基酸耗竭与雷帕 霉素治疗合并时，降解进一步增强(第1D图，圆形)，其中几乎52%的 错误折叠视蛋白于2小时内降解且81%于12小时后降解。
实施例2:自体吞噬特定地降解错误折叠蛋白质
为了测定此效果由蛋白酶体抑制剂调控或仅由自体吞噬调节，检测 细胞中P23H降解，其中自体吞噬于蛋白酶体抑制剂或自体吞噬抑制剂 的存在下诱发。3-甲基腺苷(自体吞噬抑制剂)与MG132(蛋白酶体抑制 剂)于自体吞噬诱发时间添加至细胞培养基。第1F图显示3-MA于氨基 酸耗竭的细胞中抑制P23H降解。第1G图显示蛋白酶体抑制剂(MG132) 对P23H视蛋白降解无效果(第1D图)。该等研究显示自体吞噬特异地 降解错误折叠的P23H视蛋白。
实施例3:雷帕霉素增强错误折叠蛋白质的自体吞噬先前研究显示11-顺式视黄醇作用为药动学伴随子有助于P23H视蛋 白^的折叠与稳定性。给药U-顺式视黄醇使多数的P23H蛋白质汇集至
细胞表面^，于该处其与11-顺式视黄醇结合形成视紫质。当11-顺式
视黄醇于自体吞噬诱发时给药，P23H降解的程度未受改变(第1E图4 至6行)。然而，由于11-顺式视黄醇增加正确折叠蛋白质的浓度且雷 帕霉素增强任何残余错误折叠蛋白质的降解，似乎合并给药11-顺式视 黄醇与雷帕霉素用于眼部PCD的治疗具有增强的临床疗效。
于培养基补充有或无氨基酸的视紫质浓度类似(第1E图1至3行， 4至6行)。于氨基酸耗竭中使用11-顺式视黄醇治疗的细胞中P23H蛋 白质的降解图与表达野生型视蛋白的细胞或未接受11-顺式视黄醇的 P23H视蛋白过度表达的细胞的降解图比较。于11-顺式视黄醇存在时， 相较于表达野生型视蛋白的细胞或无11-顺式视黄醇存在的P23H视蛋 白过度表达的细胞P23H蛋白质降解显示中度降解图。
有趣地，单独使用雷帕霉素治疗诱发P23H视紫质的快速降解，无 论其是否单独给药或与氨基酸匮乏的细胞合并(第1F图，7至9行，10 至12行)。于11-顺式视黄醇存在时的P23H降解图类似培养于正常条 件(第1F图，钻石形)或培养于氨基酸耗竭培养基(第1F图，'方形)的 细胞。当无ll-顺式视黄醇存在的雷帕霉素给药观察到增强的降解(第 1F图，三角形)。接近32。/。的P23H蛋白质于12小时内降解。当雷帕霉 素对氨基酸肌饿细胞给药时，未观察到进一步的视紫质降解的增加。 事实上，雷帕霉素对氨基酸耗竭细胞的给药类似于单独雷帕霉素处理 的效果。几乎3W的P23H蛋白质于2小时内降解(第1F图，圆形)。因 此，由雷帕霉素所诱发的自体吞噬，于11-顺式视黄醇存在时选择性地 增加P23H蛋白质降解。
实施例4:自体吞噬诱发所引发于mTOR磷酸化的特征性变化
mTOR为哺乳动物雷帕霉素标靶，且mTOR浓度于自体吞噬细胞中特 征性为降低。为了确认使用上述方法所诱发的自体吞噬，于氨基酸耗 竭细胞与接受雷帕霉素的细胞中特征化为mTOR磷酸化。如预期的，于 氨基酸耗竭细胞与接受雷帕霉素的细胞中，自体吞噬诱发后观察到磷 酸化mTOR的量降低。自体吞噬诱发特征化于表达野生型或P23H视蛋白的细胞，以及亦给药11-顺式视黄醇的细胞。由于于自体吞噬状况下， Bip与钙联蛋白(藉由未折叠蛋白质回应(UPR)而向上调控的伴随子)与
Hsp70(藉由热休克回应(HSR)而向上调控的伴随子)未变化，故此磷酸 化的增加为对mTor有特异性。于藉由氨基酸匮乏或雷帕霉素处理所诱 发的自体吞噬后，三个伴随子的量历时保持恒定(第1H图、第II图)。
为了测定自体吞噬是否提供错误折叠蛋白质降解的一般机制，将突 变性囊胞性纤维穿膜导通调节子(CFTR)蛋白质进行特征化。CFTR为 cAMP-活化的氯离子通道表达于上皮细胞的顶部膜。如同P23H， CFTR 为多源膜蛋白。该等多源蛋白质具有许多a螺旋穿膜段。于CFTR的突 变影响其功能所需的制造、处理与运送至细胞质膜的能力。
野生型CFTR (第2图)与突变型CFTR A F508 (第2C图)蛋白质表达于 BHK稳定细胞株。经由氨基酸耗竭、雷帕霉素处理或雷帕霉素处理与氨 基酸耗竭的组合于表达野生型CFTR或突变性CFTR蛋白质的细胞中诱 发自体吞噬(第2A图)。虽然自体吞噬诱发不影响野生型CFTR蛋白质 浓度(第2B图)，回应于氨基酸耗竭、雷帕霉素处理或雷帕霉素处理与 氨基酸耗竭的组合(第2C图)的自体吞噬，AF508蛋白质(第2D图)， 进行快速降解。降解图显示氨基酸匮乏于12小时内降解约34%的^ F508蛋白质(第2D图，三角形)，而雷帕霉素处理于12小时候引起50% 的蛋白质降解(第2D图，方形)。当氨基酸匮乏与雷帕霉素处理组合时， 降解更大。几乎75%的突变性蛋白质于处理的6小时内降解以及80%于 处理12小时后降解(第2D图，圆形)。该等观察显示自体吞噬选择性 地降解错误折叠AF508蛋白质。于表达野生型或突变型CFTR蛋白质的 细胞诱发自体吞噬后，mTOR磷酸化降低。观察到伴随子(Bip、钙联蛋 白与hsp70)的浓度无差异。第2E图与第2F图为显示于雷帕霉素的在 或不存在下，培养于正常培养基或培养于氨基酸耗竭培养基的细胞中， mTor磷酸化(第2E图)与钙联蛋白、钙网蛋白、Hsp70或Bip蛋白质表 达的免疫墨点分析图。
实施例5:自体吞噬标记于自体吞噬诱发后与错误折叠蛋白质的共定 位自体吞噬诱发可使用电子显微镜鉴定细胞中自体吞噬液泡(AVs)的
存在而侦测。P23H细胞于正常培养基中含有一些AVs，但当细胞培养 于氨基酸耗竭培养基时，该液泡数目显著增加(第5图)。
为了测定错误折叠蛋白质是否与自体吞噬标记共定位，表达野生型 (第3A图)或突变性P23H视蛋白(第3B图)的细胞进行Atg7、 LC3与 Lampl自体吞噬标记染色。细胞与试蛋白特异的与自体吞噬标记特异的 抗体培养后诱发自体吞噬。野生型视蛋白蛋白质存在于细胞膜，而P23H 形成细胞内凝集物。相同的自体吞噬标记于表达野生型(第4A图)或突 变性AF508 CFTR蛋白质(第4B图)的B服细胞中检测。于该等细胞中， AF508 CFTR蛋白质未形成可目视的凝集物。野生型CFTR蛋白质于细 胞膜以及细胞内观察到(第4A图)，而△ F508仍保留于ER (第4B图)。 第5A至5C图为显示P23H凝集物、溶酶体与自体吞噬细胞的电子显微 镜图。
使用Atg7免疫荧光染色显示与两突变性蛋白质共定位的点状染 色。Atg7与P23H的共定位显示于第3B图以及与AF508的共定位显示 于第4B图。Atg8亦与两突变性蛋白质共定位染色。Atg8显示与P23H 的错误折叠蛋白质凝集物共定位的点状染色(第3B图)。Atg8染色亦与 保留于ER的AF508蛋白质共定位(第4B图)。该等观察进一步支持自 体吞噬对于突变性多源蛋白质(例如P32H与AF508)的降解的重要性。
总结，自体吞噬途径特异地降解错误折叠的多源蛋白质，例如P23H 与AF508而对野生型蛋白质具有非常小的影响。由于野生型与突变性 视蛋白蛋白质表达于人类胚胎肾细胞株而野生型与突变性CFTR蛋白质 表达于婴儿仓鼠肾细胞株，此结果不依赖于使用于表达突变性蛋白质 的细胞株。
自体吞噬可使用电子显微镜目视。于表达P23H视蛋白的细胞中观 察到双重膜自体吞噬液泡的数目增加。自体诱发后，该等细包含有P23H 视蛋白的大的凝集物或小的未集结的凝集物。亦观察到深的酸性磷酸 酶染色的溶酶体相关于AV's与凝集物。不欲受制于一实际理论，此可 能显示溶酶体途径于错误折叠视蛋白的降解的重要角色。
自体吞噬标记与错误折叠P23H视蛋白及AF508蛋白质共定位。 Atg7为编码形成AVs所需要的组装El泛素-活化酵素蛋白质的关键自体吞噬基因。Atg7促进Atg8(为与微管蛋白相关的蛋白质轻链3)对形 成AVs的隐蔽膜的脂质的结合。Atg8存在于自体吞噬体的早期与后期 两者的膜。Atg7及Atg8与P23H及A F508蛋白质的不同的点状染色建 议AVs对于错误折叠蛋白质降解的角色。
实施例6:雷帕霉素处理于视网膜色素变性增强视黄醇功能
表达具有P23H突变的突变性老鼠视蛋白的基因转殖小鼠，进行类 似于视网膜色素变性患者观察到的病生理变化的快速进展的光受体退 化。与P23H异源突变性小鼠的活体内研究显示雷帕霉素处理于3个月 时程救赎视黄醇功能(第6图)。
实施例7:雷帕霉素于黄斑变性增强视黄醇功能
累积于视黄醇色素上皮(RPE)细胞的双-类视黄醇荧光团作为褐脂 质组成，被认为对严重的斯塔尔加特病的RPE细胞损失有责任，斯塔 尔加特病为黄斑变性的早发型，且亦可参予年龄相关的黄斑变性的病 原学。于黄斑变性老鼠模式的活体内研究显示于具有与斯塔尔加特病 相关的ABCR基因的一缺陷版本的Abcr异源突变性小鼠中，雷帕霉素 处理救赎视黄醇功能。ABCR基因编码rim蛋白质(RmP)，为表达于光受 体外节视盘边缘的ATP-结合-卡匣转运子。
实施例8: FTI277诱发P23H视紫质的快速降解
如同雷帕霉素所致结果，使用法尼基蛋白质转移酶抑制剂，FTI277， 甲基{N- [2-苯基-4-N [2 (R) -氨基-3-巯基丙基氨基]苄酰基]}-蛋氨酸 (Calbiochem)，诱发P23H视紫质的快速降解(第8图)。如同雷帕霉素 所致结果，FTI277增强自体吞噬，以及FTI277有用于蛋白质构像疾 病的处理。
实施例9: FTI-277刺激P23H视蛋白的降解
为了研究FTI-277对突变性视蛋白浓度的效果，表达P23H视蛋白 的HEK293细胞使用不同浓度(1、 5、 10与50 u M)的FTI-277培养。于 50uM观察到P23H视蛋白的时间依赖性降解。于10M侦测到FTI-277无效果(第9A图)。当相较于雷帕霉素时，7(^的P23H视蛋白于雷帕霉 素处理后12小时消失，而FT工-277于该时间历程中导致50%的P23H 视蛋白损失(第9B图)。
实施例10: FTI-277不诱发UPR/HSR
使用FTI-277处理后，分析参予未折叠蛋白质响应(UPR)的内质网 伴随子(钙联蛋白与钙网蛋白)，或与热休克响应(HSR)相关的细胞质伴 随子(Hsp70与Hsp90)的浓度差异。FTI-277位影响该二响应，建议 FTI-277诱发P23H视蛋白的降解排除UPR与HSR两者(第10图)。
实施例11: FTI-277处理阻隔mT0R/S6K信号
如预测的，如果此药物抑制Rheb活性，FTI-277有效地抑制mTor 与S6激酶的磷酸化(第11A与11B图)。磷酸化的mTor与S6激酶可见 于氨基酸与血清馈入的细胞。如同使用雷帕霉素处理，FTI-277诱发 mTOR的磷酸化，其与氨基酸与血清匮乏合并时进一步增强(第11A图)。 类似地，S6激酶的磷酸化于使用FTI-277或雷帕霉素处理的细胞中剧 烈的减低(第11B图)。相对地，于HEK293细胞中Akt磷酸化的刺激不 受FTI-277处理的影响，建议Ras活性未受影响，然而于MAPK磷酸化 观察到些许增加，类似于Basso等人，J. Biol. Chem. 280， 31101-31108, 2005 (第11C图)。
实施例12:于FTI-277处理中使用Atg7与Atg8的P23H视蛋白的共定 位
雷帕霉素诱发的P23H视蛋白降解藉由自体吞噬调控，FTI-277降 解处理也经由自体吞噬。P23H视蛋白凝集物与己知自体吞噬体标记， Atg7与Atg8的关系，藉由免疫荧光显微镜分析。该等标记于生长于完 整培养基的未处理细胞中正常地不与P23H定位(第12A与第12B图)。 于FTI-277处理中观察到该二标记与P23H的共定位显著增加(第12A 与第12B图)。Atg7与Atg8回应于P23H视蛋白凝集物的定位较佳藉由 共轭焦显微镜观察(第12C图)。Atg7的点显示与P23H视蛋白凝集物簇 集，与P23H视蛋白共定位。同样地，某些Atg8的点与P23H视蛋白凝集物有增强的共定位，然 而，其余的点仍位于凝集物周围。Atg7与Atg8蛋白质存在于凝集物内 与周围，支持其于P23H视蛋白降解的自体吞噬角色。
实施例13:由FTI-277的自体吞噬诱发
该等结果显示FTI-277活化自体吞噬。因此，使用溶酶体探针 (lysotracker)观察细胞中溶酶体液泡的数目与尺寸分析对FTI-277的 自体吞噬回应。当细胞使用雷帕霉素或FTI-277处理细胞时，观察到 溶酶体的数目与尺寸的增加(第13A图)。其次，使用电子显微镜估算 于未处理与FTI-277处理的表达P23H视蛋白的HEK293细胞的自体吞 噬回应。如藉由溶酶体探针所见，FTI-277处理的细胞含有许多大的含 有溶酶体酸性磷酸酶的自体吞噬液泡(第13B图)。再者， 一些液泡呈 现处于鲸吞大的细胞质凝集物的步骤(第13B图)。于形态定性中，相 较于未处理的细胞，发现AVs于FTI-277处理的细胞中的划分容积增 加4至6倍(第13C图)。该数据建议FTI-277于服K293细胞促进自体 吞噬回应。
也研究FTI-277于稳定地表达自体吞噬标记(GFP-LC3)的HuH7肝细 胞的效果。于馈入细胞中，GFP-LC3优先地发现扩散于细胞质。当该等 细胞使用FTI-277处理时，GFP-LC3定位于与自体吞噬液泡一致性的数 个结构物以及发生自体吞噬(第14图)。该等研究显示于使用FTI-277 处理的细胞中，自体吞噬剧烈地向上调控。
P23H视蛋白表达HEK293细胞中自体吞噬的诱发，使用阻隔自体吞 噬的P3-激酶抑制剂(3-甲基腺苷；3-MA)检测。于FTI-277存在下，3-MA 处理预防视蛋白的降解，此效果未见于单独使用FTI-277处理的细胞 (第15A图)。为了进一步确认P23H视蛋白为自体吞噬的，使用蛋白酶 体抑制剂(MG132)。于FTI-277与MG132与单独FTI-277的存在下，P23H 视蛋白降解具有类似的动力学，建议蛋白酶体降解于此途径的角色受 到限制(第15B图)。
法尼基转移酶抑制剂(FTIs)原始设计为阻隔Ras致癌蛋白质的作 用。Ras活性取决于法尼基化，为连结法尼基类异戊二烯膜锚定至蛋白 质的后转译修饰。法尼基转移酶催化15-碳异戊二烯脂质由法尼基二磷酸盐至多种蛋白质受质的半胱氨酸残基的转移。法尼基转移酶辨识受 质羧基端的CAAX盒。
Rheb为鸟苷酸结合蛋白质与GTPase。 Rheb蛋白质含有Gl-G5盒， 其为参予GTP的辨识与水解的序列的短链(Bourne等人，(1990) Nature 348， 125-132)。再者，Rheb蛋白质结束于法尼基化所需要的 CAAX(CSVM)部位。于哺乳动物细胞中，已建立Rheb活化S6K的能力。 由于Rheb突变缺乏CAAX部位不能或化S6K，此功能依赖于法尼基化 (Castro等人，J. Biol. Chem. 278， 32493—32496， 2003; Tee等人， Curr. Biol. 13， 1259-1268， 2003)。再者，己建立FTIs，如同FTI-277， 完全地阻隔Rheb的烯化作用(prenylation) (Basso等人，J. Biol. Chem. 280， 31101-31108， 2005)。 Rheb不进行香叶酰香叶酰化 (geranylgeranylation)。除了 Rheb有其它FTIs的标耙。研究显示如 同K-Ras4B的蛋白质，由于当法尼基化受到抑制时期进行香叶酰香叶 酰化而显示对FTIs的阻抗性[(22， 23)。该等研究建议Rheb较其它进 行法尼基化的蛋白质为FTIs的更特异的标靶。此外，Akt磷酸化不受 FTI-277的影响，建议FTI-277不影响Ras活性，Rheb为胰岛素/T0R/S6K 信号途径的组成(Cast'ro等人，J. Biol. Chem. 278， 39921-39930， 2003; Tabancay等人，J. Biol. Chem. 278， 39921-39930， 2003; Tee 等人，Curr. Biol. 13， 1259-1268 24， 2003; Inoki等人,Genes Dev. 17， 1829-1834， 2003; Garami等人，Mol. Cell 11， 1457-1466， 2003)。 如本文所报导，观察到使用FTI-277的mT0R与S6K的去磷酸化，与Rheb 的抑制一致。当自体吞噬藉由雷帕霉素的使用于细胞中诱发时，观察 到mT0R与S6K的磷酸化的类似减低。除了抑制mTOR，该等结果显示藉 由FTI-277的处理可于细胞诱发自体吞噬，其阻隔Rheb进一步的mTOR 上游(第16图)。
使用50tiM的FTI-277处理P23H视蛋白表达细胞，如同雷帕霉素 处理，诱发突变性视蛋白的降解。使用对自吞噬体标记Atg7与Atg8 的抗体的免疫荧光研究确认于该等细胞诱发自体吞噬。Atg7为编码形 成AVs所需要的组装El泛素-活化酵素蛋白质的关键自体吞噬基因 (Tanida等人，(2001) J. Biol. Chem. 276， 1701-1706。 Atg7促进 Atg8(为与微管蛋白相关的蛋白质轻链3)对形成AVs的隐蔽膜的脂质的结合(Ohsunii等人，7feL 2， 211-216， 2001;
Kabeya等人，,5y. 117， 2805-2812， 2004)。两标记与P23H 视蛋白共定位。再者，超音波研究为使用电子显微镜解析当使用 FTI-277处理时细胞中AVs的增加表达。于某些微影像中，观察到AVs 鲸吞细胞质凝集物。再者，形态分析显示使用FTI-277处理的细胞中 AVs的划分容积增加6倍，因此确实建立该等细胞中自体吞噬的诱发。 总结，该等数据建议自体吞噬途径不仅可藉由使用雷帕霉素阻隔 mTOR而受到刺激，亦可藉由使用小分子法尼基转移酶抑制剂(例如 FTI-277)调控mT0R上游成分而受到刺激。如同其它FTIs， FTI-277降 低Rheb的法尼基化，因而去活化此G-蛋白。该等研究开启使用FTIs 治疗各种蛋白质构像紊乱(PCDs)的可能性，由于自体吞噬参予降解突 变性、凝集的蛋白质，其关联于多种神经退化疾病，包括帕金森氏病 (Cuervo等人，Science 305， 1292-1295， 2004)、亨延顿氏舞蹈症 (Ravikumar等人Nat. Genet. 36， 585- 595， 2004)。刺激于亨延顿 氏舞蹈症的自体吞噬(Ravikumar等人Nat. Genet. 36， 585- 595， 2004)，于细胞培养以及老鼠模式两者中，以及常染色体显性遗传视网 膜色素变性导致累积凝集物的损失。同时，FTIs用于癌症的临床试验 (第II期与第III期)的目前使用中，进一步确信于人类与测试动物中 此化合物的毒性消失。FTIs药物可提供雷帕霉素的替代疗法，特别是 增强由自体吞噬的蛋白质凝集物的移除。
上述试验使用下述方法及材料实施。 哺乳动物细胞培养
野生型与P23H视蛋白表达于HEK293四环霉素诱发的稳定细胞株。 于37。C、 5.0%0)2存在下，细胞生长于补充有10%加热去活化胎牛血清 (Sigma)、与抗生素-抗真菌素溶液(Invitrogen， San Diego， CA)、保 米霉素(Cayla， Toulouse, France) 、 zeocin醣蛋白抗生素(Invitrogen: San Diego, CA)的含有高葡萄糖的Dulbecco's modified Eagle's培养 基(Invitrogen， San Diego, CA)。细胞中视蛋白合成界由四环霉素(1 U g/ml)的添加而诱发。婴儿仓鼠肾(BHK)细胞株稳定地表达野生型与 具有C-端HA抗原决定基的A 508CFTR变异株(CFTR-HA)(参照Sharma eta[lambda].， J Cell Biol. 2004 164(6) :923— 33)。于37。C、 5. 00线 存在下，细胞生长于以1:1的比例具有10。/。FBS的DMEM/F12 (Invitrogen San Diego, CA)中。
HuH7肝细胞稳定地以pGFP-LC3转染(Ogawa等人， Science307(5710) : 727 - 731， 2005)使用脂质最适化试剂盒，the PerFect lipid (pFx_3)， 由Invitrogen (San Diego， Calif.)贝勾得。 PFX-3 (Invitrogen)根据制造商的步骤。于0. 5mg/ml的G418存在下 生长的族落经单离、扩增与藉由荧光显微镜与西方墨点法筛选GFP-LC3 表达。
自体吞噬的诱发
藉由将细胞培养于氨基酸耗竭培养基或使用雷帕霉素(50mM)处理 细胞，或两者而于细胞中诱发自体吞噬。细胞培养于自体吞噬诱发条 件下2、 6或12小时。于指定的时间点，于蛋白酶抑制剂(完全蛋白酶 抑制齐U混合物锭剂)(Roche Molecular Biochemicals， Mannheim, Germany)的存在下，于4。C将细胞溶解于1%正-十二烷基3 -麦芽糖苷 (DM) (Anatrace， Maumee， 0H)1小时。细胞于Beckman高速离心机以 36， OOOrpm于4匸离心30分钟。收集溶解物进行免疫墨点分析。
SDS凝胶电泳与免疫墨点分析
细胞溶解物于10%SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳且转移至 Immobilon-NC (Millipore， Billerica， MA)硝基纤维素膜。该膜于室 温与以1:1稀释于PBST(PBS具有0. 1% triton X-100， pH 7. 4)的市售 封阻缓冲液(Li-Cor， Lincoln, Nebraska)培养1小时，接着与指定的 一级抗体培养l小时。墨点各于PBST中清洗3次各5分钟，与真近红 外光染剂，IRDye800-结合的二级抗体(Rockland Immunochemicals Inc., Gilbertsville, PA)培养1小时。最后膜再以PBST清洗3次且 于Oddyssey红外光扫描仪(Li-Cor, Lincoln, Nebraska)扫描。免疫 墨点的订量使用Licor软件进行。 一级抗体包括抗视蛋白的抗体， HA-tag (Covance Princeton, NJ) 、 mT0R、磷酸化mTOR (Upstate Charlottesville, VA)、钙联蛋白、hsp70 (Stressgen， Victoria, BC，CA)、Bip (BD PharMingen, SanDiego， CA)抗微管蛋白(Sigma Chemical St. Louis， Missouri), 1D4 (University of British Columbia)、 Akt、 phospho-Akt、 S6K、 phospho-S6K、 MAPK与phosphor-MAPK (Cell Signaling Technology, Beverly, MA)。
免疫荧光法
细胞生长于载玻片且固定于4%三聚甲醛。接着以50m丽HXl猝息， 细胞以PBS清洗且与指示一级抗体于室温培养1小时。细胞以PBS清洗5 次且与二级抗体(TRITC-及FITC-结合)培养1小时。再次清洗细胞且以 含有DAPI的Vectashield安放。 一级抗体包括LC3、 LAMP-1、 Atg7(Dr Dunn)、视蛋白、Atg72°、 Atg8与HA-tag。细胞使用 Zeiss Axiophot显微镜观察。
使用溶酶追踪子(Molecular Probe)的染色亦于37"C于活细胞进 行。共轭焦影像使用Leica TCS SP2 A0BS Spectral Confocal Microscope放大倍数63X 。
老鼠模式
abcr +/-小鼠由Mata等人描述于Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2001;42:1685-1690。
表达P23H视蛋白的小鼠由Liu等人描述于Journal of Cell Science 110， 2589-2597 (1997)。
活体内雷帕霉素处理
sk^/-小鼠由四个月大开始使用每周20mg/kg的雷帕霉素处理。 雷帕霉素由腹腔内注射给药。
异合子P23H基因转殖鼠于由21日大开始每周使用雷帕霉素处理。
视网膜电图(Electroretinography)
于ERG前老鼠于黑暗中适应24小时。使用K他命(ketamine)与二 甲苄噻嗪(xylazine)的混合物昏迷老鼠。藉由体重决定剂量。将老鼠眼睛使用普鲁柏卡因(proparacaine)液滴与老鼠眼睛麻木且使用 AK-dilate膨胀。接着将老鼠置于机器(UTAS-E 2000)，于期厚之插入 接地电极，另一电极插入颈中，使用一对电极由各眼纪录ERG。得到基 线读值后，于20、 10及0dB测量ERG。测量每个月的ERG且测定B-波 幅度。
FTI-277处理
于50yM使用FTI-277 (Calbiochem)。在洗除四环霉素后，细胞 处理0、 2、 6与12小时后，于含有1%正十二垸基_ 0-麦芽糖苷(DM) (Anatrace)于蛋白酶抑制剂(完全蛋白酶抑制剂混合物锭；Roche Molecular Biochemicals)的存在下于4""C溶解1小时。作为自体吞噬 的阳性对照，细胞使用雷帕霉素(50nM)处理，接着洗除四环霉素。溶 解物于Beckman车高速离心机以36， OOOrpm于4。C离新10分钟。收即 上清液以及进行免疫墨点分析。亦使用阻隔自体吞噬的3-甲基腺苷 (3-MA) (lOmM) (Sigma Chemical (St. Louis, Missouri))以及MG132 (25[mu]M) (Sigma Chemical (St. Louis， Missouri))。
电子显微镜
P23H视蛋白表达细胞生长于ACLAT片于24_孔盘。视蛋白产生为界 由四环霉素添加诱发48小时且在四环霉素移除后使用FTI-277处理细 胞6小时。接着使用PBS清洗，使用2%三聚甲醛、2%戊二醛于0. 1M 二甲砷酸钠缓冲液，pH7.4于4。C固定v30分钟，以及如前所述(31) 进行CMPase细胞化学处理。AVs的形态定性使用Image J软件T-test 分析以每秒20电子微影像的条件完成且P-值(双尾显着)于0. 05以下 或等于0. 05认为显着(标记为星号)。
其它具体例
由上文叙述，应可了解变化与修改可将本文所述的内容调整以适合 各种用途与状况。某些具体例亦包含于前文所述权利要求的范畴中。本文的各种定义的组件所列举的引述，包括列举组件的任何单独组 件或组合(或次组合)所变化的定义。本文具体例的引述包括任何单一 具体例或具体例与其它具体例或其一部分的组合的具体例。
本说明书述及所有专利与文献，即使各独立的专利与文献为具体地 与独立地的指明，其全部内容皆并入于本文作为参考文献
参考文献
1. S. M. Noorwez 等人，Journal of Biological Chemistry 279: 16278—16284 (2004)
权利要求
1.一种用于个体预防或治疗蛋白质构象紊乱症(PCD)的方法，所述的方法包括对所述的个体给药有效量的增强自体吞噬蛋白质降解的化合物。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述化合物抑制哺乳动物雷帕霉素耙 蛋白(mTOR)或抑制脑中富集的Ras同源体(Rheb)。
3. 根据权利要求2的方法，其中所述化合物为雷帕霉素或其类似物。
4. 根据权利要求2的方法，其中所述化合物为法尼基转移酶抑制剂。
5. 根据权利要求4的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂为FTI-277。
6. 根据权利要求l的方法，其中所述PCD选自下述所成组群cil-抗 胰蛋白酶缺乏症、囊胞性纤维症、亨延顿氏舞蹈症、帕金森氏病、 阿耳茨海默氏病、肾性尿崩症、癌症及库贾氏症。
7. 根据权利要求l的方法，其中所述PCD为囊胞性纤维症。
8. 根据权利要求l的方法，其中所述PCD为眼睛的PCD且选自下述所 成组群视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、青光眼、角膜营 养不良、视网膜劈裂症、斯塔尔加特病、常染色体显性遗传脉络膜 小疣及贝斯特氏黄斑营养不良。
9. 根据权利要求8的方法，其中所述PCD为视网膜色素变性或年龄相 关性黄斑变性。
10. 根据权利要求8的方法，其中所述年龄相关性黄斑变性为湿性型或 干性型。
11. 根据权利要求8的方法，其中所述的方法进一步包括对个体给药ll-顺式-视黄醇、9_顺式-视黄醇或11-顺式-视黄醇的7-环锁异构物。
12. —种用于个体预防或治疗眼的蛋白质构象紊乱症(PCD)的方法，所述的方法包括对所述的个体给药有效量的增强自体吞噬蛋白质降 解的化合物。
13. 根据权利要求12的方法，其中所述PCD为眼睛的PCD且选自下述所成组群视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、青光眼、角膜营养不良、视网膜劈裂症、斯塔尔加特病、常染色体显性遗传脉络 膜小疣及贝斯特氏黄斑营养不良。
14. 根据权利要求13的方法，其中所述PCD为视网膜色素变性或年龄 相关性黄斑变性。
15. 根据权利要求14的方法，其中所述年龄相关性黄斑变性为湿性型 或干性型。
16. 根据权利要求12的方法，其中所述化合物抑制哺乳动物雷帕霉素 靶蛋白(mTOR)或抑制脑中富集的Ras同源体(Rheb)。
17. 根据权利要求12的方法，其中所述化合物为雷帕霉素或其类似物。
18. 根据权利要求12的方法，其中所述化合物为法尼基转移酶抑制剂。
19. 根据权利要求12的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂为FTI-277。
20. 根据权利要求12的方法，其中所述的方法进一步包括对个体给药 l卜顺式-视黄醇、9-顺式-视黄醇或11-顺式-视黄醇的7-环锁异构
21. —种用于个体预防或治疗视网膜色素变性或黄斑变性的方法，所述 的方法包括a) 对所述的个体给药增强自体吞噬蛋白质降解的化合物；与b) 给药11-顺式-视黄醇或9-顺式-视黄醇，其中所述的ll-顺式-视黄醇或9-顺式-视黄醇与化合物对所述个体为同时或彼此于 14日内给药足量以治疗或预防视网膜色素变性或黄斑变性。
22. 根据权利要求21的方法，其中所述化合物抑制哺乳动物雷帕霉素 靶蛋白(mTOR)或抑制脑中富集的Ras同源体(Rheb)。
23. 根据权利要求22的方法，其中所述化合物为雷帕霉素或其类似物。
24. 根据权利要求22的方法，其中所述化合物为法尼基转移酶抑制剂。
25. 根据权利要求24的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂为FTI-277。
26. 根据权利要求21的方法，其中所述11-顺式-视黄醇为11-顺式-视 黄醇的7-环锁异构物。
27. 根据权利要求1至26的任一项的方法，其中所述个体包括影响蛋 白质折叠的突变。
28. 根据权利要求27的方法，其中所述突变在视蛋白中。
29. 根据权利28的方法，其中所述视蛋白包括P23H突变。
30. 根据权利要求1至26的任一项的方法，其中所述降解为选择性降 解错误折叠蛋白质。
31. 根据权利要求1至26的任一项的方法，其中所述11-顺式-视黄醇或9-顺式-视黄醇与化合物彼此于5日内给药。
32. 根据权利要求31的方法，其中所述ll-顺式-视黄醇或9-顺式-视 黄醇与化合物彼此于24小时内给药。
33. 根据权利要求32的方法，其中所述11-顺式-视黄醇或9-顺式-视 黄醇与化合物为同时给药。
34. 根据权利要求31至33的任一项的方法，其中所述11-顺式-视黄醇 或9-顺式-视黄醇与化合物为对眼睛给药。
35. 根据权利要求34的方法，其中所述给药为眼内给药。
36. 根据权利要求31至33的任一项的方法，其中所述11-顺式-视黄醇 或9_顺式-视黄醇与化合物为各自并入组合物以提供其长时间的释 放。
37. 根据权利要求36的方法，其中所述组合物为微球体、纳米球体或 纳米乳化物。
38. 根据权利要求36的方法，其中所述长时间的释放通过药物传递装 置。
39. 根据权利要求31至33的任一项的方法，其中所述的方法进一步包 括给药维生素A补充物。
40. —种用于个体预防或治疗蛋白质构象紊乱症(PCD)的方法，所述的 方法包括对所述的个体给药增强自体吞噬的化合物足量以治疗或 预防个体的PCD。
41. 根据权利要求40的方法，其中所述化合物抑制哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)或抑制脑中富集的Ras同源体(Rheb)。
42. 根据权利要求40的方法，其中所述化合物为雷帕霉素或其类似物。
43. 根据权利要求40的方法，其中所述化合物为法尼基转移酶抑制剂。
44. 根据权利要求40所述的方法，其中法尼基转移酶抑制剂为FTI-277。
45. 根据权利要求40的方法，其中所述PCD选自下述所成组群a 1-抗胰蛋白酶缺乏症、囊胞性纤维症、亨延顿氏舞蹈症、帕金森氏病、 阿耳茨海默氏病、肾性尿崩症、癌症及库贾氏症。
46. 根据权利要求40的方法，进一步包括鉴定患者为具有PCD的步骤。
47. 根据权利要求40的方法，进一步包括测量细胞中错误折叠蛋白质、 自体吞噬标记或自体吞噬液泡的浓度或表达。
48. 根据权利要求40的方法，其中所述PCD为囊胞性纤维症且所述的 方法进一步包括给药选自下述所成组群的药剂抗生素、维生素A、 D、 E及K补充物、沙丁氨醇支气管扩张剂、脱氧核糖核酸酶及依普 洛芬。
49. 根据权利要求40的方法，其中所述PCD为亨延顿氏舞蹈症且所述 的方法进一步包括给药选自下述所成组群的药剂氟呱丁苯、吩噻 嗪、利血平、丁苯那嗪、金刚氨及辅酶QIO。
50. 根据权利要求40的方法，其中所述PCD为帕金森氏病且所述的方 法进一步包括给药选自下述所成组群的药剂左旋多巴、金刚氮、 甲磺酸溴隐亭、培高利特、阿朴吗啡、苄丝肼、麦角乙脲、美舒麦 角、麦角乙脲、麦角腈、美金氨、麦角苄酯、吡贝地尔、对羟基苯 乙氨、酪氨酸、苯丙氨酸、马来酸甲磺酸溴隐亭、马来酸培高利特、抗组织氨、抗抑郁剂及单氨氧化酶抑制剂。
51. 根据权利要求40的方法，其中所述PCD为阿耳茨海默氏病且所述 的方法进一步包括给药选自下述所成组群的药剂多萘哌齐、利凡 斯的明、加兰他敏及他可林。
52. 根据权利要求40的方法，其中所述PCD为肾性尿崩症且所述的方法进一步包括给药选自下述所成组群的药剂氯噻嗪/盐酸氯噻嗪、阿米洛利及n引哚美辛。
53. 根据权利要求40的方法，其中所述PCD为癌症且所述的方法进一 歩包括给药选自下述所成组群的药剂醋酸阿比特龙、六甲蜜氨、 脱水长春碱、奥瑞斯坦丁、贝沙罗汀、必卡他氨、BMS184476、 2， 3， 4， 5, S-五氟-N- (3-氟-4-甲氧基苯基)苯磺酰氨、博来霉素、 N， N-二甲基-L-缬氨酰基-L-缬氨酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-N-脯酰 氨基-1-L-脯氨酸-第三丁基酰氨、恶病质素、西马多丁、苯丁酸氮 芥、环磷酰氨、3， ，4' -二脱氢-4， _脱氧-8， - norvin-长春花碱 (caleukoblastine)、多西赛他、多西泰素、环磷酰氨、卡铂、卡 莫司汀(BCNU)、顺铂、念珠藻环肽、阿糖胞苷、达卡巴嗪(DTIC)、 更生霉素、柔红霉素、海兔毒素、多柔比星(阿霉素)、依托泊甙、 5-氟尿嘧啶、非那留氨、氟他氨、羟基脲及羟基脲紫杉垸、异环磷 酰氨、利阿唑、氯尼达明、洛莫司汀(CCMJ)、双氯乙基甲氨(氮芥)、 美法仑、羟乙基磺酸米布尔、利索新、司替尼、链脲霉素、丝裂霉 素、甲氨蝶呤、尼鲁米特、奥那司酮、太平洋紫杉醇、泼尼莫司汀、 丙卡巴肼、RPR109881、磷酸司特目斯汀、黛莫芬、太索内明、紫 杉醇、维甲酸、长春花碱、长春新碱、硫酸长春地辛及维氟明。
54. —种增强细胞中错误折叠蛋白质的降解的方法，包括使所述的细胞 接触有效量的增强自体吞噬的蛋白质。
55. 根据权利要求54的方法，其中所述化合物抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)或抑制脑中富集的Ras同源体(Rheb)。
56. 根据权利要求54的方法，其中所述化合物为雷帕霉素或其类似物。
57. 根据权利要求54的方法，其中所述化合物为法尼基转移酶抑制剂。
58. 根据权利要求57的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂为FTI-277。
59. 根据权利要求57的方法，进一步包括鉴定患者为具有PCD的步骤。
60. 根据权利要求54的方法，进一步包括测量细胞中错误折叠蛋白质、 自体吞噬标记或自体吞噬液泡的浓度或表达。
61. 根据权利要求54的方法，其中所述细胞为眼部细胞。
62. 根据权利要求61的方法，其中所述的方法进一步包括使所述的眼 部细胞接触11-顺式-视黄醇、9-顺式-视黄醇或11-顺式-视黄醇的 7-环锁异构物。
63. 根据权利要求54的方法，其中所述细胞为上皮细胞。
64. 根据权利要求54的方法，其中所述细胞包括形成凝集物或纤维的 突变蛋白质。
65. 根据权利要求54的方法，其中所述细胞包括突变视蛋白。
66. 根据权利要求54的方法，其中所述细胞包括突变性myocilin蛋白。
67. 根据权利要求54的方法，其中所述细胞包括突变脂褐质蛋白。
68. 根据权利要求54的方法，其中所述细胞包括突变e-H3蛋白。
69. 根据权利要求54所述的方法，其中所述细胞为于活体外。
70. 根据权利要求54的方法，其中所述细胞为于活体内。
71. 根据权利要求54的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
72. 根据权利要求54的方法，其中所述细胞为人类细胞。
73. —种用于治疗PCD的医药组合物，包括于医药可接受的赋型剂中的 mTOR抑制剂或其类似物。
74. —种用于治疗眼部PCD的医药组合物，包括于医药可接受的赋型剂 中的有效量的增强自体吞噬的化合物。
75. 根据权利要求73或74的组合物，其中所述组合物抑制哺乳动物雷 帕霉素靶蛋白(mTOR)或抑制脑中富集的Ras同源体(Rheb)。
76. 根据权利要求73或74的方法，其中所述化合物为雷帕霉素或其类 似物。
77. 根据权利要求73或74的方法，其中所述化合物为法尼基转移酶抑 制剂。
78. 根据权利要求73或74的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂为 FTI-277。
79. 根据权利要求74的方法，其中所述组合物进一步含有有效量的11-顺式-视黄醇或9H顿式-视黄醇。
80. —种用于治疗视网膜色素变性或年龄相关性黄斑变性的医药组合物，包括于医药可接受的赋型剂中的有效量的11-顺式-视黄醇或 9-顺式-视黄醇以及有效量的自体吞噬抑制剂。
81. 根据权利要求80的方法，其中所述化合物为雷帕霉素或其类似物。
82. 根据权利要求80的方法，其中所述化合物为法尼基转移酶抑制剂。
83. 根据权利要求82的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂为FTI-277。
84. —种用于治疗眼部PCD的试剂盒，所述试剂盒包括有效量的11-顺 式-视黄醇或9-顺式-视黄醇以及有效量的雷帕霉素或其类似物。
85. —种用于治疗视网膜色素变性或年龄相关性黄斑变性的试剂盒，所 述试剂盒包括有效量的l卜顺式-视黄醇或9-顺式-视黄醇以及有效 量的雷帕霉素或其类似物。
86. —种鉴定有用于治疗PCD个体的化合物的方法，所述方法包括a) 于活体外表达错误折叠蛋白质的细胞接触候选化合物；以及b) 相对于对照细胞决定所述细胞中自体吞噬的增加，其中于经接 触细胞自体吞噬的增加鉴定化合物有用于治疗患有PCD的个体。
87. —种鉴定有用于治疗患有视网膜色素变性或年龄相关性黄斑变性 个体的化合物的方法，所述方法包括a) 于活体外表达错误折叠蛋白质的细胞接触 i. 11-顺式-视黄醇或9-顺式-视黄醇；与ii. 候选化合物；以及b) 相对于对照细胞决定所述细胞中自体吞噬的增加，其中于经接 触细胞自体吞噬的增加鉴定化合物有用于治疗患有视网膜色素 变性的个体。
88. 根据权利要求87的方法，其中所述11-顺式-视黄醇为l卜顺式-视黄醇的7-环锁异构物。
89. —种鉴定有用于治疗患有囊胞性纤维症个体的化合物的方法，所述 方法包括a) 于活体外表达错误折叠蛋白质的细胞接触候选化合物；以及b) 相对于对照细胞决定所述细胞中自体吞噬的增加，其中于经接触细胞自体吞噬的增加鉴定化合物有用于治疗患有囊胞性纤维 症的个体。
90. 根据权利要求86至89的任一项的方法，其中所述错误折叠蛋白质 包括突变。
91. 根据权利要求86至89的任一项的方法，其中所述突变在视蛋白中。
92. 根据权利86至89的任一项的方法，其中所述视蛋白包括P23H突 变。
93. 根据权利86至89的任一项的方法，其中所述自体吞噬增强为通过 监控蛋白浓度而测定。
94. 根据权利86至89的任一项的方法，其中所述自体吞噬增强为通过 由监控自体吞噬标记的表达而测定。
95. 根据权利86至89的任一项的方法，其中所述自体吞噬增强为通过 监控自体吞噬液泡的数目而测定。
96. —种用于个体预防或治疗蛋白质构象紊乱症(PCD)的方法，所述的 方法包括对所述的个体给药有效量的增强雷帕霉素或FTI-277生物 活性的化合物。
97. 根据权利要求96的方法，其中所述化合物与雷帕霉素或其类似物 合并给药。
98. 根据权利要求96的方法，其中所述化合物与FTI-277或其类似物 合并给药。
99. 根据权利要求96的方法，其中所述PCD选自下述所成组群a 1-抗胰蛋白酶缺乏症、囊胞性纤维症、亨延顿氏舞蹈症、帕金森氏病、 阿耳茨海默氏病、肾性尿崩症、癌症及库贾氏症。
100. 根据权利要求96的方法，其中所述PCD为囊胞性纤维症。
101. 根据权利要求96的方法，其中所述PCD为眼睛的PCD且选自下述 所成组群视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、青光眼、角 膜营养不良、视网膜劈裂症、斯塔尔加特病、常染色体显性遗传 脉络膜小疣及贝斯特氏黄斑营养不良。
102. 根据权利要求96的方法，其中所述PCD为视网膜色素变性或年龄 相关性黄斑变性。
103. 根据权利要求96的方法，其中所述方法进一步包括对个体给药11-顺式-视黄醇、9H顿式-视黄醇或11-顺式-视黄醇的7-环锁异构物。
104. —种用于个体预防或治疗视网膜色素变性的方法，所述的方法包 括a) 对所述的个体给药雷帕霉素和增强雷帕霉素生物活性的化合 物；与b) 给药11-顺式-视黄醇或9-顺式-视黄醇，其中所述的11-顺式-视黄醇或9-顺式-视黄醇与化合物对所述体为同时或彼此于14 日内给药足量以治疗或预防个体的视网膜色素变性。
105. —种用于个体预防或治疗蛋白质构象紊乱症(PCD)的方法，所述的 方法包括合并给药雷帕霉素或其类似物与增强雷帕霉素生物活性的化合物，其中所述雷帕霉素及化合物各给药足量以治疗或预防 个体的PCD。
106. —种用于增强细胞中错误折叠蛋白质降解的方法，所述的方法包 括使细胞接触有效量的雷帕霉素或其类似物与增强雷帕霉素生物 活性的化合物，其中所述雷帕霉素及化合物各给药足量以增强该 蛋白的降解。
107. 根据权利要求106的方法，其中所述细胞为眼部细胞。
108. 根据权利要求106的方法，其中所述方法进一步包括使细胞接触 ll-顺式-视黄醇、9-顺式-视黄醇或11-顺式-视黄醇的7-环锁异 构物。
109. —种用于治疗眼部PCD的医药组合物，包括于医药可接受赋形剂 中的雷帕霉素或其类似物与增强雷帕霉素生物活性的化合物，其 中所述雷帕霉素及化合物各呈现足量以治疗或预防个体的PCD。
110. —种鉴定有用于治疗PCD个体的化合物的方法，所述方法包括a) 在自体吞噬增强剂的存在或不存在下，使活体外表达错误折叠 蛋白质的细胞接触候选化合物；以及b) 相对于对照细胞决定所述细胞中自体吞噬的增加，其中于经接 触细胞自体吞噬的增加鉴定化合物有用于治疗患有PCD的个 体。
111. —种鉴定有用于治疗患有视网膜色素变性的个体的化合物的方 法，所述方法包括a) 使活体外表达错误折叠蛋白质的细胞接触i. 11-顺式-视黄醇或9-顺式-视黄醇与雷帕霉素；与ii. 候选化合物；以及b) 相对于对照细胞决定所述细胞中自体吞噬的增加，其中于经接触细胞自体吞噬的增加鉴定化合物有用于治疗患有视网膜色 素变性的个体。
112.—种鉴定有用于治疗患有囊胞性纤维症的个体的化合物的方法， 所述方法包括a) 使活体外表达错误折叠CFTR蛋白的细胞接触候选化合物与雷帕 霉素；以及b) 相对于对照细胞决定所述细胞中自体吞噬的增加，其中于经接 触细胞自体吞噬的增加鉴定化合物有用于治疗患有囊胞性纤维 症的个体。
全文摘要
本发明的特征为组合物与方法，该组合物与方法有用于治疗或预防藉由增强体内错误折叠蛋白质的降解于个体的蛋白质构象疾病。
文档编号A01N43/62GK101287370SQ200680023254
公开日2008年10月15日 申请日期2006年4月27日 优先权日2005年4月27日
发明者R·马尔霍特拉, S·考沙尔, W·A·邓恩 申请人:佛罗里达大学研究基金会有限公司